Nuovi metodi di analisi negli studiNuovi metodi di analisi negli studi sul DNA antico

David CaramelliDipartimento di Biologia Evoluzionistica Laboratori di Antropologia Unità di Antropologia Molecolare /Paleogenetica Università di FirenzeUnità di Antropologia Molecolare /Paleogenetica, Università di Firenzedavid.caramelli@unifi.it

Piacenza 2012

sviluppare un percorso che va dalsviluppare un percorso che va dalrecupero del reperto aglip p gesperimenti in laboratorio ell’i t t i i d i d tiall’interpretazioni dei dati

Il recuperoIl recupero

InIn l b ilaboratorio

WO K LOWWORK FLOW

++

2005

Illumina GA2 ~108 fragments per run

2004

2010

454 GS20~105 fragments per run

ABI 3730~102 fragments per run

PRIMER HPRIMER L PRIMER H

O i t li il DNA dOvviamente analizzare il DNA da reperti antichi  non è facile a causa 

della degradazione del DNA

Che cosa è il DNA antico

Nel mezzo del cammin di nostra vitami ritrovai per una selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah

Nel ------------------------------------------------------------------------------selva oscura ché la diritta via era smarrita

quanto a dir qual era è cosa dura esta selva selvaggia e aspra e forte che nel pensier rinova la paura! Tant'è amara che poco è più morte;

Ah quanto a dir qual era è cosa - ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Tant è amara che poco è più morte;

ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte. Io non so ben ridir com'i' v'intrai,

-----------------------------------------------------------------è più morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte. ------------

tant'era pien di sonno a quel punto che la verace via abbandonai.

------------------------------------------------------che la verace via abbandonai.

DNA moderno DNA   antico

Nel mezzo del cammin di nostra vitami ritrovai per una selva oscura ché la mi ritrovai per una selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah quanto a dir qual era è cosa dura esta selva selvaggia e aspra e forte che nel pensierrinova la paura! Tant'è amara che poco è iù d l b h'i' è più morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte Io non so ben ridir com'i' scorte. Io non so ben ridir com i v'intrai, tant'era pien di sonno a quel punto che la verace via abbandonai.p

Nel ------------------------------------------------------------------------------selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah quanto a dir qual era è cosa - --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

è più ---------------------------------------------è più morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho v , vscorte. ------------------------------------------------------------------che la verace via abbandonai.

Nel ------------------------------------------------------------------------------selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah quanto a dir qual era è cosa - --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

è più ---------------------------------------------è più morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho v , vscorte. ------------------------------------------------------------------che la verace via abbandonai.

l I i h ' h I ' ifNel - Imagine there's no heaven It's easy if you try No hell below us Above us only sky Imagine all the people Living for today, Imagine all the people Living for today... --

------------------------------selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah quanto a dir qual era è cosa A q q- ولو ترى اذ المجرمون * ثم الى ربكم ترجعون

عند ربھم ربنا ابصرنا وسـمعنا رؤوسھم è più morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte. Respiri piano per non far rumore ti addormenti di seranon far rumore ti addormenti di sera ti risvegli con il sole sei chiara come un'alba sei fresca come l'ariaun alba sei fresca come l aria___________ 

che la verace via abbandonai.

l I i h ' h I ' ifNel - Imagine there's no heaven It's easy if you try No hell below us Above us only sky Imagine all the people Living for today, Imagine all the people Living for today... --

------------------------------selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah quanto a dir qual era è cosa A q q- ولو ترى اذ المجرمون * ثم الى ربكم ترجعون

عند ربھم ربنا ابصرنا وسـمعنا رؤوسھم è più morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte. Respiri piano per non far rumore ti addormenti di seranon far rumore ti addormenti di sera ti risvegli con il sole sei chiara come un'alba sei fresca come l'ariaun alba sei fresca come l aria___________ 

che la verace via abbandonai.

l I i h ' h I ' ifNel - Imagine there's no heaven It's easy if you try No hell below us Above us only sky Imagine all the people Living for today, Imagine all the people Living for today... --

------------------------------selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah quanto a dir qual era è cosa A q q- ولو ترى اذ المجرمون * ثم الى ربكم ترجعون

عند ربھم ربنا ابصرنا وسـمعنا رؤوسھم è più morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte. Respiri piano per non far rumore ti addormenti di seranon far rumore ti addormenti di sera ti risvegli con il sole sei chiara come un'alba sei fresca come l'ariaun alba sei fresca come l aria___________ 

che la verace via abbandonai.

l I i h ' h I ' ifNel - Imagine there's no heaven It's easy if you try No hell below us Above us only sky Imagine all the people Living for today, Imagine all the people Living for today... --

------------------------------selva oscura ché la diritta via era smarrita Ah quanto a dir qual era è cosa A q q- ولو ترى اذ المجرمون * ثم الى ربكم ترجعون

عند ربھم ربنا ابصرنا وسـمعنا رؤوسھم è più morte; ma per trattar del ben ch'i' vi trovai, dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte. Respiri piano per non far rumore ti addormenti di seranon far rumore ti addormenti di sera ti risvegli con il sole sei chiara come un'alba sei fresca come l'ariaun alba sei fresca come l aria___________ 

che la verace via abbandonai.

Quindi è molto complicato studiare il DNA antico ma non impossibile !DNA antico ma non impossibile !

Qualità del materiale biologico di partenzapartenza

Problema delle contaminazioni cheProblema delle contaminazioni che possono  portare a dei falsi risultati

Ancient DNA lab

Classical approach:

PCR, Cloning,  and sequencing

Classical approach:

PCR, Cloning,  and sequencing

Limits: 

Ancient Human DNA

Only a maximum of several thousand base pairs

A big amount of fossil material in the DNA  extraction

Humans : a lot of problems if the sample is not directlyexcavated and if we don’t known the taphonomic history

How to work with the classical approach

Homo sapiens  Neandertal

Taphonomic TaphonomicTaphonomichistory

Taphonomic history

Loci Loci

Sequences

Loci

mtDNA nDNAmtDNA, nDNA

Sequences comparing 

Sequencescomparing

Recovering ancestral alleles

Ok  Ok? 

Ok ?Ok ?

I d iI dati e le analisile analisi

1

0

H. erectus

H. antecessor

H. heidelbergensis

H. neanderthalensis

H. sapiensH. floresiensis 100.000 ybp

2

1P. robustus

P. boisei

Au. habilis Au. rudolfensis 

H. ergaster 

H. antecessor 

Au. garhi 

K. platyops 4

3

Au. afarensis

Au. bahrelghazali

Au. africanus 

P. aethiopicus 

4Ar. ramidus 

Au. anamensis 

5 Ar. kadabba 

Pre-modern HomoAnatomically modern Homounknown

6

7

O. tugenensis Transitional hominins

Archaic homininsMegadont archaic hominins

7

8

S. tchadensis Archaic homininsPossible and probable early hominins

Millions of Years Ago

Homo floresiensis

Homo sapiens Homo neandertalensis

Homo erectus

Homo heidelbergensis

Homo floresiensisHomo heidelbergensis

Homo erectus

Homo sapiens Homo neandertalensis

Desinova

Tanto  interesse nei confronti dei Neandertaliani

Interazioni con Homo sapiens: culturali genetiche

Il  loro scheletro 

THE NEANDERTAL WORLD (250,000 ‐ 28,000 YBP)

DOVE VIVEVANO

Ma chi erano i Neandertal ?

Parlavano come noi?

Fisicamente come erano?

NGS (NEW GENERATION SEQUENICING)(NEW GENERATION SEQUENICING)

REVOLUTIONSREVOLUTIONS

A B

NGS approach

Classicalapproach

++

2005

Illumina GA2 ~108 fragments per run10 fragments per run

454 GS20

2010

~105 fragments per run

dDouble – stranded aDNA

Library MeltingsstDNA recoveryAdapters 

ligation

A B

Libraryimmobilization

Melting 

3’5’

3’5’

recovery

5’‐Biotin

Capture Beads

BA3’5’

sstDNA

Capture

Amplification primer

sstDNA Quantitation

Em lsion PCRPTP Bead Deposition

Pyrosequencing

Emulsion PCR

Beads Recovery and CountEnrichment 

and priming

454/Roche NGS procedure

Double – stranded aDNA

Adaptor ligation Bridge gamplification

DNA polymerase

Surface immobilization

Cluster generation

g tc

ag

t

c

agt

a

c CTRsequencing generationa

c ta

sequencing

Illumina sample procedure

Improvement of NGS work flowImprovement of NGS work flow

MIS CODING LESION MIS CODING LESION

Primer extension capture

Discarded aspecific f tStarting DNA fragments

SeqCapMicroarray

Washing

NGS library preparation  Hybridization

elution

Enriched library

NGS work flow

library

Figure 4. Nimblegen sequence capture workflow 

Figure 5. Agilent SureSelect sequence capture workflow 

Possibile mescolamento 

DENISOVA

Homo sapiens Homo neandertalensis

Desinova

Thi d G ti S i

Company Name TGS sequencing chemistry

Third Generation Sequencers, an overview

Co pa y a e GS seque c g c e st y

Helicos Genetic Analysis Platform Virtual Terminator nucleotides

A h d DNA l Z dPacific Biosciences Anchored DNA polymerase+Zero-mode waveguide (ZMW)

VisiGen Biotechnologies Modified DNA polymerase + Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)g Resonance Energy Transfer (FRET)

• Halcyon Molecular• ZS Genetics Transmission Electron Microscopy (TEM)

difi d h l i +Oxford Nanopore

modified α-hemolysin pore +Measure of Ionic current

www.ancientdna.it