Sviluppi della Chimica dei Metalli di Transizione Radioemittenti per la

diagnosi e la terapia nella Medicina Nucleare

Dr. Asti MattiaServizio di Medicina NucleareArcispedale Santa Maria Nuova RE

Parma 20 Maggio 2004

• CHE COS’E’: branca specialistica che si avvale dell’uso di radionuclidi artificiali in forma non sigillata a scopo diagnostico, terapeutico e di ricerca biomedica.

• Da soli o legati a molecole vettrici i radionuclidi vengono introdotti nell’organismo sotto forma di soluzioni, sospensioni, aerosol; si comportano come traccianti funzionali (permettendo studi diagnostici in “vivo”) oppure si concentrano in tessuti patologici permettendone il riconoscimento.

• Le immagini medico-nucleari vengono ottenute tramite la rilevazione di fotoni emessi dai radiofarmaci metabolizzati dall’organismo e accumulati nei punti di interesse.

• E’ quindi il paziente che emette raggi gamma: tale emissione viene registrata da apposite apparecchiature i tomografi SPECT e PET in grado poi di ricostruire la corrispondente immagine.

LA MEDICINA NUCLEARE

LA TERAPIA RADIOMETABOLICA

• CHE COS’E’: è la branca della Medicina Nucleare che si occupa della cura dei tessuti tumorali .

• Ancora una volta il ruolo terapeutico viene svolto dalle radiazioni prodotte da radionuclidi che grazie a specifiche molecole trasportatrici si accumulano selettivamente nelle zone di interesse.

• Grazie a questi radiofarmaci è possibile irradiare selettivamente (a livello molecolare) solo i tessuti realmente interessati per danneggiare le cellule malate.

• I radionuclidi utilizzati per la terapia sono in genere degli emettitori di elettroni (metalli di transizione) in quanto queste particelle hanno una energia sufficiente per causare la morte cellulare.

• Se oltre ad emettere elettroni, questi radionuclidi emettono anche positroni o raggi , diagnostica e terapia possono essere combinate.

IL RADIOFARMACOUn radiofarmaco è in genere formato da un atomo radioattivo e da una molecole trasportatrice che è responsabile della sua farmacocinetica.

Se però ci focalizziamo nell’ambito della terapia, i radionuclidi maggiormente utilizzati sono metalli, per questo motivo, la chimica preponderante è quella di coordinazione.

Un radiofarmaco per la terapia può essere pertanto formato dall’utilizzo di fino a 3 componenti .

• Il radionuclide (metallo)

• Il legante (a cui può essere associato un connettore)

• La parte biologicamente attiva

A seconda del radiometallo e del legante si possono presentare diverse tipologie di Radiofarmaci

• Se il legante è già una specie biologicamente attiva (es. Tecneziati, marcatori di ipossia…)

• Legame diretto metallo – molecola bioattiva

• Tutte e tre le componenti con la presenza di un connettore tra la molecola bioattiva e il legante

MOLECOLE BIOLOGICAMENTE ATTIVELa tendenza attuale è di utilizzare petdidi che grazie al loro basso peso molecolare e la possibilità di legarsi a recettori specifici delle cellule hanno superato le applicazioni degli anticorpi monoclonali in medicina nucleare.

In particolare la somatostatina ha dimostrato avere alta affinità per alcuni recettori espressi sulla membrana di alcune cellule tumorali (ss1-sst5)

Somatostatin-14 Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys

Purtroppo la somatostatina ha dimostrato avere un tempo di emivita biologica molto breve (16 min.) ed è stato quindi necessario sintetizzare degli analoghi contenenti i residui AA dal 7 – 11 che sembrano essere quelli essenziali per il legame.

Questi derivati sono in genere sequenze di 8 amminoacidi (Octreotide) con un N-terminale D-Phe e un ammino alcohol Thr(ol) al C-terminale per proteggerlo dalla degradazione ad opera delle proteasi.

Somatostatin-14 Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys

Octreotide D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol)

Lanreotide b-D-NaI-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2

Tyr3-octreotide (TOC) D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol)

RC-160 D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2

Tyr3-octreotate (TATE) D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr

Mentre la somatostatina si lega a tutti e 5 i recettori con alta affinità gli analoghi stabilizzati hanno diverse affinità per ognuno di essi.

Inoltre per esplicare la loro funzione questi derivati devono essere collegati ad un legante per il radiometallo. In genere questo collegamento viene ottenuto formando un legame peptidico tra l’ N-AA terminale e un gruppo carbossilico del legante (connettore) .

Legante-------COOH H2N-----peptide

Legante------C(O)-HN----Peptide

La affinità con i recettori non dipende solo dal derivato ma anche e notevolmente dal radiometallo e dal legante stesso.

Le strategie con cui vengono collegate le varie parti (peptide-legante –metallo) o (peptide-metallo) o (legante- metallo) verranno discusse in seguito.

I LEGANTISono stati messi a punto una vasta serie di leganti ognuno presenta diverse affinitàcon i radiometalli (alcuni sono specifici), alcuni hanno essi stessi una attivitàbiologica, alcuni hanno un utilizzo in campo specifico (ipossia).

Leganti Monodentati:

N

O

NH2

NNH2

H

HYNIC

Idrazinonicotinammide e un legante monodentato bifunzionale, in combinazione con leganti ancillari è in grado di formare complessi stabili con il Tc.

Leganti polidentati:

Oltre ai leganti tetradentati contenenti azoto e zolfo come atomi coordinati

Esistono due famiglie principali di leganti polidentati :La prima è quella dei leganti derivati dagli acidi PolicarbossiliciLa seconda è quella dei leganti derivati dai composti tetrazamacrociclici

N N

SHSH

N N

SHNH2

NH NH

NH2NH2

N N N

COOH COOH COOH COOH

COOHN N

NN

COOH

COOH

HOOC

HOOCDTPA

DOTA

La struttura del DTPA permette di avvolgere il radiometallo all’interno di una gabbia generata dalla coordinazione degli atomi di ossigeno.

Ma prima della complessazione e necessaria la reazione di uno dei gruppi carbossilici con un gruppo amminico della molecola biologicamente attiva.Entrambe le molecole, avendo più di un sito reattivo devono essere protette nelle posizioni desiderate.

NN N

COOtBu

BuOtOC

HOOC COOtBu

COOtBu

ONN

N

COOH

O

O

O

O

O

DTPA Dianhydride

Tetra-t-butyl-DTPA

Nei leganti della seconda famiglia il radiometallo viene complessato da 4 atomi di azoto e bloccato nella cavità del macrociclo.La stabilità del complesso dipende fortemente dal raggio dello ione metallico per questo motivo sono stati sintetizzati diversi macrocicli.

COOH

N

N N

N COOH

HOOC

HOOC

TETA

NH

NH N

NH

COOH

Cyclam methylbenzoic acid

NN

NN COOHHOOC

HOOC COOH

DOTA

Leganti per l’ipossia:

Molti tessuti tumorali presentano cellule ipossiche che sono almeno 3 volte piùresistenti alla terapia delle cellule tumorali normali. Mediante opportuni radiofarmaci e possibile individuare queste zone e irradiarle selettivamente.

Questi leganti sono divisi in due categorie:

Leganti derivati dai tiosemicarbazoniLeganti contenenti il gruppo azomicinico

N

NH N

NH

(CH2)3

(CH2)3

NN

NO2

N N

NO2

FC - 327

SH

NN

CH3CH3

NHCH3 SH

NN

NHCH3

ATMS

IL RADIONUCLIDEMolti fattori influenzano la scelta del radionuclide per la terapia: tra questi ci sono le proprietà fisiche (tipo di decadimento, energia delle particelle/fotoni emessi, T½), la forma e la reattività chimica, la purezza e la disponibilità.

Radionuclide Half life Type of Decay Particles Energies (Mev) Gamma Energies (KeV)

64 Cu 12.8 h - 0.57 (40%) + 0.65 (19%) 511

EC (41%) 1346

90 Y 64.8 h - 2.3 (100%)

99m Tc 6 h - (87%) 140(13%) 142

111 In 67.2 h EC 100% 171

177 Lu 6.7 d - 0.176 (7%) 1100.384 (3%) 2100.498 (90%)

188 Re 16.7 h - 1.96 (20%) 1552.12 (80%)

RADIOFARMACI MARCATI90Y 111In 177Lu

L’ 90Y è il radionuclide più comunemente usato nella moderna terapia basata sui recettori della somatostatina. Mentre i suoi complessi con il DTPA non sono sufficientemente stabili in vivo, quelli con i macrocicli ed in particolare il DOTAformano molecole ottimali per la terapia.

Il DOTA viene preventivamente legato al peptide (TOC, TATE) via fase solida facendo reagire DOTA (tBu)3 e il TOC(TATE) protetto.

N N

NN

COOH

COtBuBuOtC

BuOtCHN - Tyr3 – Octreotide ( TOC)

HN - Tyr3 - Octreotate (TATE)+

DOTATOC

DOTATATE

La marcatura avviene partendo dai cloruri dei radiometalli quando il legame DOTA (legante) – TOC(peptide) è gia formato. Si utilizza un ambiente tamponato a pH 5 scaldando a 90-100°C per ca.30min (resa 98-100 %)

Siccome l’ 90Y è un emettitore - puro, normalmente si associano i complessi di 90Y agli analoghi di 111In in modo da studiare la distribuzione del radiofarmacoattraverso una scintigrafia

N N

NN

CONH - TOC

COOHHOOC

HOOC

+ 90YCl3Acido gentisico (pH 5)

90 °C 2 h

Y90

NN

NN

CONH - TOC

COOHHOOC

HOOC

90Y DOTATOC

Sebbene l’ 111In venga accoppiato all’ 90Y nella terapia e legato al DOTATOC, presenta la maggiore stabilità e affinità ai recettori della somatostatina con leganti tipo DTPA.

Il 177Lu presenta un notevole interesse in quanto è un emettitore beta/gamma ed è stato dimostrato che l’affinità del complesso 177Lu DOTATATE con il recettore sst2 aumenta di 6-7 volte rispetto a quella del analogo marcato 90Y.

90-Y 177-Lu

Half life 64 h (2.6 d) 6.64 d Emission pure - emitter -, emitterE max 2.27 MeV 0.5 MeVRange 11 mm 2 mmChemical form 90YCl3

177LuCl3Main Emission 160 e 120 KeV

Il problema con 177Lu è che i prodotti commerciali attualmente disponibili presentano ancora una notevole quantità di impurezze che va ad influire sulla marcatura.

RADIOFARMACI MARCATI99mTc 188Re

Nonostante il 99mTc sia il nuclide maggiormente usato nella medicina nucleare tradizionale, c’è molto interesse a livello di ricerca nella marcatura dei peptidi con questo radiometallo.

Strategie di legame:

Metodo indiretto con complesso post-formato:

s

sNH2

BifunctionalChelatingAgent (BFC)

s

sNH

s

sNH

Con questo metodo il legante per il Tecnezio maggiormente studiato è l’HYNIC in grado di formare con leganti ancillari un Nitruro complesso molto stabile.

N

O

N

NNH2

H

H

Peptide

N

N

Tc

NOH

Peptide

O

N

O

N

O

H

O

HX

Tc

N

N

NOH

Peptide

O

N

O

H

OOH

O

COOH

Metodo indiretto con complesso preformato:

s

sNH2

s

sNH

Metodo Diretto:

s

sNH2

Hs

HsNH2

s

sNH2

Legame Diretto con metodo del frammento metallico:

Tc

CO

OH2

CO

OH2H2O

OC

+

La formazione del frammento stabilizza i bassi numeri di ox. del Tecnezio, inoltre due o tre posizioni di coordinazione sono occupati da leganti labili che possono essere sostituiti da opportune molecole.

L

LNH2

L

LNH2

X

Tc

CO

Cl

Cl

NP

P

R

R R

R

N

N

Tc

CO

N

O

CO

OCO

Peptide

O

In particolare il frammento tricarbonilico presenta particolare affinità per il leganti tri o bidentati con atomi di N legante. Ad esempio l’AA istidina.

Mentre il frammento nitrurico data la sua alta elettrofilicità si lega fortemente a leganti bidentati contenenti atomi di zolfo e di Ossigeno/azoto

R

X

Tc

CO

S

O

NP

P

R

R R

NR

O

Il 188Re è stato recentemente portato all’attenzione della comunità di medicina nucleare per le sue interessanti caratteristiche.

99m-Tc 188-Re

Half life 6 h 16.7 h Emission pure emitter -, emitterE max 2.1 MeVChemical form 99mTcO4

- 188ReO4-

Main Emission 142 Kev 155 KeV

Ma sebbene esistano molte somiglianze dal punto di vista chimico è impossibile marcare con il Re i farmaci utilizzati con il Tc, con il metodo tradizionale in quanto la riduzione del perennato è molto più difficile di quella del pertecnectato.

2 TcO4- + 3 Sn2+ 2 TcO2+ (IV) + 3 SnO2

2 ReO4- + 3 Sn2+ X

E’ stata provata perciò una nuova strategia per risolvere questo problema che si basa sul principio della “espansione della sfera di coordinazione”.

Re

O

OO

O Re

O

OHO

OHO

OO

O

Re

L

LL

L

LL

-

OssalateSn 2+

Reduction

Questo metodo ha dato buoni risultati aumentando notevolmente la resa di marcatura

RADIOFARMACI MARCATI64Cu

Il 64Cu ha dimostrato avere la maggiore stabilità nei complessi con il TETA e i Cyclams ma sebbena la marcatura dei peptidi con questo radiometallo sia in via di studio l’ interesse maggiore è nello sviluppo di farmaci marcatori di ipossia.

Esistono due metodi per creare radiofarmaci marcatori di ipossia.

Il primo si basa sulle proprietà ossidoriduttive del radiometallo con leganti tiosemicarbazonici

S

NN

NHCH3S

NN

CH3CH3

NHCH3

Cu

Cu (ATMS)

Sono stati preparati ciclams particolari contenenti questo gruppo e in seguito marcati con 64Cu.

NN

NO2

LL NN

NO2 - *

LL

NNL

L

NO

NNL

L

NH2

+ e-

NitroreductaseEnzymes

+ e-

+ 4e-

Coovalent binding

to macromolecules

+ O2

O2-*

H2O2 OH-

2) Il secondo si basa sulla attività biologica del gruppo azomicinico.

NN

NO2

N N

NO2

Cu

N N

N N(CH2)3

(CH2)3

I primi studi su animali di questi nuovi marcatori dell’ipossia sta dando risultati incoraggianti.