Riparazione del DNA ed insorgenza di tumori

Marco Muzi FalconiDip. Scienze Biomolecolari e Biotecnologie

Università degli Studi di Milano

Danni al DNA e cancro

•Le cellule tumorali•L’importanza della stabilità genomica•Danni al DNA•Riparazione del DNA•Checkpoints•Risposta ai danni al DNA e insorgenza di tumori•Risposta ai danni al DNA e terapia

Cosa è il cancro

Cancro: cellule anormali si dividono senza controllo ed invadono altri tessuti

Tutte le forme di cancro partono da una cellula. Per capire il cancro bisogna capire cosa succede quando una cellula normale diventa tumorale

Normalmente le cellule si dividono in maniera controllata

Cellule vecchie o danneggiate muoiono

Alterazioni del DNA possono influenzare la crescita e la divisione cellulare

Cancro e stabilità del genoma

Cellule cancerose e precancerose mostrano un alterazioni cromosomiche

Cariotipo di una cellula normaleHuman chromosomes

Cariotipo di una cellula tumoraleChromosomes from a cancer cell

Cariotipo di un’altra cellula tumoraleHuman chromosomes

Instabilità genomica aumenta probabilità di attivazione di oncogeni, di inattivazione di oncosoppressori etc

Con il tempo aumenta la malignità e la resistenza ai farmaci

Instabilità genomica è critica per permettere sviluppo tumorale

• 46 cromosomi, 6,5 miliardi di nucleotidi da replicare e segregare• Il DNA deve essere riparato

Il Problema

replicazione

segregazione

Corretta alternanza replicazione-segregazione

Fedeltà di replicazione e segregazione

Riparazione

Mantenimento della stabilità genomica

Perchè studiare questi processi

Sono processi fondamentali per la cellula

Interesse per la scienza di base

Interesse per la scienza applicata

basi molecolari del cancro

invecchiamento

strategie chemioterapeutiche

etc.

Insorgenza di danni al DNA

Danni al DNA

Ogni giorno il DNA di ciascuna cellula subisce almeno 50.000 lesioni

La natura chimico-fisica della lesione dipende dall’origine delle lesione stessa

Ci sono lesioni più pericolose di altre

Le cause delle mutazioni

Prodotti del normale metabolismo cellulare (es. respirazione cellulare, metilazione)

Processi cellulari (es. replicazione del DNA)

Ambiente (es. radiazioni varie, agenti chimici)

Mutagenesi ambientaleBBQ

fumo

agenti alchilanti

chemioterapici

radiazioni ionizzanti

radiazioni UV

Mutazioni geniche

Mutazioni cromosomiche

Mutazioni genomiche

Riparazione del DNA

Cos’è la riparazione del DNA

La riparazione del DNA è un insieme di processi attraverso i quali le nostre cellule riconoscono e correggono lesioni presenti nel DNA

Se le lesioni non vengono riparate si possono verificare mutazioni e alterazioni cromosomiche più o meno importanti

Perché riparare

20.000 depurinazioni giorno/cellula

10.000 miliardi cellule/organismo

Accumulo di mutazioni in cellule somatiche può portare allo sviluppo di tumori

Mutazioni nelle cellule germinali possono portare alla trasmissione di malattie genetiche

La riparazione è molto efficiente

NER

BER

MMR

Cariotipo di un’altra cellula tumoraleHuman chromosomes

Cariotipo di una cellula tumoraleChromosomes from a cancer cell

Fenotipo mutatore

Per passare da cellula normale a cellula cancerosa sono necessarie numerose alterazioni del genoma

Man mano che le mutazioni aumentano la cellula diventa progressivamente più anormale

Quando una mutazione colpisce un sistema che controlla la riparazione del DNA la cellula diventa ancora più suscettibile di mutazioni e si osserva un’accelerazione notevole del’instabilità genomica

Checkpoint da danni al DNA

Come fa la cellula ad accorgersi che ci sono danni al DNA?

Come fa la cellula ad integrare la riparazione con la replicazione e la divisione cellulare?

Come fa la cellula a decidere se riparare il DNA oppure morire a favore della sopravvivenza dell’organismo?

Checkpoint da danni al DNA

La risposta a queste domande: ci pensa il checkpoint da danni al DNA

Checkpoint da danni al DNA

Checkpoint reagisce alla presenza di lesioni sul DNA coordinando diversi processi

Danni al DNA

checkpoints

Trascrizione

Riparazione e ricombinazione

Replicazione del DNA

Ciclo cellulare

Morte cellulare (apoptosi)

cellule che sono troppo danneggiate decidono di morire evitando di creare problemi all’organismo

apoptosi è un meccanismo di soppressione dei tumori

apoptosi è regolata dal checkpoint attraverso p53

Il Ciclo Cellulare

-processo di duplicazione e divisione (mitosi-interfase)

-ciclo cromosomico

-sequenza ordinata di eventi

-estrema conservazione evolutiva

-grande complessita’ e finezza di regolazione

Il ciclo cellulare

danni al DNASegregazione del genoma

Duplicazione del genoma

iDS

danni al DNA

danni al DNA

Saccharomyces cerevisiae

S. cerevisiae, organismo modello

unicellulare, molto più semplice, trattabile geneticamente.

i principali pathways legati alla riparazione del DNA ed al controllo della stabilità del genoma sono molto conservati

G1 S G2 M

Cellule normali dopo raggi X si arrestano

Mutanti nel checkpoint continuano a dividersi

Identificazione dei fattori di checkpoint

mec1-1

WT

50 J/m2 0.02% MMSuntreated

Identificazione dei fattori di checkpoint

Rad17, Mec3, Ddc1Rad24, Rad9, MRX Sensori

Mec1, Tel1, Rad53, Chk1 Trasduttori

RPA, Polα-primase, Cdc28, Swi6, Pds1, Cdc14, ...

Effettori

S. cerevisiae

hRAD1, hHUS1, hRAD9, hRAD17, BRCA1?, MRN

ATM, ATR, CHK2, CHK1

RPA, p53, CDC25, CDK, ...

H.sapiens

Il checkpoint da danno al DNA

RPA RPA RPA

Rad24

RFC2-5

234

5

Ddc1

Rad17 Mec3

Ddc2

Mec1

Targets

RPA RPA RPA

Rad9P

P P

P

Rad9

P

Rad9

PRad9

P P

Rad53

Rad53

PP

Rad53

P P

Ddc1

PP

Ddc2

Danni a DNA ed insorgenza di tumori

La genetica dell’instabilità genomica

Ataxia Telangiectasia ATM CheckpointAT like disease MRN complex Checkpoint/ricomb.Nejmegen breakage syndrome MRN complex Checkpoint/ricomb.Werner syndrome WRN RicombinazioneBloom syndrome BLM Ricombinazione

BRCA1/2 Checkpoint/ricomb.Xeroderma Pigm. NER complex NERHNPCC MSH, MLH Checkpoint/MMRLi-Fraumeni syndrome p53, CHK2 CheckpointFanconi Anemia FANC proteins ICLRep/checkpoint

Ataxia telangiectasiaBloom syndrome

Werner syndrome

Sindromi genetiche con elevata insorgenza di tumori

Xeroderma pigment.

Esempi

difetti in MMR sono responsabili di HNPCC, predispongono allo sviluppo di tumori al colon, endometrio ed ovaie.

BRCA1 e BRCA2 sono implicati nella riparazione dei DSB.

Mutazioni in questi geni conferiscono elevata probabilità di tumori al seno e ovaie (35-84% e 10-50%)

p53a valle del checkpoint

promuove apoptosi

promuove arresto del ciclo cellulare in G1

mutazioni ereditarie

mutazioni sporadiche

mutato nella maggior parte dei pazienti

PP

p53 è attivato dal checkpointdanno al DNA

ATM

Chk2p53 p53

MDM2

MDM2

X

p53 inattivo e instabile p53 attivo e stabile

geni target sono spenti geni target sono accesi

p21, Bax

danno al DNA

p53 aumenta e si attivaarresto del ciclo cellulare

riparazione prima della divisione

apoptosi

danno al DNA

p53 assenteciclo cellulare non si arresta

divisione in presenza di danni: mutazioni,

perdita di cromosomi

problemi di divisione, letalità

p53+

p53-

Danni al DNA e terapia dei tumori

Terapia

Radio- e chemio- terapia si basano sul causare danni al DNA, uccidendo le cellule tumorali

Bisogna capire come aumentare la selettività per le cellule malate

Problemi:

farmaco causa mutazioni

possibile sviluppo di tumori secondari

Cisplatino

molto efficiente nel trattamento di tumori testicolari metastatici

utilizzato per diversi altri tumori

Cisplatino

Principali limitazioni:

effetti collaterali tossici

meccanismi di resistenza

innati

acquisiti

Azathioprin (Aza)

immunosppressivo

aumenta probabilità di carcinomi cutanei

6-TG interagisce con UVA generando ROS

6-TG genera un fotoprodotto che blocca la replicazione

Radioterapia

Radiazioni ionizzanti generano DSBs

DSBs attivano il checkpoint via ATM

inibitori specifici di ATM

Tumori dovuti a mutazioni BRCA1/2 hanno difetti nella riparazione delle rotture del DNA

Inibitori della PARP possono eliminare specificamente queste cellule tumorali

Agenti alchilanti

sono molto utilizzati

molti melanomi metastatici non rispondono

resistenza è dovuta a AGT, enzima riparativo

inibizione di AGT sensitivizza il tumore

Instabilità genomica è alla base dei tumori

Per avere instabilità genomica la cellula deve tollerare danni al DNA

Cellule tumorali sono molto spesso difettive in uno dei sistemi di riparazione o nel checkpoint

Conoscenza dei dettagli dei diversi sistemi di riparazione e di risposta ai danni è importante