Metodi di sequenziamento Sanger (enzimatico) Maxam e Gilbert (chimico)
Sanger (enzimatico) Maxam e Gilbert (chimico)...Metodo di Maxam e Gilbert DNA singolo filamento...
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Metodi di sequenziamento
• Sanger (enzimatico)
• Maxam e Gilbert (chimico)
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Metodo di Sanger
primer
primernuovo DNA
dideossinucleotideterminatore
quattro dNTP (incluso 32PdNTP)DNA polimerasi
La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP
Denaturare e separare su gel di poliacrilammide
ddTTP ddCTP ddGTP ddATP
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Metodo di Maxam e GilbertDNA singolo filamentomarcato ad una estremità
4 o 5 reazioni di modificazionebase-specifiche
Rottura del filamento incorrispondenza della basemodificata mediante piperidina
Es. metilazione delle G condimetilsolfato
Separare i frammenti marcati su geldi acrilammide
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Gel di poliacrilammide di sequenza
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Confronto metodi di sequenziamento
Sanger
rapida e semplice attuazione
disponibilità di kit
necessità di primer
sensibile a strutture secondarie
Maxam e Gilbert
lunga preparazione del DNA
reazioni da mettere a punto
relativamente economico
strutture non influenti
utilizzabile per oligonucleotidi
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Sequenziamento automatico
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Sequenziamento con Taq polimerasi
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Trasferimento di acidi nucleici(Blotting)
• Southern
• Northern
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Schema ibridazione
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Metodi di trasferimento
• Capillare
• Elettroblot
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Schema trasferimento
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carta 3MM
membrana nylon
gel
supporto
}
carta 3MMtampone
vaschetta
Assemblaggio del blot capillare
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- +
tampone
carta 3MM
spugnettegel
membrana nylon
Assemblaggio dell’elettroblot
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Analisi di espressione con Northern blot
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Altre tecniche di analisi
• Estensione del primer (primer extension)
• Protezione dalla S1/RNasi (mapping)
• RT-PCR
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mRNA totale
oligo antisenso marcato
mRNA globina
cap
5’3’
ibridazione
estensione con RT
Analisi dei frammenti estesi su gel di sequenza
frammento protetto
Estensione del primer
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Protezione da RNasi (RNase Protection)mRNA totale
sonda RNA antisenso
mRNA globina
cap
5’3’
ibridazione
trattamento con RNasi
Analisi dei frammenti protetti su gel di sequenza
frammento protetto
inizio trascrizione
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Analisi interazioni DNA-proteine:saggio di footprinting
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Analisi interazioni DNA-proteine:saggio EMSA