Spettroscopia Strutturale

Sommario❖Cristallografia a raggi X

๏Principi delle tecniche diffrattive๏Diffrazione di raggi X su cristalli๏Diffrazione di raggi X su fibra๏Diffrazione di raggi X da soluzioni diluite a largo angolo๏Cenni alla diffrazione di neutroni๏Il Protein Data Bank

❖Cenni a software per visualizzazione di strutture ❖(Crio) microscopia elettronica (e database di mappe elettroniche a bassa risoluzione)❖NRM strutturale

Materiale didattico scaricabile dahttp://homepage.sns.it/tozzini/didattica.html

Spettroscopia Strutturale

Relazione tra energie dei fotoni (in eV) e lunghezze d’onda associate (nm) E=1240/λ Ad esempio: λ=~1Å E~12 keV

Limite radiazione ionizzante13.6 eV, energia di legame del’elettrone dell’atomo di idrogeno

Spettro della radiazione EM

1 102 104 10610-210-410-6

Energy (Kcal/mol)

102 104 106 108 1 10-210-4

Frequency (cm-1)

500 keV

Spettroscopia Strutturale

E =m0c2

�1− v2

c2

λ =h

m0v

�1− v2

c2

Spettroscopia Strutturale

La spettroscopia diffrattiva può essere effettuata in linea di principio con qualsiasi tipo di “sonda” ondulatoria, purché che siano verificate le seguenti condizioni

❖Sufficiente interazione (sezione d’urto) tra (s)onda e “oggetto” da osservare๏Radiazione elettromagnetica (raggi X) → nubi elettroniche delle molecole๏Fasci di neutroni → nuclei๏Fasci di elettroni → nubi elettroniche

❖Lunghezza d’onda della sonda dell’ordine della risoluzione voluta ❖Radiazione EM: λ=c/ν =1240/E 1Å~12kEv❖Neutroni, elettroni:

p=h/λ E=hν

E(λ)

Neutroni “relativamente” lenti possono già dare alte risoluzioniPerò i neutroni sono difficili da trattare

Spettroscopia Strutturale Cristallografia a raggi X La spettroscopia diffrattiva è basata sul principio di diffrazione di Bragg. Nel caso dei raggi X:❖La radiazione incide su un cristallo e viene diffusa elasticamente dagli elettroni in tutte le direzioni

❖La radiazione diffusa dal reticolo periodico interferisce costruttivamente solo in determinate direzioni, quando si verifica la condizione

❖Un reticolo cristallino è identificato da un insieme infinito di vettori Rj, distanziati di d, chiamati vettori del reticolo diretto

❖La relazione (legge di Bragg) si può scrivere come ei K R = 1 ovvero Ki Rj=2nπ dove Ki=|k0-k| =(2π/λ)2sinθ Ki =vettore di diffusione

❖Ma la stessa relazione definisce un altro reticolo di vettori Ki chiamato reticolo reciproco⇒Un cristallo dà interferenza costruttiva quando il vettore di diffusione coincide con un vettore del reticolo reciproco

k0 k|k|= 2π/λ

K

2d sin θ = λn

2d sin θ = λn

Spettroscopia Strutturale

Intensità di scattering

Ampiezza di scattering

I(θ)=|F(θ)|2 K=2|sin(θ)| (2π/λ) → F(θ) ~ FK Fattore di forma

La misura fornisce il fattore di formaDal fattore di forma si calcola la densità elettronica spaziale. Come?

Sorgente

campione

Rivelatore

2θ K

F (k) =�

dr(2π)3

f(r)e−ikr = 1

FT [ρ] =

=�

i

F (k)e−ikr =�

i

e−ikr =�

j

δk,Kj = FKj

Spettroscopia StrutturaleConsideriamo un cristallo di particelle su un reticolo (unidimensionale). La densità elettronica si descrive tramite la formuladove la seconda eguaglianza vale se le particelle sono esattamentelocalizzate

ei Ki Rj =1 Ki Rj=2nπ ab= 2π

Ri Ri+1Ri-1Reticolo diretto

Reticolo reciprocoKj Kj+1

a

b

(Per un cristallo 3D, tutte le relazioni valgono in forma vettoriale)

Definiamo F(k) la trasformata di Fourier di f(r)(la seconda uguagliaza vale per particelle localizzate)da cui deriva, utilizzando le relazioni di Bragg, che la FT della densità totale è una somma di picchi localizzati sul reticolo reciproco, tutti uguali se le particelle sono localizzate

ρ(r) =�

i

f(r−Ri) =�

i

δ(r−Ri)

f(r) =�

Kj

FKjeiKjr

Spettroscopia Strutturale

Ma gli elettroni sono delocalizzati intorno ai siti reticolari,→ f(r) ~ gaussiana Ri

La FT di una densità di particelle localizzate su siti di un reticolo diretto è identicamente uguale alla somma di delta localizzate sui siti del reticlo reciprocoMa che collegamento c’è tra FK (fattore di forma misurato) e ? FK =

In pratica, per ogni fissato vettore di diffusione (cioè fissata la direzione di diffusione) viene selezionata una differenza di fase per la quale si ha interferenza costruttiva e quindi intensità diversa da zero. Quindi lo scanning sulla direzione di diffusione (θ o equivalentemente k) equivale a fare una trasformata di Fourier dei punti da cui proviene la radiazione diffusa

→ Il fattore di forma è proporzionale alla trasformata di Fourier della densità spaziale di carica elettronica

€

FK j

Kj

con F(k) ~ gaussiana

⇒Misurando FK, si ricava f(r) e quindi ρ(r) con una trasformata di Fourier inversa

FK FK

ρ(r) =�

i

f(r −Ri)

FT [ρ] = FKj =�

j

F (k)δk,Kj

f(r) =�

i

f i(r − ri)

Spettroscopia Strutturale

In un cristallo di proteine, in ogni cella (sito reticolare) si trova una proteina→f(r) = somma di densità elettroniche dovute ai singoli atomi

⇒ Il fattore di forma strutturale è la somma di fattori di forma atomici pesati con un fattore di fase dipendente dalla posizione dell’atomo all’interno della cella

⇒ Dalla misura di FK, noti (tabulati) i fattori di forma atomici, si ricavano le posizioni atomiche

In realtà quasi mai si procede alla trasformazione di Fourier per ricavare la f(r), ma piuttosto si parte da un modello di proteina che viene raffinato tramite iterazioni successive fino a che le FK sperimentale e calcolata dal modello coincidono

O

ClCl-

K+

Fattori di forma atomici fi(k=0) = = carica elettronica totale

FK =�

i

f iKeiKri

Spettroscopia Strutturale

Sorgente

campione

Rivelatore

2θ

MisurataFT della densitàelettronica

“Noti” e diversi per ogni tipo di atomo “pesante”

Posizioni degli atomi nella proteina, da determinare

Le posizioni atomiche si determinano e raffinano attraverso una procedura iterativa che utilizza modelli atomici. Come output si ottiene un modello risolto al livello atomico (o quasi) e una densità elettronica compatibili l’una con l’altro

RX= luce di sincrotrone

FK =�

i

f iKeiKri

Spettroscopia StrutturaleRisultati finali:❖Mappa elettronica e modello atomico della molecola a risoluzione di pochi Å❖La risoluzione dipende dalla purezza del cristallo e dalla temperatura: la posizione degli atomi è determinata entro le fluttuazioni termiche

Fattore di temperatura fattore di Debye-Waller

Problemi collegati alla tecnica1. La posizione degli atomi di H non è risolta perché questi non hanno sufficiente densità elettronica2. Le molecole vanno cristallizzate❖non tutte le molecole possono essere cristallizzate (ad es. le prot di membrana)❖le molecole cristallizzate hanno strutture “non naturali” e bloccate in una singola conformazione, dipendente dalle condizioni di cristallizzazione3. Problema dello scattering secondario dovuto all’interazione del fascio diffuso con ulteriori siti cristallini dopo il primo. Questo è un problema lieve con i raggi X che interagiscono debolmente con la materia, ma è un problema più grosso con gli elettroni4. Problema della fase: Il pattern di diffrazione in realtà fornisce solo il “modulo” del numero complesso F(k) (che si ricava dalla radice di I(θ)) con conseguente perdita di informazione. Se si adotta la procedura iterativa partendo da una struttura approssimata, questa perdita di informazione è compensata dalla conoscenza a priori sul sistema. Altrimenti, se si parte da zero, l’informazione sulla fase va recuperata con specifiche tecniche (sostituzione con “atomi pesanti”)

B =8π2

3�u2� fi(r) ∝ e−(r−ri)

2/2�u2�

Spettroscopia Strutturale

❖La posizione dei protoni può però essere risolta usando lo scattering di neutroni di opportune energie: i neutroni interagiscono con i nuclei atomici e la sezione d’urto di interazione con H è paragonabile a quella con C, N, O

❖I neutroni interagiscono tramite interazioni forti e i nuclei li vedono come oggetti praticamente puntiformi. Di conseguenza i fattori di forma sono piatti (indipendenti da k) e uguali al negativo di una costante, la lunghezza di scattering b, che è stata determinata sperimentalmente per tutti gli elementi/isotopi; il suo quadrato è circa proporzionale alla sezione d’urto di interazione con i neutroni. b ha anche una parte dipendente dallo spin nucleare

❖La lunghezza di scattering di H e D sono diverse, quindi si può rendere trasparente il solvente ai neutroni regolando le proporzioni relative di acqua pesante e leggera

❖Tuttavia la produzione di neutroni (per fissione o tramite urti di fasci di protoni su bersagli metallici) è piú difficile da controllare❖Il post processing è meno standard

thermal  neutrons~meV  of  KINETIC  energy

Cristallografia con neutroni

Spettroscopia Strutturale Tecniche rX per molecole non cristallizzate

Diffrazione da fibre cristalline: ❖Il campione è composto da microcristalli di fibre allungate allineate lungo l’asse, ma casualmente ruotati lungo l’asse. Questa è la forma tipica con cui si riesce a cristallizzare il DNA (Rosalind Franklin)❖Il pattern di diffrazione è mediato a causa della perdita di ordine rotazionale→proiezione 2D dello spazio reciproco 3D❖ è ancora possibile estrarre informazione sufficiente per determinare le posizioni atomiche soprattutto se c’è sufficiente conoscenza a priori sul sistema

Diffusione “ad angolo largo” da soluzioni diluite: È possibile ottenere informazioni anche da molecole in soluzione, raccogliendo idealmente il segnale diffusivo da singole molecole. In questo caso❖È necessario raccogliere radiazione diffusa su largo angolo perché il segnale è piú debole e piú sparso❖Data l’orientazione casuale delle molecole, il pattern di interferenza è 1D e formato dall’interferenza dalla “singola” molecola❖Il post processing dei dati è piú difficile, procede attraverso trasformate di Fourier con simmetria radiale e si ricavano solo dati a bassa risoluzione; è necessario partire da una struttura già parzialmente nota da ottimizzare…… Ma si possono osservare strutture naturali e cambiamenti conformazionali

Diffrazione da polveri micro-cristalline In questo caso l’orientazione varia nelle tre direzioni spaziali e quindi il pattern di diffrazione va mediato e proiettato su una singola direzione (pattern 1D, simmetrico per rotazione intorno all’asse del fascio incidente) Diffrazione a piccolo angolo, consente di avere dati con esposizone breve e quindi avere misure risolte in tempo. Si ottengono dati a bassissima risoluzione

Spettroscopia Strutturale Fotociclo della Rodopsina Batterica

La rodopsina batterica usa la luce per pompare protoni fuori dalla membrana cellulare

Misura dinamica XS ad angolo largo

Spettroscopia Strutturale

Protein Data Bank http://www.rcsb.org/: database di str proteiche e di acidi nucleici❖Liberamente accessibile❖Le strutture proteiche possono venire depositate da chiunque, ma passano attraverso un processo di revisione prima di essere “accettate”; all’accettazione viene assegnato un codice unico nXYZ che identificherà per sempre la struttura❖Le strutture vengono depositate in un formato standard (.pdb), leggibile da praticamente tutti i software di visualizzazione di biomolecole, e contenente le seguenti informazioni

๏Coordinate atomiche (+ fattori di temperatura, parametri cristallografici etc…)๏Dettagli sulla tecnica sperimentale o teorica usata๏Riferimento bibliografico completo๏Dettagli sulla sequenza, struttura secondaria e terziaria

La proteina GFP e dettagli della sua mappa elettronica capside di un virusProtein Data Bank

Spettroscopia Strutturale Esempio: 1GFL

La proteina verde fluorescente (GFP) è stata cristallizzata e risolta alla risoluzione di 1.9Å in forma dimerica nel 1996

Spettroscopia Strutturale Il formato pdb

…

coordinate B factor

Spettroscopia Strutturale Visualizzazione delle strutture: VMD

Molti software sono disponibili liberamente su rete per visualizzare e manipolare biomolecole Ad esempio VMD http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/

FK = F (k)�

j

δk,Kj = FT [f ]× FT [{R}]ρ(r) =

�

i

f(r −Ri)

ρ(r) = f(r)

Spettroscopia Strutturale Diffrattometria vs microscopia

RX (neutroni…)

cristallo di proteine

pattern di diffrazione

densità elettronicaTrasformata di Fourier inversa

Luce, elettroni …

“singola” proteina

Nella “microscopia…

ingrandimento

Invece dell’elaborazione alcalcolatore c’è un sistema di lenti che ricompone le componenti di Fourier in una immagine (ingrandita) in spazio reale→ le lenti operano la FT-1

F (k) = FT [f ]

Spettroscopia Strutturale (Crio-)microscopia elettronica

❖La microscopia elettronica è una tecnica microscopico-diffrattiva che utilizza gli elettroni come sonda anziché la luce (come la normale microscopia ottica)❖A differenza di un sistema puramente diffrattivo (come la cristallografia RX) un apparato microscopico implica la presenza di lenti per elettroni, che consistono in sistemi di bobine che generano campi em multipolari (quadri o esa-polari)❖Le energie (cinetiche) degli elettroni usate sono tipicamente ~100keV (aggiuntive rispetto a quella della massa a riposo = 500keV), per risoluzioni intorno all’Å

Spettroscopia Strutturale (Crio-)microscopia elettronica❖Le due principali configurazioni operative sono TEM (Transmission electron microscopy) e SEM (Scanning Electron microscopy)❖Nel TEM si usano campioni sottili e si raccolgono gli elettroni trasmessi. Il contrasto nel modus operandi piú comune (Bright Field) dipende dalla differenza di assorbimento degli elettroni nelle varie porzioni del campione. Immagini tomografiche si ottengono facendo diverse proiezioni e combinandole. Altri modi operativi sfruttano interazioni complesse degli elettroni con la materia (Electron Energy Loss EEL), il contrasto di fase tra elettroni non diffusi e diffusi da diversi

punti del campione), per arrivare alla diffrazione (per campioni cristallizzati)analoga alla diffrazione RX La risoluzione è una combinazione del limite di diffrazione con l’apparato, e può arrivare all’ordine dell’Å (contrasto di fase)❖Nel SEM si raccoglie la radiazione diffusa dalla superficie del campione sondato con un fascio sottile in configurazione di scanning. La risoluzione finale è minore e dipendente dal diametro del fascio❖I due modi si possono combinare (STEM)❖Entrambi soffrono di problemi legati ad interazioni inelastiche degli elettroni, produzione di fotoni secondari…

Spettroscopia Strutturale❖Gli elettroni interagiscono con la densità elettronica della molecola bersaglio; siccome sono facilmente assorbiti (anche dall’aria), il campione va tenuto sotto vuoto❖Alle energie minime necessarie per raggiungere una risoluzione adeguata gli elettroni sono già dannosi per i campioni biologici. Per questo motivo e per aumentare il contrasto e la stabilità i campioni sono talvolta ricoperti da film metallici sottili, o trattati con specifiche sostanze per aumentare il contrasto. Però cosí si altera la loro struttura❖Alternativamente, si usano energie minori e campioni idratati, ma a temperatura criogenica (in azoto (77K) o metano liquido(112K)) ⇒ crio-microscopia elettronica❖La risoluzione può venire aumentata fissando le molecole in matrici bidimensionali su substrati❖Le tecniche di risoluzione dell’immagine e costruzione del modello sono simili a quelle della diffrazione da campioni non cristallinila risoluzione ottenibile è minore (5-10Å), e quindile mappe elettroniche ottenute sono piú grossolane,spesso sufficienti a localizzare solo i Cα o i P del fosfato negli acidi nucleici❖Tecnica adatta per analizzare oggetti molto grandi (da aggregati macromolecolari a virus) in un ambiente quasi fisiologico❖La risoluzione può essere aumentata se esistono modelli ad alta risoluzione delle singole parti da fittare nella mappa elettronica a bassa risoluzione

Spettroscopia Strutturale

http://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/

The electron microscopy data bank

Database specifico per le mappe elettroniche a bassa risoluzione

Spettroscopia Strutturaleribosoma

reovirus

Capside e membrana esterna del virus HIV

Spettroscopia Strutturale Spettroscopia strutturale con NMR

❖La spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) non necessita che le molecole siano cristallizzate, e anzi è adatta ad analizzarle in soluzione acquosa❖La tecnica si basa sull’interazione tra il momento magnetico associato ad un nucleo e un campo magnetico esterno ⇒ La molecola deve avere nuclei con spin non nullo (numero di protoni o neutroni dispari)❖I nuclei piú usati sono H, 13C, 15N, 31P, con spin = ½❖Occasionalmente anche 14N (spin 1)❖In presenza di campo magnetico esterno B0 il momento magnetico del nucleo precede alla frequenza di Larmor ωL=B0 γ❖Il rapporto giromagnetico γ=gZe/2Mè il rapporto tra momento magnetico e momento angolare (spin), ed è specifico per ogni nucleo.

γ (rad/ gauss sec)

ωL0/ 2π

(MHz/T)Sensibilitàrelativa (ad H)e 1.76 104 2.80 104

1H 26.7 42.6 1.000

2H 4.1 6.5 0.0096

13C 6.7 10.7 0.016

14N 1.9 3.07 0.001

31P 10.8 17.2 0.066

g particelle classiche = 1 gelectron~-2 (+correzioni di mecc quantistica dei campi )gproton~5.6 gneutron~ -3.8 …

Spettroscopia Strutturale

zx

y

Bxy

ω

❖Se al sistema viene aggiunto un campo magnetico rotante a frequenza ω vicina a ωL nel piano xy (ad esempio generato da un circuito che oscilla alle RF) la magnetizzazione media tenderà a ruotare in direzione ortogonale a z ❖l’energia fornita per la rotazione proviene dal circuito RF

B0❖Lo stato finale della magnetizzazione (parzialmente o totalmente invertita) dipende dalla durata dell’impulso RF❖In condizioni di risonanza (ω~ωL) si avrà il massimo effetto, misurabile attraverso una misura della variazione della magnetizzazione globale del sistema❖In risonanza è massimo anche l’assorbimento di energia del sistema dal circuito RF

ωL ω

❖Altre quantità misurabili sono i tempi di rilassamento della magnetizzazione in seguito all’accensione e lo spegnimento degli impulsi RF

Spettroscopia StrutturaleFissato il campo esterno B0 (ad es 10 T), tutti gli H hanno all’incirca la stessa ωL (~420MHz)

ωL=(1-σ)B0 γNB: σ è adimensionale e indipendente da B0, ma lo spostamento assoluto di ωL è proporzionale a B0 ⇒ maggiore B0, maggiore la sensibilità

Tuttavia, all’interno di una molecola, a causa di effetti di schermo, il campo B locale avvertito dal protone risente fortemente dell’ambiente chimico circostante ⇒ ωL subisce una variazione misurata dal parametro σ spostamento chimico (chemical shift)

B0 tipici usati vanno da 1 a 10 Tσ tipici per NMR su protoni sono di 0-12 ppmper NMR 13C sono di 0-220 ppmσ dipende dal campo magnetico localesentito dal nucleo; in prima approssimazione nuclei vicini ad elementi molto elettronegativi rimangono piú “nudi” di elettroni e quindi hanno un σ maggioreσ misura l’ambiente chimico in cui si trova il nucleo

Spettroscopia Strutturale

Chemical shift dei diversi atomi C nei 20 amminoacidi: il picco principale di ciascuna distribuzione fornisce informazioni grossolane, come il tipo di atomo (Cα o Cβ etc) e a quale amminoacido appartiene

Spettroscopia Strutturale

Nuclei vicini tra loro si influenzano a vicenda provocando uno splitting del picco della risonanza principale, oltre allo spostamento chimico globale

Dall’analisi dello splitting si ricavano ❖Distanze di legame❖Angoli di legame❖Diedri

Inoltre, la mappa di correlazione bidimensionale fornisce indicazioni sulla distanza relativa anche tra atomi non legati

Spettroscopia Strutturale

In conclusione

❖dall’analisi di spettri e mappe NMR si ottengono vincoli su distanze e angoli di legame e distanze tra atomi non legati❖Se questi vincoli sono in numero sufficiente rispetto agli atomi della struttura, è possibile inserirli in un modello che poi viene iterativamente ottimizzato fino a che i vincoli stessi non sono soddisfatti❖Questa procedura non dà come risultato un’unica struttura, ma un insieme di modelli ❖Le differenze strutturali tra i modelli riflettono

๏La reale libertà conformazionale di una molecola in soluzione๏Le fluttuazioni termiche๏L’errore sperimentale

Rispetto alla diffrazione RX, l’NMR ha una risoluzione inferiore, ma dà un’immagine piú realistica delle conformazioni assunte dalla molecola nell’ambiente naturale

Anche le strutture NMR sono depositate nel PDBAd Es: proteina scarsamente strutturata Tat

Spettroscopia Strutturale

Measured quantity

Structure determination Sample conditions Resolution

X-ray scattering

Electron density map

Fit of atomic models into the electron map

CrystalFibersMicrocrystalline powderSolutions

1-3 Å

Neutron scattering

Nucleon density

Fit of atomic models Crystal 1-2 Å

Electron microscopy

Electron density map

Fit of low resolution models or of previously resolved atomic models into the electron map

CrystalsOrdered arraysSolutionSolvated samples at cryogenic temp

3-10 Å

NMR Chemical shift Correlation plots of chemical shifts

Inclusion of constraints into atomic model

(Solid state)Solution

2-4 Å

Spettroscopia Strutturale

Xray pros Xray cons NMR pros NMR consRisoluzione fino a Å Generalmente non si

risolvono le posizioni dei protoni, ne’ le posizioni delle parti troppo mobili

Generalmente si risolvono tutti gli atomi

Potere risolutivo e accuratezza globale generalmente inferiori; si possono analizzare sistemi di dimensioni inferiori a ~64KDa

La cristallizzazione può bloccare il sistema in conformazioni interessanti e dipendenti dall’ambiente

Necessità di cristallizzare, impossibile analizzare molecole in soluzione

Possibilità di studio in ambiente acquoso “fisiologico”, campionate molte configurazioni naturali. Possibilita` di studio della cinetica di certi processi

I dati possono non essere sufficienti a distinguere diverse configurazioni (problema sotto-definito)

Si ottengono densita` elettroniche che danno quasi direttamente le posizioni atomiche

Le posizioni atomiche possono avere bias dovuti ai vincoli cristallografici

Si ottengono una gran quantita` di dati strutturali che possono essere usati come parametri per modelli

I dati ottenuti non danno direttamente le posizioni atomiche, ma vanno rielaborati sulla base di un modello