Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno Unito · Cystoisospora belli (in precedenza...

Emesso da Standards Unit, Microbiology Services, PHE Batteriologia | B 31 | Emissione no: 4.1 | data di emissione: 09.05.14 | Pagina: 1 di 48

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Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno Unito

Ricerca di Parassiti in Campioni diversi dal Sangue


Batteriologia | B 31 | Emissione no: 4 | Data emissione: 26.03.13 | Pagina: 2 di 48 UK Standards for Microbiology Investigations | Emesso da Standards Unit, Health Protection Agency

Ringraziamenti Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida dell’Health Protection Agency (HPA) in collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web http://www.hpa.org.uk/SMI/Partnerships. Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare http://www.hpa.org.uk/SMI/WorkingGroups). Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici. Per ulteriori informazioni contattare:

Standards Unit Microbiology Services Public Health England 61 Colindale Avenue London NW9 5EQ E-mail: [email protected]

Website: http://www.hpa.org.uk/SMI

Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la collaborazione di:



Contenuti RINGRAZIAMENTI ..................................................................................................................... 2

TABELLA MODIFICHE .............................................................................................................. 5

SMI RU: SCOPO E PROPOSTE ................................................................................................ 7

SCOPO DEL DOCUMENTO ...................................................................................................... 9

SCOPO ....................................................................................................................................... 9

INTRODUZIONE ........................................................................................................................ 9

INFORMAZIONE TECNICA/ LIMITAZIONI ............................................................................. 20

1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA ...................................................................... 21

2 PRELIEVO DEL CAMPIONE ........................................................................................ 22

3 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE ................................................ 24

4 PROCESSO/PROCEDURA SUL CAMPIONE .............................................................. 24

5 PROCEDURA DI REFERTAZIONE .... .......................................................................... 31

6 NOTIFICA AL PHE O EQUIVALENTE ......................................................................... 31

APPENDICE 1: TIPOLOGIA DEI CAMPIONI E POSSIBILI PARASSITI IDENTIFICABILI…………………………………………………………………………………… 33

APPENDICE 2: DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA DELLE INFEZIONI PARASSITARIE ...... 34

APPENDICE 3: CALIBRAZIONE DEL MICROSCOPIO PER COMPONENTI FECALI .......... 35

APPENDICE 4: COMUNI COSTITUENTI MICROSCOPICI DELLE FECI ............................... 36

APPENDICE 5: DIMENSIONI COMPARATIVE DELLE UOVA DI ELMINTI .......................... 37

APPENDICE 6: OOCISTI DI COCCIDI ................................................................................... 38

APPENDICE 7:CONFRONTO FRA TENIE RISCONTRATE NELL'UOMO ........................... 39

APPENDICE 8:LARVE DI ELMINTI - CARATTERISTICHE ................................................... 40

APPENDICE 9: IDENTIFICAZIONE DI TROFOZOITI DI AMEBA IN STRISCI COLORATI .. 41

APPENDICE 10: BALANTIDIUM COLI - TROFOZOITE E CISTE ......................................... 42

APPENDICE 11: IDENTIFICAZIONE DELLE CISTI DI AMEBE E FLAGELLATI ................. 42

APPENDICE 12:MICROFILARIE RISCONTRATE NELL'UOMO .......................................... 43

BLIOGAFIA .............................................................................................................................. 44



NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for Microbiology Investigations. L’accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio 2011. Informazioni più dettagliate sull’accreditamento possono essere consultate: www.nice.org.uk/accreditation.

Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : www.nice.org.uk/accreditation



Tabella delle modifiche Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la [email protected].

I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il sistema locale di gestione della qualità.

Modifica No/Date. 8/09.05.14

Emissione eliminate no. 4

Emissione inserita no. 4.1

Sezione(i) interessate. Modifica.

Intero documento

Il documento è stato inserito in un nuovo formato che evidenzia il passaggio della Health Protection Agency alla Public Health England.

Prima pagina ridisegnata.

Rinominata la pagina di “Stato come Scopo” e Obiettivo ed aggiornata in modo appropriato.

I loghi delle organizzazioni professionali sono stati revisionati ed aggiornati.

Revisionati e aggiornati Standard di sicurezza e referenti delle denunce

Il contenuto scientifico rimane invariato

Modifica No/Date. 7/26.03.13

Emissione eliminate no. 3.1

Emissione inserita no. 4

Sezione(i) interessate. Modifica.

Intero documento

Edito per chiarezza. Riorganizzazione di parte del testo. Modifiche minori al testo. Maggior chiarezza per appropriati metodi di colorazione.. Cambiamenti Tassonomici: Giardia duodenalis (sinonimo di Giardia intestinalis e Giardia lamblia). Cystoisospora belli (in precedenza Isospora belli). Pneumocystis jirovecii (in precedenza



Peumocycstis carinii).Microsporidi reclassificati come fungi. Aggiunti metodi rapidi /molecolari a Informazione Technical/Limitazioni. Aggiunti vantaggi/svantaggi alle variazione della dimensione dei pori dei filtri per la concentrazione delle feci. Aggiunti collegamenti ai laboratori di riferimento. Rimozione del raschiamento corneale, lenti a contatto, e fluidi per lenti a contatto.

Appendice. Tipologia del campione e distribuzione delle tabelle spostate da Appendice 1 e 2.

Bibliografia. Aggiornate alcune voci bibliografiche



UK SMI#: Scopo e Obiettivi Utilizzatori delle SMI

Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai professionisti che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive. Le SMI forniscono ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio riferibili alle ricerche per la diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni forniscono indicazioni che facilitano la prenotazione elettronica di test appropriati. I documenti forniscono gli standard per le ricerche microbiologiche anche ai responsabili della sanità pubblica che devono considerarle come parte delle procedure da adottare per la salute sia clinica che pubblica per la propria popolazione.

Informazioni di Base per le SMI Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti del processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove di laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).Gli algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note orientative descrivono metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la validazione della prova.

La standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di garantire in tutto il Regno Unito strategie d’indagine equivalenti nei diversi laboratori che è una condizione essenziale per interventi di sorveglianza della salute pubblica, e per le attività di ricerca e di sviluppo. La standardizzazione delle procedure diagnostiche tramite l’applicazione delle SMI aiuta a garantire uniformità nelle stratefie di ricerca nei diversi laboratori nel RU ed è una condizione essenziale per la sorveglianza della salute pubblica , ricerca e sviluppo di attività.

Coinvolgimento delle Organizzazioni Professionali

Lo sviluppo delle SMI è condotto in condizione paritaria da PHE, NHS,Royal College of Pathologists e organizzazioni professionali. L'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito http://www.hpa.org.uk/SMI/Partnershipshttp. L'inclusione del logo di un’organizzazione in una SMI implica il sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione del documento. I rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno parte del Comitato Direttivo e dei Gruppi di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei partecipanti non sono necessariamente quelle espresse da tutta l'organizzazione che essi rappresentano. I rappresentanti agiscono da tramite con funzione di collegamento bi-direzionale per informazione e dialogo. Le attività di rappresentanza sono ricercate tramite un processo di consultazione. Le SMI sono sviluppate, revisionate e aggiornate tramite un ampio processo di consultazione.

Assicurazione di Qualità La NHS Evidence ha accreditato la procedura usata dai SMI Working Groups per produrre le SMI. L’accreditamento è applicabile a tutte le linee guida emesse dall’Ottobre 2009. La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008. Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si devono attenere per la propria attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno Unito. Le SMI sono accreditate dal NICE

#Microbiology is used as a generic term to include the two GMC-recognised specialties of Medical Microbiology (which includes Bacteriology, Mycology and Parasitology) and Medical Virology.



rappresentano gli standard minimi di attività, e neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio. Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti dell’accreditamento con la promozione di procedure d’elevata qualità che possono essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo. Le prestazioni della SMI dipendono da personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e che i risultati siano idonei allo scopo. I laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure del controllo di qualità interno.

Coinvolgimento del Paziente e della Comunità Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento dei pazienti e dell’opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato, la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L’opportunità di partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l’accesso libero al nostro sito web.

Informazione della Gestione dei Dati Sensibili La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza. Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza http://www.hpa.org.uk/webc/HPAwebFile/HPAweb_C/1317133470313.

I Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti.

Dichiarazione Legale Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, la PHE e ogni altra organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente, escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche. Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel corso della revisione successiva. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell’ente accreditato NICE. Le SMI sono assoggettate a diritti d’autore che dovrebbero essere riconosci

Citazione Suggerita per questo Documento Public Health England. (2014). Errore. L'origine riferimento non è stata trovata.. UK Standards for Microbiology Investigations. B 31Issue 4. http://www.hpa.org.uk/SMI/pdf

Ricerca di Parassiti in Campioni Diversi dal Sangue

Batteriologia | B 31 | Emissione no: 4 | Data emissione:09.05.14 | Pagina: 9 di 48 UK Standards for Microbiology Investigations | Emesso da Standards Unit, Public Health England

Scopo del Documento

Tipo di campione Feci, urine, vetrino con nastro adesivo, tampone perianale, LCR, bile, pus da ascessi, aspirati duodenali / digiunali, tessuti, csti idatidea, espettorato/lavaggio broncoalveolare biopsie Scopo Questa SMI descrive le procedure per la ricerca e l’isolamento di un certo numero di parasiti ottenuti da diversi materiali clinici, esclusi i campioni ematici.

Questa SMI deve essere usata insieme alle altre SMI.

Introduzione

Sebbene i campioni fecali siano quelli più frequentemente inviati al laboratorio per la ricerca dei parassiti, molti altri diversi tipi di parassiti possono essere isolati da vari altri materiali inviati in laboratorio. In questa sede sono descritti i quadri clinici, la preparazione dei campioni e l’identificazione dei parassiti più frequentemente identificati presso i laboratori della Public Health England (PHE), ma ne possono essere riscontrati anche altri. Per completezza sono descritte anche le specie di non frequente osservazione.

I Laboratori di Riferimento devono essere utilizzati per identificare i parassiti che non fanno parte della normale attività diagnostica del laboratorio.

Anche laboratori di ematologia, istologia e sierologia possono contribuire in modo significativo alla diagnosi delle infezioni da parassiti.

Questa introduzione descrive:

• Protozoi

- Amebe

- Flagellati/ciliati

- Coccidi

• Nematodi

• Trematodi

• Cestodi

Protozoi2 Amebe intestinali Le Amebe che possono essere isolate dal tratto gastrointestinale includono Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba coli, Entamoeba hartmanni, Endolimax nana e Iodamoeba butschlii. Tutte, tranne E. histolytica, di solito non sono patogene (consultare Appendici 9-11). E. histolytica ed E. dispar sono morfologicamente indistinguibili al microscopio ottico. Delle due specie, solo E. histolyticaè in grado di indurre una malattia a carattere invasivo. Quando la diagnosi



è posta con l’osservazione al microscopio ottico, le cisti devono essere segnalate come E. histollytica/ E.dispar3. In alternativa, i metodi diagnostici comprendono la ricerca dell’antigene con saggio immunoenzimatico o la ricerca del DNA con la PCR2,4.

E. histolytica può produrre lesioni di tipo ulcerativo ed infiammatorio nel colon. Diffonde in sedi extraintestinali, più frequentemente epatica, dove si manifestano estese lesioni dei tissuti, che possono provocare formazione di ascessi, aumento della peristalsi intestinale e feci liquide. L’infezione può provocare la perforazione colica, megacolon tossico, ameboma, e ulcerazione perianale3.

Campioni appropriati includono i liquidi aspirati o raschiamenti da un’area di tessuto intestinale o rettale sede d’infiammazione in corso di dissenteria e le feci di emissione recente per l’esame microscopico con il metodo della concentrazione per sedimentazione con etere/formolo. Il rilievo nei campioni fecali, o in quelli tissutali, di trofozoiti con emazie ingerite suggerisce la probabile diagnosi di malattia invasiva da E. histolytica2.

Amebe a vita libera

L’infezione nell’uomo da amebe a vita libera è infrequente. Questi protozoi includono: specie Acanthamoeba, Naegleria fowleri, Balamuthia mandrillaris e Sappinia diploidea5. Le infezioni causano l’invasione del sistema nervoso centrale e la cheratite da acanthamoeba.

La meningoencefalite primitiva amebica (MPA) è causata dalla N. fowleri. Si manifesta negli adulti e nei bambini che hanno da poco nuotato in acque calde infette. I microrganismi raggiungono la sede del sistema nervoso centrale per invasione diretta attraverso la mucosa nasale. Non si dispone di trattamento terapeutico efficace ed affidabile e la malattia è rapidamente a decorso infausto5.

Deve essere presa in considerazione la MPA quando i pazienti sviluppano meningite o meningoencefalite purulenta ed un’anamnesi di esposizione recente ad acqua dolce. Il conteggio dei globuli bianchi nel sangue nella fase iniziale della malattia può essere basso, ma aumenta nel tempo. L’aspetto del liquido cefalorachidiano (LCR) è emorragico, la glicorrachia è ridotta o normale e la protidorrachia aumentata

La diagnosi di laboratorio si avvale dell’esame di un preparato in sospensione di LCR e di uno colorato per trofozoiti di ameba (consultare Appendice 9 e 10).

L’encefalopatia granulosa amebica (EGA) è causata dalle specie Acanthamoeba e Balamuthia mandrillaris. E’ un’infezione opportunistica cronica, si manifesta più frequentemente in pazienti immuodepressi/AIDS, diffondendo al sistema nervoso centrale per via ematogena dal polmone o da lesioni cutanee. E’ spesso ad esito letale. La cheratite da Acanthamoeba è associata all’uso di lenti morbide a contatto e a traumatismi oculari; se non trattata immediatamente, può indurre un’ulcerazione corneale ed eventualmente cecità. Le specie Acanthamoeba possono essere inoltre isolate dal liquido per lenti a contatto di soggetti privi di segni o sintomi di malattia. (B 2- Investigation of Bacterial Eye Infections)5.

L’EGA può essere diagnosticata esaminando materiale bioptico cerebrale. Nell’EGA è frequente la presenza di ’infezione cutanea da Acanthamoeba; si possono eseguire biopsie su noduli cutanei od ulcerazioni poi esaminati con microscopia su preparato in sospensione e colorato (consultare Appendice 9). Sono disponibili anche metodi sierologici.



Flagellati

Giardia lamblia (sinonimo di Giardia intestinalis and Giardia lamblia)6

Questo microrganismo può causare epidemie diarroiche d’origine idrica ed è prevalentemente diffuso per via oro-fecale da persona a persona o da animali2. L’infezione può manifestarsi con diarrea autolimitante o con sindrome diarroica cronica, steatorrea, malassorbimento e perdita di peso. I sintomi includono diarrea, crampi, gonfiore addominale e flatulenza. Possono manifestarsi vomito, febbre e tenesmo, ma l’infezione può anche essere di tipo asintomatico2.

La diagnosi di laboratorio può essere ottenuta con l’esame microscopico di feci, aspirati duodenali o digiunali, e biopsie (consultare Appendice 11). Mtodi alternativi sulle feci includono la ricerca dell’antigene con test immunoenzimatico e la ricerca con PCR6.Esaminare più campioni a causa dell’emissione discontinua dei microrganismi. In modo ottimale, esaminare complessivamente tre campioni raccolti in 2 – 3 giorni diversi. Sono disponibili prove sierologiche, sebbene non affidabili.

Dientamoeba fragilis2

La patogenicità della Dientamoeba fragilis è incerta, comunque sono stati documentati casi di diarrea non invasiva associati ad astenia. Diversamente da altri protozoi non possiede uno stadio cistico, ed è ora considerata come ameba/flagellata. Il ruolo della diantoameba nei pazienti affetti da HIV e disordini intestinali è incerto e richiede ulteriori ricerche7.

Nei preparati emulsionati in fisiologica è molto difficile rilevare lo stadio di trofozoite, come pure in preparati di formolo-etere concentrati. Possono essere rilevati in materiale fecale con colorazioni quali tricromica, Giemsa o di Field (TP 39 - Staining Procedures). Sono stati sviluppati metodi alternativi che comprendono la ricerca del DNA con la PCR7.

Trichomonas vaginalis e Pentatrichomonas hominis

Nelle infezioni dell’uomo possono essere isolati Trichomonas vaginalis e Pentatrichomonas hominis. La maggior parte delle Infezioni da T. vaginalis è a trasmissione sessuale, mentre P. hominis colonizza l’intestino crasso e non è considerata patogena, sebbene possa causare moderati sintomi gastro-intestinali se presente ad elevate concentrazioni (B28 – Investigation of Genital Tract and Associated Specimens)8.

La diagnosi di laboratorio è di solito ottenuta con l’esame microscopico di un preparato emulsionato in fisiologica. Possono anche essere allestiti preparati con colorazione di arancio di acridina, sebbene ciò comporti la disponibilità di un microscopio a fluorescenza e la conseguente perdita d’immediatezza.

Ciliati

Balantidium coli

B. coli è un ciliato che parassita numerosi animali, inclusi l’uomo e i maiali. E’ presente ovunque. Di solito gli uomini sono resistenti all’infezione da B. coli, ma l’acloridria o la nutrizione insufficiente può aumentare il rischio di colonizzazione. La colonizzazione spesso è asintomatica. I pazienti possono sviluppare diarrea liquida intermittente o colite dissenterica acuta con feci contenenti muco e sangue2.

Dotati di rapidi movimenti, i grandi trofozoiti possono essere rilevati al microscopio nelle feci appena emesse (consultare Appendice 10). Nei campioni conservati la diagnosi è di tipo microscopico con preparato in sospensione, infatti i trofozoiti e le forme cistiche si colorano in modo indistinto con lo iodio o con le colorazioni permanenti1.



Coccidi

Cryptosporidium

Nell’uomo le specie Cryptosporidium possono causare diarree liquide profuse9. I bambini sono particolarmente vulnerabili per la mancanza di immunità acquisita e per la scarsa igiene personale. L’infezione presenta variazione stagionale con picchi d’incidenza in primavera e autunno. L’infezione crea particolari problemi negli immunocompromessi 2. La sintomatologia è di solito grave con diarrea cronica e segni di malassorbimento, ma altri tipi di esordio comprendono una malattia gastrointestinale atipica, come colangite, colecistite, pancreatite ed epatite. Sono state segnalate pure affezioni del tratto respiratorio. La diagnosi di laboratorio si avvale principalmente della dimostrazione di oocisti nei campioni appropriati, solitamente feci, evidenziate con colorazione auramina-fenolo, di Ziehl-Neelsen modificata (TP 39 - Staining Procedures) o tecniche con anticorpi fluorescenti. La sensibilità della colorazione di Ziehl-Neelsen modificata per la ricerca dei criptosporidi si è dimostrata inferiore agli altri metodi10,11. Metodi alternativi sono la ricerca dell’antigene ed i saggi immunoenzimatici o la ricerca del DNA con PCR2. Le prove di tipo specialistico includono la microscopia con immunofluorescenza, particolarmente sensibile, e i saggi PCR per identificazione di specie/genotipo.

Cyclospora

L’infezione da Cyclospora è presente in numerosi paesi e può essere associata all’acqua potabile contaminata o di balneazione. Durante la stagione delle piogge nel Nepal e nella comunità di Haiti si sono manifestate diffuse epidemie che hanno colpito i viaggiatori e gli stranieri residenti12,13. In Europa sono state segnalate epidemie alimentari associate a insalate miste e vegetali14,15. L’’infezione da Cyclospora cayetanesis è stata inoltre segnalata in pazienti infettati da HIV16.

I sintomi dell’infezione da Clyclospora includono diarrea liquida, perdita di peso, nausea, vomito e dolore addominale.

La diagnosi di laboratorio si avvale dell’aspetto delle oocisti nei preparati in sospensione o colorati. Possono essere utilizzati metodi di concentrazione e le colorazioni modificate di Ziehl-Neelsen.

Nota: Cyclospora cayetanesis si colora in modo inadeguato con auramina-fenolo, ma presenta una caratteristica autofluorescenza blu a 340 - 360 nm (consultare TP 39 - Staining Procedures e Appendice 3 e 6).

Cystoisospora belli (in precedenza Isospora belli)2

L’infezione da Cystoisospora belli è relativamente infrequente nei paesi sviluppati, ma è endemica in alcune parti del mondo. Nei pazienti immunodepressi può determinare diarree liquide aspecifiche, autolimitanti associate a malessere, anoressia, crampi addominali e perdita di peso. I pazienti affetti da AIDS sono particolarmente predisposti all’infezione da Cystoisospora belli (con particolare frequenza in Africa).

La diagnosi di laboratorio è ottenuta con l’esame microscopico di un campione fecale o di muco intestinale. E’ raccomandata la concentrazione delle feci con formolo-etere; come le specie Cyclospora, Cystoisospora è auto fluorescente a 340-360nm (consultare TP 39 - Staining Procedures e Appendici 3 e 6).

Sarcocystis

Le Infezioni da specie Sarcocystis sono origine zoonotica. Le specie Sarcocystis differiscono dagli altri coccidi in quanto richiedono due ospiti per completare il loro ciclo vitale. L’uomo diviene ospite



intermedio dopo assunzione di carne cotta in modo incompleto dell’ospite primario contenente sarcocisti. La maggior parte di queste infezioni è asintomatica, ma sintomi, quali dolore addominale, nausea, gonfiore addominale e diarrea possono essere correlati alla presenza di sporocisti nelle feci. Nell’uomo la sarcocistosi muscolare è conseguente all’infezione da ingestione di carne infetta o trasmessa da gatti infetti. In questo caso i sintomi comprendono dolenzia o tumefazione muscolare.

Le tecniche di diagnosi di laboratorio sono le stesse di quelle per le specie Cystoisospora essendo presenti sporocisti mature nelle feci a partire dal nono giorno dall’avvenuta infezione. Microscopicamente non sono facilmente differenziabili da quelle delle specie Cystoisospora, e pertanto l’identificazione deve essere eseguita da un Laboratorio di Riferimento.

Toxoplasma

Nella maggior parte dei pazienti immunocompetenti l’infezione da Toxoplasma gondii è asintomatica, possono comunque manifestarsi sintomatologia febbrile, malessere, linfoadenopatia e mialgia. Si può manifestare malattia a sede oculare. Le infezioni possono essere primitive o da riattivazione. La riattivazione di un’infezione latente si manifesta in pazienti divenuti gravemente immunocompromessi. L’infezione fetale può essere determinata da un’infezione acuta contratta durante la gravidanza. (consultare P 5 - Investigation of Toxoplasma in Pregnancy).

Le procedure della diagnosi di laboratorio comprendono prove sierologiche, coltura, PCR e tecniche istologiche.

Microsporidi

Sono noti oltre 100 generi ed almeno 1000 specie. In patologia umana sono implicati quattro generi, Nosema, Encephalitozoon, Pleistophora, e Enterocytozoon17. Questi organismi sono parassiti intracellulari obbligati e si riscontrano nei liquidi corporei, tessuti e nel tratto gastrointestinale. All’inizio sono stati classificati come parassiti, ora sono stati considerati funghi18.

Solo Enterocytozoon bieneusi e Encephalitozoon (Septata) intestinalis coinvolgono il tratto gastrointestinale; per differenziare le due specie sono disponibili saggi PCR.

La microsporidiosi rappresenta un problema particolare nei pazienti infettati da HIV2. Questi ed altri pazienti immunocompromessi sono frequentemente infettati da parassiti opportunisti che nei soggetti immunocompetenti di solito non producono sintomatologia19. La diarrea cronica rappresenta l’aspetto clinico più eclatante dell’infezione da HIV ed è la causa predominante di morbilità e mortalità in questi pazienti20. La cherotocongiuntivite da Microsporidi è stata recentemente riscontrata in pazienti affetti da AIDS.

Possono essere utilizzate colorazioni istologiche, tecniche immunologiche e la microscopia elettronica per identificare questi microrganismi nelle urine, nell’espettorato, lavaggio broncoalveolare, nella bile, nell’aspirato duodenale, nelle feci, nei tessuti e nei raschiamenti corneali e congiuntivali. I Microsporidi possono essere evidenziati usando la colorazione tricromia o la colorazione di Ziehl-Neelsen modificata (consultare TP 39 - Staining Procedures Appendici 3 e 6). E’ stato valutato l’uso dell’idrossido di potassio associato a colcoflour bianco; entrambi si sono dimostrati equivalenti alla colorazione di Ziehl-Neelsen modificata21.

Protozoi a tassonomia non definita

Blastocystis hominis

Descritti in precedenza come flagellati, lieviti, coccidi ed amebe, questo microrganismo costituisce un gruppo diverso classificato come stramenopiles22 E’ dubbio il significato di B. hominis come



patogeno umano23. La presenza nelle feci in carica consistente (più di cinque microrganismi per campo ad elevato ingrandimento) è correlata a sintomi di anoressica, flatulenza e diarrea2.

Per la diagnosi di laboratorio possono essere utilizzati la microscopia su preparato in sospensione dopo concentrazione formolo-etere e strisci colorati con Giemsa e colorante di Fields o le confezioni di colorazioni differenziali24 (consultare TP 39 - Staining Procedures).

Pneumocystis jirovecii (in precedenza Pneumocistis carini)25

Pneumocystis jirovecii è un microrganismo extracellulare che causa polmonite interstiziale con infiltrato plasmacellulare nell’uomo e generalmente provoca malattia nei pazienti immunodepressi od immunosoppressi, nei prematuri, nei bambini ammalati e affetti da malnutrizione26. Pneumocistis è stata classificata come protozoo, poi riclassificata e ora è considerata un fungo parassita27.

La polmonite da P jirovecii. è una comune infezione opportunistica frequente nei pazienti con AIDS (consultare B 57 - Investigation of Bronchoalveolar Lavage, Sputum and Associated Specimens).

La diagnosi di laboratorio si avvale della colorazione dei campioni ottenuti da espettorazione indotta o da lavaggi bronco-alveolari (BAL). Questa può essere eseguita mediante colorazione con Giemsa o con impregnazione argentica o, più specificamente, con la ricerca dell’antigene con metodo di immunofluorescenza diretta od indiretta. (consultare TP 39 - Staining Procedures).

Nematodi (Vermi rotondi)

La diagnosi di laboratorio delle infestazioni da nematodi si avvale principalmente dell’identificazione delle uova o delle larve emesse con le feci. Un preparato fecale emulsionato in soluzione fisiologica dopo concentrazione con formolo-etere/etil-acetato consente il rilievo microscopico delle uova (consultare Appendice 5). Ha pure valore diagnostico il rilevo macroscopico del parassita.

In numerose infezioni parassitarie intestinali, inclusa la dissenteria amebica, possono presentare nelle feci cristalli di Charcot-Leyden. Questi sono caratteristici del coinvolgimento degli eosinofili disgregati in alcune reazioni dei tessuti. I cristalli esagonali proteici di Charcot-Leyden possono essere osservati con microscopia normale o in fluorescenza come aghi fluorescenti risplendenti di colore giallo verde28,29.

La presenza di eosinofilia tissutale od ematica in viaggiatori di ritorno da un soggiorno prolungato, o da un viaggio in alcuni paesi in via di sviluppo, o in immigrati provenienti da aree tropicali, suggerisce la possibilità di un’infezione da elminti30. Alcune infezioni protozoarie possono causare anche eosinofila. La maggior presenza di eosinofila nei tessuti e nel sangue circolante si manifesta quando i parassiti raggiungono un contatto stretto con i tessuti, come per esempio quello delle larve migranti o per una loro estesa disseminazione in questa sede. Esempi sono rappresentati dalla trichinosi, larve viscerali migranti, dalla polmonite da ascaris, dalla strongiloidiasi, dalla filariasi e dalla schistosomiasi acuta. Organismi quali le tenie stazionano nell’intestino e non invadono la mucosa, pertanto causano eosinofila di moderata entità oppure non la provocano affatto.

Enterobius vermicularis

Noto anche come ossiuro, determina prurito perianale e perineale, specialmente nei bambini31. I parassiti migranti sono riscontrati nell’appendice, salpingi e nelle lesioni ulcerative dell’intestino tenue e del crasso, ma è incerta la loro correlazione con la con la patologia clinica (consultare Appendice 5).



La diagnosi di laboratorio si avvale dell’esame microscopico di un preparato con nastro adesivo e/o di un campione perianale prelevato con tampone.

Trichuris trichiura

Noto come verme a frusta determina infezioni spesso asintomatiche31. La perdita di sangue conseguente alle penetrazioni cefaliche delle forme adulte nella mucosa intestinale è di solito trascurabile, ma infezioni severe possono causare anemia di grado medio, diarrea ematica, disidratazione, sviluppo ritardato e prolasso rettale (consultare Appendice 5).

Ascaris lumbricoides30,31

Questa infezione è solitamente asintomatica. Comunque il verme è in grado di causare una grave malattia polmonare e di ostruire il tratto biliare e quello intestinale. Le larve migrano nei polmoni e possono causare eosinofilia ematica e sintomatologia associata all’infiltrazione polmonare. Nell’espettorato si possono riscontrare larve al terzo stadio. Nei bambini con infezioni gravi la massa dei vermi può ostruire il lume dell’intestino tenue. Ciò causa distensione addominale, vomito e crampi, Possono invadere anche il dotto biliare e causare dolore epigastrico, nausea e vomito (consultare Appendice 5).

Anchilostomi

Due sono le specie note che causano infezione nell’uomo: l’Ancylostoma duodenale ed il Necator americanus31. Le larve penetrano nella cute causando prurito intenso, eritema ed esantema papulare o vescicolare. Le larve migrano nei polmoni ove possono causare sintomatologia respiratoria ed eosinofilia nell’espettorato e nel sangue periferico. Diversamente dal N. americanus, A. duodenale può causare infezione a seguito di penetrazione per via orale. I sintomi includono anemia, deficienza proteica cronica, dolore addominale, perdita di peso e malassorbimento. Le uova dell’anchilostoma possono essere riscontrate nei campioni fecali, ma non è possibile distinguere fra loro le specie se non dopo la loro schiusa (consultare Appendici 5 e 8).

Nei campioni fecali non “recenti” infetti da anchilostoma si possono riscontrare larve al primo stadio; ciò consente la loro differenziazione dallo strongyloides (consultare Appendice 8).

Trichostrongylus spp.

Questi organismi sono ubiquitari, ma sono di raro riscontro in Europa. Possono causare malattia nell’uomo e sono presenti negli allevamenti di animali erbivori delle aree rurali.

Strongyloides stercoralis

Strongyloides stercoralis invade la mucosa intestinale e deposita uova a parete sottile che schiudono larve rabditoidi30. Queste possono essere emesse con le feci o sviluppare nel lume intestinale larve infettive che possono provocare autoinfezione dell’ospite. Questa può assumere andamento destruente nei pazienti immunocompromessi31. La sintomatologia polmonare è molto simile a quella dell’infezione da anchilostomi. Altri sintomi includono bruciore o coliche addominali dolorose, diarrea, emissione di muco, nausea, vomito, perdita di peso e malassorbimento. I pazienti possono sviluppare anche un’esantema orticaroide generalizzato o localizzato, inizialmente perianale, che si estende poi alle natiche, addome e alle cosce

Il primo stadio delle larve (rabditoide) è di solito riscontrato nelle feci, mentre le uova sono presenti solo in caso di diarrea severa (consultare Appendice 8)32. Per la diagnosi sono disponibili prove sierologiche.



Infezioni insolite da nematodi

La diagnosi di laboratorio delle infezioni di seguito descritte può essere superiore alle possibilità diagnostiche della maggior parte dei laboratori di routine. Poiché molte di queste infestazioni sono rare e si riscontrano solo nei paesi tropicali, si raccomanda che i campioni dei pazienti che presentano alcune peculiarità siano gestiti da un laboratorio di riferimento.

Le specie Trichinella sono ingerite con carne poco cotta30,33. La maggior parte delle infezioni è asintomatica, ma la presenza nell’intestino di un elevato numero di vermi adulti può causare diarrea, dolenzia addominale e vomito. Le larve si insediano nei muscoli scheletrici e causano febbre, edema peri-orbitale e miosite con dolore e rigonfiamento.

L’infezione è confermata con la sierologica o con la prova cutanea per la Trichinella. Di solito non è necessaria la biopsia muscolare.

Larva viscerale migrante (LVM): si tratta di larve che migrano dall’intestino a fegato, polmone e trachea30,34. L’agente eziologico più frequente è la Toxocara canis. Le specie Toxocara e altre elminti (Ascaris lumbricoides, Gnathostoma spinigerum) possono essere pure essere associate alla sindrome. La LVM si manifesta principalmente nei bambini d’età inferiore a 6 anni. La maggior parte delle infezioni è asintomatica, anche se i pazienti possono presentare tosse, febbre, dispnea ed epatomegalia. Raramente le larve si localizzano nell’occhio.

L’eosinofilia associata a leucocitosi è indicative di LVM. Sono disponibili prove sierologiche.

La larva migrante oculare è conseguente alla penetrazione delle larve di T. canis (e meno frequentemente di T. cati) che sono intrappolate nell’occhio formando una massa infiammatoria eosinofila34. La larva cutanea migrante, o eruzione strisciante, è di solito causata dall’Ancylostoma braziliense34. Si presenta come lesione cutanea pruriginosa serpiginosa, rilevata e arrossata. Questa manifestazione può essere causata da altri parassiti, come lo S. stercoralis.

Le larve di specie Anisakis (associate ad ingestione di pesce crudo, es. sushi), specie Phocanema e altri generi, possono penetrare nello stomaco e nell’intestino tenue e provocare sintomi addominali simulanti un’appendicopatia34.

La diagnosi di laboratorio può essere ottenuta con endoscopia, studi radiologici o con esame istologico dei tessuti coinvolti.

Angiostrongylus

Le larve di Angiostrongylus cantonensis possono invadere il cervello e causare meningite associata a pleiocitosi eosinofila nel LCR e ad eosinofilia periferica34. Le larve sono raramente rilevate nel LCR. G. spinigerum può causare una malattia simile. L’angiostrongiliasi addominale è causata dall’A. costaricensis34,35. Le larve penetrano e si sviluppano nell’intestino tenue e nel colon.

La diagnosi di laboratorio può essere ottenuta con l’esame di campioni bioptici.

Capillaria26, 34

La capillariasi, causata dalla Capillaria philippinensis e da C. hepatica, può presentarsi con diarrea, vomito, perdita di peso e malassorbimento, o epatite acuta/subacuta ed eosinofilia periferica.

Per la diagnosi sono richiesti l’esame del materiale fecale dopo concentrazione formolo-etere o materiale bioptico.



Dracunculus L’infezione da Dracunculus medinensi è caratterizzata dalla presenza di ulcere cutanee croniche dalla quali protrudono i vermi33. Alcuni pazienti presentano reazione generalizzata con orticaria, vomito, diarrea e dispnea.

Si sviluppano ulcere dolose che producono liquido contenente le larve. Queste possono essere riscontrate all’esame microscopico che conferma la diagnosi.

Onchocerca volvulus

Questo parassita è trasmesso dalle “mosche nere33. Causa una dermatite pruriginosa, noduli sottocutanei, cheratite e corioretinite. Le microfilarie possono essere dimostrate nei raschiamenti cutanei, nella camera anteriore dell'occhio o nella cornea.

Vermi adulti possono essere riscontrati nei campioni bioptici delle formazioni nodulari (consultare Appendice 12).

Mansonella streptocera

Questa specie particolare è trasmessa dai moscerini e da alcune specie di “mosche nere33. Altre specie sono di solito riscontrate nel sangue.

Dirofilaria immitis34

Nell’uomo sviluppano noduli a sede polmonare o ascessi sottocutanei. Le filarie migranti muoiono e causano vasculite localizzata che provoca infarti polmonari. Le altre specie causano la formazione di masse sottocutanee.

La diagnosi di laboratorio si avvale degli esami bioptici.

Trematodi (Distomidi)36

Di solito la diagnosi di laboratorio è ottenuta mediante l’identificazione microscopica delle uova emesse con le feci, le eccezioni sono di seguito elencate. Possono essere richiesti campioni di sangue soprattutto quando la presenza del parassita è scarsa nelle feci e nelle urine e può determinare un esito negativo. Una preparazione con sospensione del campione in soluzione fisiologica e / o iodio seguita da una concentrazione formolo-etere permette la dimostrazione microscopica delle uova. La colorazione del sedimento può aiutare l'identificazione (appendice 5) Distomi ematici Schistosomiasi

Questa può essere causata da cinque specie di Schistosoma: Schistosoma haematobium, Schistosoma intercalatum, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, e Schistosoma mekongi37. Le forme adulte sono presenti nei vasi portali e mesenterici, diversamente S. haematobium è presente nel plesso venoso vescicale. Le sindromi patologiche principali includono dermatite, febbre di Katayama e sequele croniche di tipo fibrotico-ostruttivo. Queste sindromi sono conseguenti e correlate a tre differenti stadi dello sviluppo nell’ospite dei parassiti: cercarie, vermi maturi ed uova. La penetrazione delle cercarie determina l’insorgenza di papule pruriginose, a cui segue un quadro dermatologico definito dermatite da schistosoma o prurito del nuotatore. I vermi adulti giunti a maturazione iniziano a depositare le uova e si sviluppa la febbre di Katayama o la schistosomiasi acuta. Alcune uova rimangono nell’organismo dell’ospite. Queste possono indurre la formazione di granulomi e danneggiamento dei tessuti che possono ostruire il flusso ematico portale verso il fegato ed il flusso circolatorio verso i polmoni, o quello urinario verso gli ureteri e la vescica. L’infezione da S. haematobium solitamente esordisce con ematuria30. L’infezione cronica da S. haematobium può evolvere in cancro della vescica35.



La diagnosi di laboratorio è ottenuta con il rilievo delle uova nelle feci (urine, o liquido seminale per S. haematobium). Possono inoltre essere esaminati frustoli rettali o biopsie. Sono disponibili prove sierologiche.

Distosomi epatici Opisthorchis (Clonorchis) sinensis

Le infezioni massive possono causare ostruzione localizzata dei dotti biliari e ispessimento delle pareti, ed anche colangite e colangioepatite37.

Fasciola hepatica

L’infestazione sviluppa due distinte fasi cliniche, corrispondenti alla fase migratoria epatica del ciclo vitale e quella di insediamento del verme nella sede finale, il dotto biliare37. La fase iniziale è caratterizzata da epatomegalia, febbre e dolore nel quadrante addominale superiore destro con ostruzione del dotto e conseguente cirrosi biliare.

Possono essere dimostrate uova nelle feci o nella bile. Sono disponibili prove sierologiche.

Distosomi intestinali

Questi includono Fasciolopsis buski, Heterophyes heterophyes, Nanophyetus salmincola, Metagonimus yokogawai ed Echinostoma species34,37. La maggior parte delle infezioni da F. buski sono asintomatiche. Infezioni massive possono causare diarrea, dolore addominale e malassorbimento. H. heterophyes causa dolore addominale e diarrea. L’infezione da specie Echinostoma è rara, ma è stata ben documentata. N. salmincola causa diarrea, dolore addominale, gonfiore ed eosinofila.

Distosomi polmonari

Specie Paragonimus I distosomi polmonari si incapsulano nel parenchima, di solito in prossimità dei bronchioli37. Le uova sono depositate e penetrano nei bronchioli dai quali sono espettorate. Possono essere ricercate nell'espettorato o, se sono ingerite, nelle feci. I pazienti sviluppano eosinofila e possono manifestare difficoltà respiratoria, espettorare escreato brunastro e presentare emoftoe intermittente. La parassitosi evolve in bronchite cronica o in bronchiectasie con espettorazione profusa e dolore pleurico toracico.

La diagnosi di laboratorio si avvale della dimostrazione microscopica di uova nell’escreato o nelle feci.

Cestodi (Tenie)

Generalmente la diagnosi di laboratorio dell'infestazione da cestodi è ottenuta con l’identificazione delle uova emesse con le feci. Saranno specificate le eccezioni. La preparazione del campione in soluzione fisiologica e/o iodica, seguita dalla concentrazione con formolo-etere consente il loro rilievo microscopico. La colorazione del sedimento può aiutare l’identificazione. Ha pure valore diagnostico il riscontro macroscopico delle proglottidi nel campione (consultare le Appendici 5 e 7).

Nell’uomo, le infestazioni da cestodi si presentano con una o due modalità: tenie mature nel tratto gastro–intestinale, o infestazione di una o più cisti larvali (definite idatidosi, cistocercosi, cenuriosi e sparganosi) insediate nel fegato, polmone, muscolo, cervello, occhio o in altri tessuti.



Diphyllobothrium latum

Noto anche come tenia del pesce, è riscontrato nelle acque fredde, limpide della Scandinavia, nel nord Europa, Giappone del nord, Canada, Alaska e Nord America. Le infestazioni sono di solito asintomatiche, il parassita può comunque raggiungere grandi dimensioni e causare ostruzione meccanica dell’intestino con conseguente diarrea e dolore addominale. Infezioni prolungate e massive possono indurre carenza di vitamina B1238.

Hymenolepis nana

E’ la tenia di più piccole dimensioni che infetta l’uomo. Può causare una moderata dolenzia addominale, ed è l’infezione umana da tenia più diffusa negli USA40. Sebbene l’uomo possa acquisire accidentalmente l’infezione con l’ingestione di coleotteri infetti (spesso presenti nei cereali disidratati) l’infezione diretta è la forma più frequente e di solito si riscontra nella comunità famigliari ed istituzionali con condizioni di scarsa igiene. Hymenolepsis diminuta, è principalmente un parassita dei topi ed occasionalmente dell’uomo che si infetta con l’ingestione dei coleotteri presenti nei cereali. Dipylidium caninum è di solito riscontrato nei cani e nei gatti. I bambini si infettano principalmente dopo contatto diretto con gli animali e le loro pulci.

Taenia saginata

Provoca dolenzia addominale e i pazienti possono emettere proglottidi migrate in sede anale38.

Taenia solium

Le forme adulte provocano scarsa sintomatologia, ma le larve causano infiammazione locale38. La loro migrazione nel sistema nervoso centrale causa crisi convulsive, idrocefalo e aracnoidite.

La cistocercosi è un’infezione dei tessuti causata da cisticerchi di T. solium38. La cisticercosi può svilupparsi nell’uomo con auotoinfezione dal verme adulto. Il coinvolgimento del sistema nervoso centrale è definito neurocisticercosi.

La diagnosi può essere ottenuta con metodi immunodiagnostici o bioptici39.

Coenurosi

E’ un’infezione cistica causata da Taenia multiceps, Taenia serialis (Europa ed USA) e Taenia brauni (Africa), che di solito si sviluppano in tenie nei cani38. La malattia sintomatica nell’uomo interessa occhio, sistema nervoso centrale, tessuto sottocutaneo e muscolare.

La diagnosi di laboratorio si avvale dell’esame microscopico di appropriati materiali in cui si possono riscontrare i protoscolici (simili a quelli di T. solium).

Spirometra mansonoides

La Sparganosi è un’infezione dei tessuti causata dalla Spirometra mansonoides. Si tratta di un’infezione tissutale da cisti pleiocercoidi causata da numerose specie di cestodi e i sintomi includono infiammazione locale della cute nel sito d’ingresso38. Il danno dei tessuti può essere grave, particolarmente nell’occhio, ed alcune forme del parassita diffondono in altre sedi corporee.

La diagnosi di laboratorio si avvale esclusivamente di tecniche istologiche.



Echinococcosi

L’echinococcosi si manifesta con due diverse modalità: idatidea o malattia cistica uniloculare, causata da Echinococcus granulosus o Echinococcus vogeli, e malattia cistica alveolare causata da Echinococcus multilocularis38. Le uova si schiudono per sviluppare oncosfere che penetrano nella mucosa intestinale ed entrano in circolazione. Queste si incistano nei visceri dell’ospite e sviluppano le forme larvali cistiche mature. La sintomatologia è conseguente ai loro effetti di tipo meccanico ed all’ingrandimento in spazi ristretti. La diagnosi di laboratorio si avvale di metodi immunodiagnostici ed occasionalmente della biopsia. Talvolta le cisti polmonari contenenti E. granulosus si rompono e i protoscolici e gli uncini intatti sono emessi con l’espettorato, riscontrati poi nei preparati microscopici. Sono disponibili prove sierologiche.

Informazione Tecnica/Limitazioni Limitazioni delle SMI del RU Le raccomandazioni formulate nelle SMI del RU sono basate su prove (ad esempio sensibilità e specificità), se disponibili, opinioni degli esperti e pragmatismo, tenendo in considerazione anche le risorse disponibili. I laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali, se appropriato. Prima del loro uso, i laboratori devono assicurare che tutti i saggi commerciali e in-house sono stati validati e sono idonei allo scopo

Contenitori per Campioni40,41 Le SMI usano Il termine '' contenitore a chiusura ermetica con marchiatura CE ” per descrivere quelli contrassegnati con la marchiatura CE per la raccolta e il trasporto dei campioni clinici. I requisiti per i contenitori dei campioni sono riportati nella Direttiva UE per i Dispositivi Sanitari Diagnostici in vitro (98/79/CE allegato 1 B 2.1) in cui si stabilisce:'' La progettazione deve c onsentire un'agevole manipolazione e, se necessario, ridurre per quanto possibile la contaminazione dei, e perdite dal dispositivo durante l'uso e, nel caso di recipienti per campioni, il rischio di contaminazione degli stessi. Le procedure di fabbricazione devono essere adatte a questi scopi''.

Test Diagnostici Rapidi

Sono disponibili numerosi metodi di identificazione rapida con diversa sensibilità e specificità. Queste tecniche possono avere potenziali vantaggi/svantaggi e devono pertanto essere valutate e validate prima dell'uso. I metodi molecolari (ad esempio PCR multiple) e i saggi immuno-enzimatico (EIA) possono funzionare meglio rispetto ai metodi tradizionali, e devono pertanto essere presi in considerazione per l'uso, se disponibili, previa validazione per garantire un’adeguata interpretazione clinica10,42.



1 Considerazini sulla Sicurezza40,41,43-57 1.1 Considerazioni sulla sicurezza40,41,43-46

Usare tecnica asettica Raccogliere in appropriati contenitori marcati CE a tenuta ermetica i campioni e trasportarli in sacchetti di plastica sigillati, tranne i vetrini con nastro adesivo/tamponi rettali per uova di E. vermicularis che devono essere trasportati in sacchetti di plastica sigillati1.

In caso di LCR ogni piastra seminata deve essere trasportata in un robusto contenitore impermeabile con marchiatura CE.

E’ essenziale la conformità alle normative postali e dei trasporti.

1.2 Procedura sul Campione40,41,43-46

Tutti i tipi di campione Livello di Contenimento 2, se non altrimenti specificato(consultare di seguito). Le procedure di laboratorio che si ritiene possano generare aerosol infettivi devono essere eseguite in cabina microbiologica di sicurezza49.

Per tutte le ricerche parassitologiche devono essere calzati guanti monouso

Fare riferimento alle attuali linee guida per la manipolazione sicura di tutti i microrganismi documentati in questa SMI.

Feci

E’ richiesto un livello di Contenimento 3 per le ricerche su specie Echinococcus e Taenia solium (non è indispensabile una cabina microbiologica di sicurezza).

Le proglottidi di tenia non trattate con conservanti inviate al laboratorio per l’identificazione sono pericolose per la possibilità di infezione accidentale e di cistocercosi58.

I campioni per la microscopia devono essere preparati con formalina 10% (v/v) in acqua (non idonea per la ricerca di trofozoiti).

Per ragioni di sicurezza deve essere usato etil acetato e non dietil etere per approntare le concentrazioni della soluzione formolo-etere26. Le procedure devono essere eseguite in un’area ben ventilata in assenza di sorgenti di fiamma non protetta.

LCR

Contenimento di Livello 3 ed è richiesta una cabina di sicurezza per l'indagine per Naegleria fowleri.

Tessuti, biopsie, cisti idatidea e pus da ascessi

Processare i campioni prelevati dal polmone e dalla cavità pleurica, e le cisti idatidee, in cabina di Classe 1 con scarico protetto in ambiente con Livello di Contenimento 3.

Espettorato/lavaggio broncoalveolare

Tutti i campioni devono essere processati in cabina di Classe 1 con scarico protetto in ambiente con Livello di Contenimento 3.



Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con le valutazioni del rischio. 2 Prelievo del Campione

2.1 Tipi di Campione

Feci, urine, vetrino con nastro adesivo, tampone perianale, LCR, bile, pus da ascessi, aspirati duodenali/digiunali, tessuti, cisti idatidea, espettorato/lavaggio broncoalveolare biopsie

2.2 Tempo Ottimale e Metodo di Prelievo59 Per considerazioni sulla Sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1 Raccogliere il campione prima dell’inizio della terapia antibiotica, se possibile59. Feci

Prima della terapia antibiotica o antidiarroica, quando possibile

Nastro adesivo per vetrino/tampone perianale per uova di E. vermicularis1

Fra le 10 del pomeriggio e mezzanotte, o al mattino presto prima della defecazione e del bagno.

Le feci possono essere inserite direttamente in un contenitore impermeabile sterile a bocca larga con marchiatura CE o possono essere trasferite da una padella asciutta e pulita o contenitore simile e poi raccolte in un contenitore impermeabile con marchiatura CE.

Trasportare immediatamente i campioni appena ottenuti, senza conservanti. Le cisti non si formano una volta che il campione è stato emesso. Se il campione è liquido, deve essere esaminato o fissato con formalina al 10% in acqua, preferibilmente entro 30 minuti dalla raccolta. I trofozoiti protozoari non sopravvivono se il campione si essica. La formalina al 10% uccide i trofozoiti e li rende immobili. Se si ricercano i trofozoiti le feci liquide dovranno essere esaminate in assenza di formalina (di solito con una goccia di fisiologica).

Le feci soffici dovrebbero preferibilmente essere esaminate entro 1 ora dall’emissione60.

Nastro adesivo/tampone perianale per uova di E. vermicularis1

Nastro adesivo Applicare il nastro adesivo alla regione perianale, premendo saldamente più volte il lato adesivo del nastro contro le pieghe perianali di sinistra e destra; il nastro può essere avvolto attorno a un abbassalingua per facilitare il prelievo. Posizionare il nastro adesivo sul vetrino, parte adesiva verso il basso.

Tampone perianale

Bastoncino di cotone in contenitore asciutto.

Divaricare le natiche e strofinare il tampone di cotone inumidito su tutta l'area circostante l'ano, ma non inserirlo nell'orifizio. Riporre il tampone di cotone lana nel suo contenitore (non è necessario un mezzo di trasporto).Talvolta, può essere raccolto dal paziente un verme adulto poi inviato in acqua o soluzione fisiologica per l'identificazione.



Urina (per S. haematobium)

È preferibile ottenere tutte le urine emesse dalle 10 di mattino alle 2 del pomeriggio(periodo massimo di attività), in alternativa, raccogliere la parte terminale di urina per 24 ore. E’ preferibile ottenere il campione completo di urine fra le dieci del mattino e le 2 del pomeriggio perché è stato dimostrato che in questo periodo si verifica la maggior concentrazione di uova escrete61. Utilizzare contenitori sterili senza acido borico. Nei pazienti con ematuria le uova possono essere intrappolate nel sangue e muco nella parte terminale del campione di urina.

Se l'urina non può essere esaminata entro un'ora dalla raccolta, si consiglia di aggiungere 1 ml di formalina non diluita per conservare tutte le uova eventualmente presenti.

LCR

I campioni devono essere prelevati da uno specialista, secondo i protocolli locali.

Tessuti, Biopsie, Cisti idatidea e Pus da ascessi, Bile, Aspirati duodenali/digiunali I campioni devono essere prelevati da specialisti secondo i protocolli locali

Espettorato/lavaggio brroncoalveolare È richiesto espettorato dal tratto respiratorio inferiore ottenuto con colppi di tosse profonda.. Quando la tosse è secca, prima di espettorazione possono essere utili fisioterapia, drenaggio posturale o l'inalazione di un aerosol

2.3 Quantità Adeguata e Numero Appropriato di Campioni59 Feci

Per una ricerca ottimale, raccogliere tre campioni di feci in non più di dieci giorni. Di solito si raccomanda che i campioni siano ottenuti a giorni alterni. Tranne i casi di pazienti affetti da diarrea grave o dissenteria, per i quali non dovrebbe essere analizzato più di un campione ogni 24 ore in quanto l’emissione delle cisti e delle uova tende ad essere intermittente.

Se si sospettano E. histolytica o G. lamblia ed il primo dei tre campioni è negativo, si consiglia di raccoglierne altri tre con intervallo settimanale.

Non sono previsti limiti definiti per il volume del campione richiesto, ma alcune procedure di laboratorio richiedono quantità superiori ad altre.

Vetrino nastro adesivo/tampone perianale per uova di E. vermicularis1

Si raccomanda il prelievo dei campioni per almeno 4 – 6 giorni consecutivi. Se i risultati di tutti questi campioni sono negativi il paziente può essere considerato non infetto. Nella pratica corrente, raramente si riceve più di un campione.

Urine (perS. hametobium)

In teoria, un volume minimo di 10mL.

LCR

In teoria, un volume minimo di 1 mL.




Pus

In teoria, tutto il pus ottenuto o un minimo di 1 mL.

Tessuti/biopsie

Quantità teorica di campioni sufficiente per preparati microscopici e colture.

Bile, Aspirati duodeno/digiunali


Espettorato/lavaggio broncoalveolare


3 Trasporto e Conservazione del Campione40,41 3.1 Condizioni Ottimali di Trasporto e Conservazione Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1 I campioni devono essere trasportati il più presto possibile59. Feci

Se non può essere effettuato un accertamento tempestivo delle feci, per evitare il deterioramento della morfologia dei protozoi, la schiusa delle larve del primo stadio degli anchilostomi e la crescita eccessiva dei lieviti è richiesto l’uso, come conservante, di formalina al 10% in acqua62.

Nastro adesivo per vetrino /tampone perianale per uova di E. vermicularis1

Refrigerazione o conservazione a temperatura ambiente (20 -25°C) fino a 48 ore.

Urine (per S. haematobium), Bile, Aspirati duodenali/digiunali ed espettorato/ lavaggio bronchiale

Se la procedura è ritardata, la refrigerazione è preferibile alla conservazione a temperatura ambiente (20 – 25°C)..


Se il campione di tessuto/biopsia è piccolo, inserirlo in acqua sterile per prevenirne l'essiccamento.

Se la procedura è ritardata, la refrigerazione è preferibile alla conservazione a temperatura ambiente (20 – 25°).

4 Procedura sul campione40,41 4.1 Selezione della prova Feci Selezionare una quota rappresentativa del campione per le appropriate procedure quali la coltura per batteri patogeni, prova per le tossine per Clostridium difficile (B 10 – nvestigation of Faecal Specimens for Clostridium difficile) ed esami virologici, in funzione delle caratteristiche cliniche del paziente



La concentrazione delle feci mediante centrifugazione con formolo/etere è approntata su tutti i campioni quando è richiesta specificamente la ricerca dei parassiti, ove esistono specifiche indicazioni cliniche e quando ritenuto opportuno dal referente senior del laboratorio. Tutti i campioni da soggetti sintomatici devono essere colorati per la ricerca di oocisti di Cryptosporidium63.

Colorare per microsporidi i campioni di pazienti sintomatici, HIV positivi ed immunodepressi dopo consultazione con un microbiologo/ricercatore.

Per tutti gli altri campioni N/D

4.2 Aspetto

N/D

4.3 Preparazione del Campione 4.3.1 Pretrattamento N/D

4.3.2 Procedura sul campione

Feci

Prelevare campioni da aree fecali contenenti sangue, pus o muco per l’esame diretto con preparato in sospensione o per colorazione.

Quando si campionano feci formate, prelevare il materiale da sedi diverse per concentrarli, per sospenderli in liquidi e per la colorazione.

Feci per la ricerca di protozoi

Standard

Se il campione è stato emesso di recente ricercare nel modo seguente i trofozoiti mobili:

1. Porre 1 goccia di soluzione fisiologica 0.85% sulla parte sinistra di un vetrino da microscopio pulito e sulla parte destra 1 goccia di colorante Lugol iodato a doppia concentrazione (la distanza fra le gocce deve essere tale da consentire di posizionare i coprioggetti su ciascuna di loro).

2. Per prelevare le feci usare un bastoncino con tampone diverso per ogni preparato ed emulsionarle vigorosamente nella soluzione fisiologica e nel colorante di Lugol iodato.

3. Ricoprire con coprioggetto ciascun preparato del vetrino. Esaminare entrambe le aree con obiettivo a basso ingrandimento. Utilizzare l’ingrandimento medio per identificare qualsiasi immagine sospetta.

4. Se opportuno, preparare strisci su vetrini da microscopio puliti per le colorazioni con auramina-fenolo e/o Giemsa (consultareTP 39 - Staining Procedures).

5. Inoltre concentrare il campione usando formolo-etere* come di seguito descritto.



Feci per esame di cryptosporidium60,64

1. Preparare uno striscio con materiale fecale di spessore sottile o medio su un vetrino da microscopio pulito.

Nota: Se il campione è secco o solido può essere aggiunta formalina al 10%.

2. Lasciare asciugare all’aria, fissare con metanolo per due-tre minuti.

3. Gli strisci possono essere colorati con auramina fenolo o con la colorazione di Ziehl-Neelsen modificata (consultare TP 39 - Staining Procedures).

Concentrazione formolo-etere* modificata65,66

*Usare etil acetato (non dietil etere) in un’area ben ventilata in assenza di sorgenti con fiamma non protetta

Il metodo seguente è raccomandato per concentrare le feci. Sono disponibili numerose confezioni commerciali per la concentrazione delle feci che si avvalgono del metodo di Ridley Allen di seguito descritto. Le confezioni commerciali per la concentrazione devono essere usate quando è richiesto un sistema completamente chiuso.

1. Prelevare un campione fecale delle dimensioni di un grosso pisello (circa 1g) con bastoncino con tampone ed emulsionare in 7 mL di formalina 10% (1 volume di formaldeide al 40% diluita in 9 volumi di acqua distillata) in un normale contenitore pulito.

2. Setacciare l’intero contenuto con colino normale (colino di nailon da te o garza quadrata) e raccogliere in un recipiente idoneo. I setacci sono sciacquati abbondantemente in acqua pulita e riutilizzati.

3. Trasferire il filtrato in una provetta di vetro o di polipropilene dotata di chiusura (resistente all’etere) idonea alla centrifugazione.

4. Aggiungere 3 mL di etil acetato e passare su vortex per 15 secondi, o agitare vigorosamente per 60 secondi.

5. Centrifugare il campione a 1500 x g per 60 secondi o a 1100 x g per 2 minuti.

6. Allontanare lo strato lipidico con un bastoncino con tampone passandolo attorno all’intera circonferenza della provetta, rimuovendo i residui lipidici dalla stessa.

7. Scartare il contenuto della provetta, lasciando che poche gocce si raccolgano sul fondo per ricoprire il sedimento rimasto.

8. Sospendere di nuovo il sedimento nel liquido rimasto. Trasferire una goccia di questo su un vetrino da microscopio pulito e applicare su di essa un coprioggetto.

9. Ad un preparato separato si può aggiungere colorante contenete iodio a doppia concentrazione per migliorare e facilitare il confronto delle caratteristiche morfologiche.

10. Ricercare con obiettivo a basso ingrandimento sull’intera area del preparato; usare medio ingrandimento per rilevare le caratteristiche morfologiche.

Le confezioni commerciali disponibili per la concentrazione contengono setacci con pori di varie dimensioni che influenzano la resa delle componenti parassitarie e la quantità di detriti presenti67-70. Una dimensione più grande dei pori può consentire in una resa maggiore delle componenti parassitarie, tuttavia l'incremento di detriti porta ad un deposito denso che rende più difficile l’osservazione sul vetrino e gli ovuli e le cisti possono essere quindi mascherate. Se la dimensione dei pori è troppo piccola, pur avendo un vetrino più pulito più facile da esaminare, la resa delle componenti parassitarie sarà ridotta. Le confezioni per la concentrazione fecale



disponibili in commercio devono essere validate prima dell'uso e devono essere seguite le istruzioni del produttore Per ottimizzare il recupero dei parassiti è importante setacciare la miscela fecale formolata, utilizzare un solvente acetato di etile con triton X e centrifugare per il tempo appropriato con forza di centrifugazione idonea68. Il recupero dei diversi stadi del parassita può essere notevolmente ridotto se non è usato un solvente come un estrattore di grassi e detriti (ad esempio acetato di etile)70. Uno studio recente suggerisce che 1.100 x g per 3 minuti può essere una soluzione ottimale per il rilievo del parassita70.

Vetrino con nastro adesivo

1. Prima di esaminare il vetrino, può essere opportuno sollevare il nastro ed inserire una goccia di olio per immersione o di glicerolo/alcool al suo centro, per poi riposizionarlo. Questo accorgimento migliora la trasparenza del nastro stesso.

2. Esaminare il vetrino con obiettivo a basso ingrandimento.

Tampone perianale

1. Aggiungere al contenitore sufficiente soluzione fisiologica per ricoprire il tampone.

2. Agitare vigorosamente.

3. Estrarre il tampone dalla soluzione fisiologica, spremerlo contro la parete del contenitore per allontanare la parte liquida. Scartare il tampone.

4. Concentrare il liquido restante con centrifugazione a 800 x g per 2 minuti.

5. Rimuovere il sopranatante con una pipetta monouso, senza agitare il sedimento.

6. Agitare la provetta per sospendere di nuovo il sedimento.

7. Usando una pipetta monouso, trasferire una goccia del sedimento su un vetrino da microscopio, applicare un coprioggetto ed esaminare l’intero preparato con obiettivo a basso ingrandimento.

Urine (per S. haematobium)

Campioni della parte terminale delle minzioni di 24 ore64

Per volumi consistenti di urine (>25 mL)

1. Lasciare sedimentare il campione per 1 ora.

2. Decantare e scartare il sopranatante trasferendo poi il sedimento con le urine residue (circa 1 mL) in un contenitore a fondo conico per la centrifugazione.

3. Centrifugare a 500 x g per 2 minuti

4. Decantare e scartare il sopranatante miscelando poi il sedimento con una pipetta.

5. Usando l’interro sedimento, trasferire 1 o 2 gocce su alcuni vetrini da microscopio e posizionare i coprioggetti. Esaminare l’intero preparato di ciascun vetrino con obiettivo a basso ingrandimento.

Altri campioni di urine Se il campione è gia stato raccolto in un contenitore a fondo conico, procedere come specificato precedentemente dal numero 3, altrimenti, trasferire l’intero materiale in un contenitore a fondo conico e procedere come specificato in precedenza.



Metodo di filtrazione (raccomandato per campioni di urine privi di cellule e di cristalli)

1. Inserire ≥10 mL urine in una siringa, connettere poi ad un filtro Swinnex (porosità 12 µm).

2. Filtrare delicatamente le urine.

3. Inserire 20 mL di aria facilitando il transito attraverso il filtro.

4. Rimuovere la parte superiore del filtro e trasferire la membrane su un vetrino da microscopio.

5. Aggiungere una goccia di soluzione fisiologica, applicare il coprioggetto e leggere al microscopio usando un obiettivo a basso ingrandimento.

LCT71

1. Dopo il ricevimento, eseguire l’esame microscopico diretto il più presto possibile (con obiettivo a basso o medio ingrandimento).

2. Centrifugare il LCR 100 x g per 10minuti.

3. Trasferire il sopranatante con un a pipetta sterile, lasciandone circa 0,5mL; è richiesto un altro contenitore sterile per le prove addizionali (concentrazione proteica, prove virologiche ecc.).

4. Sospendere di nuovo il centrifugato nel restante liquido e trasferire 2 gocce al centro di una piastra di agar purificato ricoperta di batteri

5. Quando il liquido si è assorbito incubare la piastra come descritto per il raschiamento corneale (descritto in precedenza).

Nota: L’incubazione a 35°C – 37°C fornisce risultati migliori per le specie Naegleria.

1 Trasferire anche una goccia del sedimento del centrifugato su un vetrino da microscopio pulito ed applicare su questa il coprioggetto. Osservare l’intera area con obiettivo a basso ingrandimento ed a medio ingrandimento per rilevare le caratteristiche morfologiche

Cisti idatidea e Pus da ascessi

Pus e contenuti di cisti idatidea (inclusa la sabbia idatidea).

Approntare preparati in sospensione ed asciugare all’aria gli strisci per la colorazione (se richiesta) (consultare B 39 - Staining Procedures).

Tessuti e biopsie71

1. Oltre alle preparazioni istologiche standard eseguire strisci per apposizione, preparazioni con lieve strofinamento e per schiacciamento.

2. Inserire il campione in una piastra di Petri sterile per l’esame macroscopico e selezionarne una parte per l’esame microscopico.

3. Selezionare un’area di aspetto diverso dal normale. Ad esempio, una parte grigia indurita o granulomatosa del polmone o un’area ulcerata del tessuto intestinale.

Strisci per apposizione 1. Se il campione e di dimensione sufficiente, tagliarlo ed appoggiare sul vetrino la

superficie di taglio.

2. Premere di nuovo il tessuto sul vetrino da microscopio pulito, alzare e premere di nuovo.



3. Riportare il campione sul vetrino e premere di nuovo la superficie di taglio per ottenere due altre apposizioni. Ciò consente 3 deposizioni allineate in successione su 1 vetrino da microscopio.

4. Se sono disponibili alcuni campioni di tessuto, effettuare una striscia per apposizione di ciascuno di loro.

5. Lasciare asciugare all’aria e fissare per 1 minuto in metanolo prima di colorare con Giemsa (consultare TP 39 - Staining Procedures).

Preparazioni con schiacciamento Preparazione per schiacciamento – per parassiti tissutali come la trichinella

1. Suddividere le quote di tessuti in minuti frammenti in una scatola di Petri,

trasferendone uno su un vetrino da microscopio pulito.

2. Aggiungere 1 goccia di soluzione fisiologica sterile o di acqua distillata sterile.

3. Ricoprire con un secondo vetrino da microscopio pulito e pressare entrambi con forza.

4. Esaminare al microscopio con obiettivo a basso ingrandimento.

Bile, aspirati duodenali/digiunali Standard

1. Centrifugare il campione a 800 x g per 2 minuti.

2. Decantare il sopranatante in disinfettante.

3. Sospendere di nuovo il sedimento del centrifugato nelle gocce restanti di sopranatante.

4. Usare il sedimento sospeso di nuovo per preparare strisci da colorare.

5. Colorare con Ziehl-Neelsen e auramina-fenolo per Cryptosporidium, Giemsa per Cyclospora cayetanesis ed I. belli (consultare TP 39 - Staining Procedures), e iodio o semplici preparati in sospensione per S. stercoralis and G. lamblia.

Prove supplementari

Per la ricerca di microsporidi: 1 Centrifugare il campione a 800 x g per 2 minuti

2. Decantare il sopranatante in disinfettante

3. Sospendere di nuovo il deposito del centrifugato nelle restanti gocce di sopranatante

4. Usare il materiale risospeso per preparare uno striscio da colorare

5. Colorare con tricromica modificata (consultare TP 39 - Staining Procedures).

Espettorato71

1. Per il campionamento selezionare aree viscose con colorazione ematica.

2. Trasferire 1 mL di espettorato in una provetta da centrifuga.

3. Aggiungere 1 mL di ditiotreitolo. Scuotere delicatamente per circa 10 secondi. Lasciare riposare a temperature ambiente per 15 minuti.

4. Centrifugare a 1500 x g per 2 minuti.

5. Decantare il sopranatante in un raccoglitore di materiali di scarto.



6. Sospendere di nuovo il sedimento nelle poche gocce di sopranatante rimaste.

7. Trasferire 1 goccia su un vetrino da microscopio pulito ed applicare un coprioggetto. Esaminare tutto il preparato con obiettivo a basso ingrandimento.

Espettorato indotto / BAL (per P. jirovecii)

Sono disponibili diversi metodi di colorazione e di identificazione per P. jirovecii. Possono essere usate colorazioni di tipo istologico, anche se i metodi d’immunofluorescenza con anticorpi monoclonali sono utilizzati in numerosi laboratori microbiologici. Se si utilizzano confezioni commerciali seguire le indicazioni del produttore. Ù

4.4 Microscopia Consultare la Sezione 4.3.2 per tutti i campioni

4.5 Coltura Consultare la Sezione 4.3.2 per tutti i campioni

4.6 Identificazione

Livello minimo Quando possibile, identificare i parassiti a livello di specie

4.7 Prova di Sensibilità agli Antimicrobici

Fare riferimento alle line guida della British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) e/o EUCAST

4.8 Invio per Ricerche su Focolaio Epidemico

N/D

4.9 Invio ai laboratori di riferimento Per informazioni sulle prove disponibili, tempi di risposta, procedure per il trasporto e altre richieste del laboratorio di riferimento, click here for user manuals and request forms. Microrganismi con resistenze insolite o inattese, o qualora sussista un problema clinico o di laboratorio, o anomalie che richiedano approfondimenti devono essere inviati agli appropriati laboratori di riferimento. Contattare l’appropriato laboratorio nazionale di riferimento per informazioni sulle prove disponibili, tempi di consegna, procedure di trasporto ed eventuali altri richieste per ‘invio del campione: Inghilterra e Galles

http://www.hpa.org.uk/webw/HPAweb&Page&HPAwebAutoListName/Page/1158313434370?p=1158313434370

Scozia

http://www.hps.scot.nhs.uk/reflab/index.aspx

Irlanda del Nord

http://www.publichealth.hscni.net/directorate-public-health/health-protection



5 Procedura di Refertazione 5.1 Microscopia Refertare qualsiasi parassita osservato

Feci

Includere il commento per tutti i parassiti osservati, anche di quelli che di solito non sono considerati patogeni.

Tempo di refertazione microscopia Referto scritto 16 – 72 ore, specificando, se opportuno, che sarà emesso un successivo referto.

Risultati microscopici urgenti: comunicare per telefono quando disponibili.

5.2 Coltura LCR Refertare presenza o assenza di specie Acanthamoeba e/o di Naegleria fowleri. Tempo refertazione coltura

LCR Referto scritto dopo 4 giorni, specificando, se appropriato, che sarà emesso un referto successivo

Risultato clinicamente urgente; telefonare quando disponibile.

5.3 Coltura

Refertare le sensibilità come clinicamente suggerito. Usare in modo prudente gli antibiotici secondo i protocolli locali e nazionali raccomandati

6 Notifica alla PHE72,73 o Equivalente74-77 Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella Scheda 2 della Direttiva. Le denunce devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica, entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro sette giorni. Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della PHE. Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad agenti causali soggetti a tale disposizione. La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non sostituisce l’informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di alcuni tipi d’infezione. Queste iniziative devono continuare.



Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione per Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare Associated Infections e HCAIs e Creutzfeldt–Jakob disease CJD da includere nel ‘Notification Duties of Registered Medical Practitioners’, e non al ‘Notification Duties of Diagnostic Laboratories’. http://www.hpa.org.uk/Topics/InfectiousDiseases/InfectionsAZ/HealthProtectionRegulations/

In Scozia74,75 e Galles76 e Irlanda del Nord76 sono vigenti altre disposizioni.



Appendice 1:Tipologia dei campioni e possibili parassiti identificabili

Tipo di campione

Possibile parassita presente

Bille

Fasciola hepatica, Opisthorchis sinensis, specie Cryptosporidium

LCR

Specie Acanthamoeba, Angiostrongylus cantonensis, Balamuthia mandrillaris, Microsporidia - Encephalitozoon cuniculi, Naegleria fowleri

Aspirati duodenali e del digiuno

Specie Cryptosporidium, Cyclospora cayetanesis, Giardia lamblia, Microsporidia - Enterocytozoon bieneusi, specie Strongyloides

Feci

Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides, forme adulte ed uova di specie Acaris, Balantidium coli, Blastocystis hominis, Capillaria philippinensis, Chilomastix mesnili, specie Cryptosporidium, Cyclospora cayetanesis, Dientamoeba fragilis, Diphyllobothrium latum, specie Echinostoma, Endolimax nana, Entamoeba histolytica, Altre specie Entamoeba, Enteromonas hominis, Fasciola hepatica, Fasciolopsis buski, Giardia lamblia, Heterophyes heterophyes, Hymenolepis nana, Iodamoeba butschlii, Isospora belli, Microsporidia [Enterocytozoon bieneusi ed Encephalitozoon (Septata) intestinalis], Metagonimus yokogawai, Nanophyetes salmincola, Necator americanus, Opisthorchis sinensis, specie Paragonimus, Retortomonas intestinalis, specie Sarcocystis, specie Schistosoma Strongyloides stercoralis, Taenia saginata vermi ed uova, Taenia solium, Trichuris trichiura, specie Enterobius vermi adulti ed uova

Aspirati epatici e spenici

Entamoeba histolytica, specie Leishmania, Echinococcus granulosus

Vetrino con nastro adesivo

Enterobius vermicularis

Sierologia

Entamoeba histolytica, specie Acanthamoeba, Cysticercosis, Echinococcus granulosus, Entamoeba histolytica, Fasciola hepatica, Filaria, Giardia lamblia, specie Leishmania, specie Schistosoma, Strongyloides stercoralis, specie Toxocara, Toxoplasma gondii, specie Trichinella, ogni nematode che produce LMV (Larva Migrante Viscerale)

Escreato

Ascaris lumbricoides, specie Cryptosporidium, specie Microsporidia, Paragonimus westermani, Strongyloides stercoralis

Tessuti e biopsie

Tessuti e biopsie specie Acanthamoeba – biopsia cerebrale, noduli cutanei ed ulcere; Angiostrongylus costaricensis, specie Anisakis, specie Cryptosporidium – intestine tenue e biopsia epatica; Vermi filariali , Giardia lamblia - biopsia duodenale; Specie Leishmania – biopsie linfonodi, ulcere cutanee; Microsporidia [Pleistophora, Nosema, e specie Phocanema], specie Schistosoma, Taenia solium, Trichinella ed altri nematode tissutali – biopsia muscolare

Urine

Schistosoma haematobium



Appendice 2: Distribuzione geografica delle Infezioni parassitarie

Infezione / Microrganismo infettante Distibuzione geografica

Entamoeba histolytica Amebe a vita libera - Acanthamoeba, Naegleria Giardiasi, trichomoniasi Cryptosporidiosi Cyclospora, Microsporidia, Cystoisospora Sarcocystis, toxoplasmosi, Pneumocystis jovecii Infezioni da nematodi (Tratto-GE) - Enterobius, Trichuris Ascaris Strongyloides, Anchilostomia: Ancylostoma duodenale Necator americanus Trichinellosi, toxocariasi Gnathostomiasi (febbre & infiltarti polmonari) Gnathostomiasi, Angiostrongylus sp. mieloencefalite) Capillariasi Dracunculiasi Onchocerciasi Schistosomiasi Opisthorchiasi Fascioliasi Paragonimiasi Diphyllobothrium latum Hymenolepsis nana, taeniasi, cystercercosi Echinococcosi Sparganosi Coenurosis

Ovunque Ovunque Ovunque Ovunque Ovunque Ovunque Ovunque Ovunque Tropici & subtropici Europa, S America, India, China, SE Asiatico, Indonesia, Australia, alcune isole del Pacifico Nord e Sud America, Africa sub Sahariana, India, Cina, SE Asiatico, Indonesia, Australia alcune isole del Pacifico Ovunque Asia Africa, America, Asia, Australasia Africa, America, Asia, Europa Africa, Asia Africa, America (centrale e del sud ), Asia Africa, America (centrale e del sud), Asia America (sud), Asia, Europa Ovunque Lontano oriente, subcontinente Indiano, Africa, alcune isole del Pacifico America (nord), Canada, Europa, Giappone, Russia, Scandinavia Ovunque Africa, America, Asia, Europa, Australasia America, Asia (particularmente Cina & Giappone) Africa, America, Europa



Appendice 3: Calibrazione del microscopio per misurazione Calibrazione del microscopio per misurazione2 La dimensione dell’uovo e della cisti è un’importante peculiarità per l’identificazione di molti parassiti. La dimensione può essere determinata usando un oculare micrometrico. Eseguire la calibrazione del microscopio nel modo seguente: La strumentazione richiesta comprende un oculare micrometrico e di un vetrino micrometrico. 1 La scala dell’oculare è suddivisa in 100 piccole parti. 2 La scala del vetrino micrometrico misura 1 mm ed è divisa in parti di 0.1 mm, ciascuna

delle quali è ulteriormente suddivisa in parti di 0,01 mm.

3 Inserire l’oculare micrometrico sostituendolo a quello del microscopio. 4 Porre il vetrino micrometrico sul piano portaoggetti del microscopio. 5 Mettere a fuoco con obiettivo a basso ingrandimento la scala micrometrica del vetrino. 6 Aggiustare le scale micrometrica dell’oculare e quella micrometrica del vetrino in modo che

appaiano parallele e sovrapposte. 7 Registrare il numero di divisioni della scala micrometrica dell’oculare e quelle

corrispondenti alla scala micrometrica del vetrino, ad esempio 10 segmenti della micrometrica oculare = 0,20 mm della micrometrica del vetrino.

8 Calcolare il valore di un segmento della scala micrometrica oculare nel modo seguente:

10 divisioni della micrometrica oculare = 0.20 1 divisione micrometrica oculare = 0.20/10 = 0.020 mm = 20 μm

9 Ripetere da #5 con ogni obiettivo, registrare i risultati per ciascuno di loro. 10 Eseguire una sola calibrazione per ogni microscopio, suoi obiettivi ed oculare micrometrico

in dotazione.



Appendice 4: Comuni costituenti microscopici delle feci72

Componenti microscopici delle feci

1-4. cellule vegetali. 5. Parete spiraliforme del sistema vascolare vegetale. 6. ciuffo vegetale. 7. parete di cellulosa di cellula vegetale. 8 grano di polline. 9. bolla d’aria. 10 gocce di grasso. .11. fibra muscolare. 12 lieviti. 13 larva rabditiforme di Strongyloides stercoralis e 14. uovo di anchilostoma per confronto,



Appendice 5: Dimensioni Comparative delle Uova di Elminti1*



Appendice 6: Oocisti di Coccidi

Cystoisospora belli 1

Oocisti immatura (32 x 16 µm) Oocisti matura Le oocisti sono trasparenti. Si raccomanda illuminazione moderata. Per strisci diretti si può usare la colorazione Ziehl-Neelsen modificata Specie Cryptosporidium

Oociste 5µm Sono raccomandate le colorazioni auramina – fenolo e Ziehl-Neelsen modificata

Specie Cyclospora (CLB)

8-10 µm assenza di spore presenza di spore

Nella preparazione in sospensione liquida non colorata, una morula centrale contiene alcune sfere rifrangenti. In acqua dolce la morula si divide in 2 piccole strutture. Cyclospora cayetanesis può essere osservata nelle concentrazioni formolo-etere in forma di sfere rifrangenti che non si colorano con iodio ma presentano caratteristiche variabili all’acido resistenza, assumendo o non colore rosa alla colorazione Ziehl-Neelsen modificata. Non si colorano con auramina – fenolo. Sono blu autofluorescenti a 340 – 360 nm

1-2 µm

Anche se i microsporidi possono apparire acido-resistenti alla colorazione Ziehl-Neelsen modificata, si raccomanda la colorazione tricromica. Le spore dei Microsporidi sono ovoidali e rifrangenti e la parete delle spore assume colore rosa rosso brillante. Talvolta le spore si colorano con un cintura 'rossa che attraversa il centro della spora, mostrano granuli polari; entrambe le formazioni sono di valore diagnostico



Appendice 7: Confronto fra Elminti riscontrate nell’uomo79

Taenia solium (tenia del maiale)

Taenia saginata (Tenia del bue)

SEGMENTO MATURO (SIMILE IN CIASCUNA SPECIE) Segmento gravido

Più lungo che largo 7 – 12 branche uterine laterali 12 x 6 mm

Segmento gravido

Più lungo che largo 15 – 30 branche uterine laterali

16 – 20 x 5 - 7 mm Aspetto di segmenti gravidi di tenia riscontrati nell’uomo.

T. saginata T. solium D. latum H. nana



Appendice 8: Larve di Elminti – charatteristiche80

Anchilostoma Larve filariformi Dimensione 500 x 14-20 μm Guaina presente Affusolate Esofago lungo un terzo del corpo Larva rabditiforme Dimensione 100 - 150 x 15 - 17 μm Profondità cavità buccale – 15 μm Esofago lungo un terzo del corpo con due rigonfiamenti Abbozzo genitale piccolo – 7 μm Poro anale a 80 μm dall’estremità caudale

Strongyloides Larve filariformi Dimensione 500 x 14-20 (m Guaina assente Aspetto smussato o ramificato Esofago lungo metà del corpo Larva rabditiformi Dimensione 200 - 300 x 15 -18 μm Breve cavità buccale – 4 mμ Esofago lungo un terzo del corpo con due rigonfiamenti Abbozzo genitale grande – 22 μm Poro anale a 50 μm dall’estremità caudale

Nei campioni di feci emissi di recente, le larve di più frequente osservazione sono le rabditoidi di Strongyloides stercolaris. Se le feci sono state emesse da 12 ore, le larve possono trasformarsi in larve filariformi che devono essere differenziate da quelle di anchilostoma (queste possono comparire nelle feci entro 12 - 24 ore). Larve di elminti

ANCHILOSTOMA STRONGYLOIDES filariforme rabditoide rabditoide filariforme

Cavità buccale

Abbozzo genitale



Appendice 9: Identificazione di Trofozoiti di Amebe in Strisci colorati1 Trofozoite con o senza cromatina nucleare periferica con cromatina senza cromatina nucleare periferica nucleare periferica citoplasma grossolanamente citoplasma finemente un nucleo due nuclei in più del

granulato granulato, globuli rossi in tutti I trofozoiti 50% dei trofozoiti batteri & lieviti assenti o presenti

globuli rossi assenti batteri assenti nucleo con nucleo senza grandi zolle di granuli periferici granuli periferici cromatina in grande endosoma spazio chiaro

Entamoeba coli dimensione >15 μm � � dimensione 8-15 μm

endosoma piccolo. granuli

periferici nel nucleo a disposizione regolare

dimensione 15 – 60 μm

endosoma

grande irregolare

Dientamoeba Fragilis

dimensione 5 -15 μm



Appendice 10: Balantidiun coli – Trofozoite e Ciste1

Balantidium coli trofozoite Balantidium coli ciste

Appendice 11: Identificazione di Cisti di Amebe e Flagellati Ciste

con filamenti dentro senza filamenti, ciste flagellata cisti amebica forma a pera forma di limone 1 nucleo 1 nucleo dimensione dimensione 4 -7 µm 5-9 µm

cisti ovale parete spessa

dimensione dimensione 4 – 10 µm 10 - 14 µm da 1 a 4 nuclei corpi parabasali di solito 2 nuclei) 2 -4 nuclei posti ad una estremità

cromatina nucleare periferica a ssente

4 nuclei grandi nuclei grandi masse di cromatina eccentrici vacuoli colorati con iodio

presente cromatina nucleare periferica

dimensione dimensione dimensione < 10µm 10-15 µm 15-30 µm 1, 2, o 4 nuclei 2 o 4 nuclei 5 o più nuclei zolle di glicogeno zolle di glicogeno

1. 2 o 4 nuclei 4 nuclei con presenza zolle di glicogeno di cromatina periferica



Appendice 12: Microfilarie riscontrate nell’Uomo1

Con guaina

nel sangue nella cute

Senza guaina Senza guaina

Nuclei estesi fino nuclei non estesi all’estremità nuclei estesi fino nuclei non estesi nuclei estesi all’estremità nuclei non estesi all’estremità caudale caudale, spazio cefalico lungo all’estremità caudale all’estremità caudale caudale, filaria piccola, all’estremità caudale quanto largo coda smussata filaria piccola, sottile sottile, estremità ad uncino filaria sottile

Coda gonfia con 2 nuclei distinti, spazio

cefalico di doppia lunghezza rispetto al

corpo

Coda uniforme, spazio cefalico lungo

quanto largo

Con guaina Senza guaina Spazio cefalico Poro anale cellula R1

Guaina cell R4 cell R3 cell R2

Anello nervoso Polo escretorio Cellule escretorie



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Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno Unito · Cystoisospora belli (in precedenza...

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