Relazione Short-term mobility (2009)

Proponente: Dott.ssa Agata Gambacorta

Fruitore: Dott.ssa Laura Dipasquale

Titolo programma:

Clonaggio ed espressione di un'invertasi dal batterio produttore di

idrogeno Thermot o ga ne ap o litana

Periodo soggiorno: 15 Marzo - 5 Aprile 2009

Sede soggiorno: Station Biologique, Vegetaux Marins et Biomolecules, Roscoff (France)

Durante il periodo di studio svoltosi presso la Stazione Biologica di Roscoff la Dott.ssa

Laura Dipasquale ha frequentato il laboratorio della Dott.ssa Mi{am Czjzek per svolgere il

programma di ricerca dal titolo: "Clonaggio ed espressione di un'invertasi dal batterio

produttore di idrogefio Themntogn neapolituna" .

A tale scopo è stata studiata la possibilità di clonare ed esprimere il gene che codifica per

l'enzima invertasi da Therfiotoga rcapolifono (un batterio madno termofiÌo anaerobio

produttore di idrogeno studiato dal gruppo proponente nell'ambito del progetto FIRS"Metodologie innovative per la produzione di idrogeno da processi biologici" finanziato

dal MIUR 1756-2005) nell'ospite Esciericila roli.

Per Ìo svolgimento del suddetto progetto, è stato estratto il DNA genomico da T,

,rcnpolít ni a partire da 0.7 g di cellule liofile (corrispondentì a circa 5 g di cellule umide)

mediante il seguente protocollo:

- sospendere le cellule in 10 mL di Tris-HCl 50 mM, saccarosio 25%, pH 8.0;

- aggiungere 2 mL di Tris-HCl 50 mM, EDTA 5 mM, NaCl 50 mM, pH 8.0;

- aggiungere 20 mg di lisozima;

[\/.-ff

- aggiungere 5 mL cli EDTA 500 mM pH 8.0 fino ad una concentrazione finale 100

mM;

- poÍe in ghiaccio, agitando a intervalli regolari, fino a quando la soluzione diventa

limpida;

- aggiungere 2 mL di SDS 20% fino ad una concentrazione finale 2% ed agitare

manualmente;

- aggiungere 10 mL di lysing solution (Tris-HCl 50 mM, EDTA 100 mM, NaCl 100

mM, pH 8.0);

- aggiungere 500 !g/ml- di proteinasi K e incubare per l h a 50"C;

- raffreddare in ghiaccio e aggiungere perclorato di sodio 5 M fino ad una

concentrazione finale 1 M;

- aggiungere 1:1 una rniscela di fenolo equilibrato (50%) (agitare il tutto) e

cloroformio - alcol isoarnilico (24:1) (50%);

- agitare per ottenere una miscela omogenea e poi centrifugare a 10000 g per 30 min a

20'c;- recuperare la fase acquosa supe ore e aggiungere 1 volume di cloroformio - alcol

isoamilico (24:1);

- agitare per ottenere una miscela omogenea e poi centrifugare a 10000 g pet 5 min a

20"c- recuperare la fase acquosa superiore e aggiungere lentamente 2 volumi di etanolo

puro. Successivamente mescolare le due fasi utilizzando una bacchetta di vetro a

cui rimangono adesi gli acidi nucleici;

- il pellet così ottenuto e ancora adeso alla bacchefta è lavato prima con etanolo 70% e

poi con etanolo pulo. Successivamente, sempte sulla bacchetta, si lascia seccare il

pellet all'aria;

- quando il pellet si è seccato, lo si dissolve in Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0.

Successivamente si quantificano gli acidi nucleici mediante lettura spettrofotometrica

nell'intervallo 220 - 300 nm: in tal modo è ottenuta una concentrazione par. a 17 pg/ mL.

Mediante elettroforesi su gel di agarosio 0.8% viene controllata l'effettiva purezza del

DNA e il suo grado di integrità (Fig. 1).

, ,ah-- t

l ig . I ( . .1 ( l i ngnfosro ( (18 ' , ) o t r f r \ . r r ,

l n r r Ì l f r r l ù , 1 ( i r ù t f e n ( l ( l ù ì D ì n r . n l L J L L ) \

. r l t fn fs i ì ìur ì ì inrnrc L \ . l ì f nrL,shr rù, lh l i rNì | lo Srnrr i l . ì r { r l . ì

\ , h f \ .nno (1. ì l l t l0 l l . r l l ]1r L. f r r f f lL f . rLt11, l r ì r t i l l ) \ , \ { r f , ,Jr r , , ,

f ( l r , ì i lo L l . i . , / r l r t , , t r l , r / , r

. \ qufshr punkr i l gt 'nonr.r è Lrsnto acìììe "stanìpo" pet la l l tazione rl i Polintr:r ' izz.rziLrnt, e

C,rier ' ìn ( l l ì l \ ùìer. lsr Chain l lcaci ion, P.C.R.), lccnic.r chL'frr. \ ' .d(. l ' ,rnrpl i f icazione cl i Lrn,r

scqufnza rl i ì)N,\ (nel rìostr(r c.s.ì r. leì gene che corl i f ic.r pcr l 'errzinra ìnvt:rtasì) r i i rui - i

r ()Ì ìosarrÌìo le setluenzt'rìr lalr(rt i( l ialìc alcgl i estrcnìi . I)cr la rt,al izzazìone Llel la P.l. l ì . c

nfae!safi( l t \ efe:

l ) \ . \ . ( )nh 'ncn t r ' l n 5 r \L r r ' r ì / n dn . ì r rp l i f i c . ì re (20 { l o J t l L l ng l ;

( l \TP (0 .1 n r \ l ) , o l l c l o r L l csoss i r i bonuc l co t i d i t r i f os f . r t i , q r r . ì l i A I I r , ( l lP , ( , 1P ,

TTP, usd t i . on ì r c0bs t r , l t o f a r l n r r ' nz ì ( )ne d i f o l i ì l ì e r i / / J r i o r ìe ;

due specifici primer (ciascuno 1 pM), che sono sequenze di oligonucleotidi

complementari agli estremi delÌa sequenza da amplificare;

un enzima termostabile con attività DNA polimerasica, che nel nostro caso è la P/z

DNA polimerasi (1.5 U), che è estratta dall'archeabatterio ipertermofrlo Pyrococcus

,furiosas DSM 3638 e non denatura ad alte temperature. Tale enzima oltre ad avere

un'attività polimerasica 513'possiede anche un'attività esonucleasica 315' nota

anche come "proofreading activity" ovvero di "correzione delle bozze";

MgClr 2.5 mM;

una soluzione tampone (1 x) contenente Tris-HCl 200 rnl4, KCI 100 mM, (NH.r)zSOr

100 mM, MgSOr 20 mM, BSA priva di nucleasi 1 mg/ml, Triton X-100 1%, pH 8.8.

Tale soluzione è necessaria per riprodurre le condizioni fisiologiche ottimali per il

funzionamento della DNA poÌimerasi. La miscela di reazione ha un volume di 50

UL e tutte le concenhazioni indicate sono quelle finali.

t a P.C.R. si realizza attraverso una se e di cicli ognuno dei quali è composto dalle tre fasi:

denaturazione: la soluzione di DNA da replicare, insieme ai desossidbonucleotidi

trifosfati, ioni magnesio, prirners e DNA polimerasi, viene portata a una

temperatura di 95"C per 30 sec. Ciò causa l'apertura della doppia elica del DNA,

che quindi si presenta come singolo filamento;

annealing: successivamente la temperatuta viene abbassata fino a 55 C per 30 sec al

fine di permettere I'appaiamento dei primers alle regioni complementari presenti

sui filamenti di DNA precedentemente denaturati;

estensione: la temperatura viene innalzata fiîo a 72C per 4 min al fine di

massimizzare l'azione della DNA polimerasi che determina un allungamento dei

primers utilizzando i desossiribonucleotidi tdfosfati come substrati e il singolo

filamento di DNA come stampo (Fig. 2).

Il ciclo descritto viene ripetuto per 35 volte.

PCR : Polymcrasc Chain Rcacliotr

'i:/',Yi/ i-l^L\r \\1 l ' ' n , ' ' . ,n ú , , - , 1 . , " ,. l-rr--L-ri--r/4.u $l-..r LLLI - ,.\

'r'rnfrrÌ I r fa fÈn1îTlfr îirrif I .L r , I -L r_. _t

r.'rirì-ír, y ,rh. L{a--rJ _l,1,Lr LÉ.r _rr- /{.

'lnffnfTrrìr r_frm.Ínnrr r rn-l1 '

mllrrr | 'Lr--! ---{,Jr -r1{ L ! L!, '1

Fi& 2 - Schema della Polymerase Chain Reaction (P.C.R.)

Al fine di disegnare i primerc necessa per l'amplificazione genica, sono state studiate e

confrontate la sequenza N-teminale dell'invertasi isolata, purificata e carattedzzata da T.

neapolitana con le alhe proteine presenti nelle pdncipali banche dati (EMBL, Swiss Prot,

NCBI, ecc) e, in particolare, si è ottenuta un'omologia pari al 100% con una soÌute-binding

proteifr famiglia 1, da Thermotoga petrofla RKU-1 (accession number A8Q46972). In Fig. 3

è riportato l'allineamento, ottenuto mediante il programma BLAST, delle due sequenze in

questione e l'intera sequenza amrninoacidica della proteina da T . petrophíla:

' t è t ) p . . r j j 8 . 1 9 " x r r a c " r t u a o , . . - o o i s p r o r p , n f r r e , n o o s " p e ! r o p , ì dnxu r l

I t , lABQ4t ,9 - - .1 l9 ex t race l l ! la r so lu te -b ìnd ing p lo te in , fami ly 1 IThermotoga pe t roph i laRXo-r I

: : N t . D : I 0 _ l - i r x r r d . è ì L t e 5 0 - ( è - b _ n d r n q D r o i é r nIThermotoga pe t roph i la RKU- l l

S c o l e = 6 4 . 3 b i t s ( 1 4 4 ) , E r p è c t = 1 é 0 9I d e n t i t i è s = 2 A / 2 4 ( 7 O O 1 l , P o s i t i v e s = 2 A / 2 4 l l A A \ ) . c a p s = 0 / 2 0 ( 0 1 )

Oùèry 1 VXITMTSGGVGKELEVI,KKQ 20VKlÎMTSGGVGKELEVÌ-KKQ

SbJCt 2O VXITMTSGGVGKELEVI ,KKQ f9

1 mkky fv l l la v l l vgq t fav k i tn tsggvq ke lev Ìkkq l en fhqqypd i ever ipmpds61 s te rhd Ìyv t y faaqeEdpd v lmldv i rpa e fap f led l t adkdy fe lqe f lpg tvmsvt

1 2 1 v n g f - \ a \ p t r t L d a q l l y l r k d l l - \ \ 9 y d ' r d p ' ! w d e l v e m d k k i s q d e g l 9 ' v w q q d181 ryeg lvcd f I ey lHs fgqdv Ldesqkvv id speavaaÌq f nvd l i ykhkv tpegv t t lme241 edar ! i fqng eav fmrnwpy a Ís lvnsdes p ikgkvgvap Ìpmqpgqr ra a t lgqwvÌ9 il0 t nk fsspeeke dakk Ì ik f ÌE sydqq lyka i nagqnpt rka vykdpk lkea ap fnve l lgvl 6 l f i r a l p r p r v a n y t e v s d v i q r y v h a a l t r q t t p e d a i k n i a k e l k f l l q q

5 d.À-

Conoscendo la sequenza nucleotidica del gene codificante per tale ptoteina in T. petrofln

RKU-1 è stato quindi possibile disegnare i seguenti pdmers, sia forward che reverse, le cui

sequenze nucleotidiche sono, rispettivamente:

5' CCC-CCC-ATG-CAT-TIA-CTG-TCC-AAG-CAG-GAA.TTT-GAG-CTC 3'

5' CCG-GCG-CTC-GAC-GTG-AAA-ATC-ACT-ATG-ACA-TCT-GGA-GGA 3'

Con l'ausilio dei primers sintetizzati è stata allestita una prima P.C.R. e i campioni da essa

ottenuti sono stati poi esaminati su un gel di agarosio 0.8%, ma non si è osservata la

presenza di alcuna banda di interesse. A11o scopo di trovare le migliori condizioni pel

l'amplificazione del gene d'interesse, sono state modificate le concentrazioni di alcuni

reattivi impiegati per la P.C.R., ma ciò non ha comunque portato ad alcun risultato

positivo.

A questo punto si è effettuata una purificazione del DNA mediante gradiente di CsCl. Tale

procedura prevede:

l'aggiunta in tubi opportuni di CsCl 816.5 mg/mL;

successivamente si aggiungono circa 6 mL di Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0

per far sciogliere il sale, 1 mL di campione (pari a 1.7 mg di acidi nucleici) e 900 UL

di bromuro di etidio. Si aniva al volume finale di 12 mL aggiungendo il tampone

precedentemente utilizzato e stando attenti ad eliminare le eventuali boÌle plesenti;

si cenhifuga a 45000 g pe 18 h a 20 'C;

successivamente si osserva con una larnpada UV la presenza della banda di DNA

(l'eventuale RNA precipita sul fondo, mentre le proteine formano un velo in

superficie);

mediante una siringa si procede alla rimozione della banda di DNA;

il bromuro di etidio è successivamente allontanato dal DNA grazie all'utilizzo di

una soluzione di butanolo saturato con acqua/ che è aggiunto 1:1 al campione di

acido nucleico. Dopo aver agitato per rendere il tutto omogeneo, si osserva la

presenza di una fase superiore fucsia - rosa (contenente il bromuro di etidio) e una

fase inferìore acquosa (contenente il DNA);

S$-

- quest'operazione è ripetuta vade volte, fino a quando le due fasi non sono

perf ettamente incolori;

- successivamente il DNA è precipitato mediante l'aggiunta di due volumi di HzO

(per diluire il CsCl), acetato di sodio con una concenhazione finale di 300 mM e due

volumi di etanolo puro freddo. I campioni così ottenuti si pongono a -80oC per t h;

- poi si centdfuga a 10000 rpm per 30 min a 4'C e il pellet così ottenuto è Ìavato con

etanolo 70%, nuovamente centrifugato a 10000 rpm per 5 min a 4oC, poi seccato

all'aria e ripreso in Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0;

- si lascia dissolvere a temperatura ambiente, dopo di che si procede alla

determinazione quantitativa del DNA mediante l'utilizzo del NanoDrop

Instrument (che permette di determinare la concentrazione di acidi nucleici usando

piccolissimi volumi): la concentrazione ottenuta è di 2O0 ng/ pL. Tale campione è

stato anche analizzato su gel di agarosio 0.8% per verificame l'integrità.

Con il campione così ottenuto si ripete la P.C.R., utilizzando queste miscele di reazione

(tab.1):

1

DNA 200 ng 200 ng 400 ng 400 ng

Primer forward 100 uM 1 s M 1 I M 1 É M 1 ! M

Primer teverse 100 uM 1 t l M 1 } l M l u M 1 p M

dNTP 10 mM 0.2 mM 0.2 mM 0.2 mM 0.2 mM

Buffer 10 x 1 x 1 x 1 x

MgClz 25 mM 2.5 mM 2.5 mM

Enzyúe 3 U/pl 1.5 U 1.5 U 1.5 U 1.5 U

HzO a50 l r l a 5 0 t l a 5 0 p l a 5 0 l l l

Step Tempelatura Tempo Nurnero di cicli

Denaturazione

iniziale

95.C 2 min I

Denaturazione 95'C 30 sec

35Annealing 50"c 30 sec

E6ten6ione 72"C 4 min

Estensione finale 72"C 10 min 1

4 .C indefinito 1

Il programma utilizzato per la PCR è (tab. 2):

I vaÌi campioni provenienti da P.C.R. sono stati poi esaminati su gel di agarosio 0.8%:

come è possibile notare dalla fig. 4 tutte le miscele di reazione hanno prodotto dei

frarrmenti di amplificazione. In pa.rticolare, si osserva la presenza di più prodotti di

reazione in presenza di MgClz e invece di un solo prodotto di reazione in assenza di taìe

sale. Infatti molto interessanti sono apparce le miscele 1 e 3 contenenti un frammento di

circa 1500 bp (base pair, coppie di basi) e un frammento di circa 200 bp.

Fig. . l ce l d1 i ìg : ì f t rs lo ( ( l s ' i ) ( ( r r

! roPo oPfof tùnr . ( , 'o f . rz , ( r r , { ( ìn

riport.rto ìrì t.ìlì.11.ì

.u i \ono s l , r i i .nd l ìzznt ì i prodot t i nnr fL i r . r i i r ì f ( l iar r lc l ' � l l ì | r i ! e l . ì i i

l . f ( ìn Ì r Ì ( i ( l i e l i ( l io I inee ì , : , I € I Ì r ì is . . l r L l i rcrz ionc ( i l l . f t r (onr .

I ; l i Ìù ! r :Smnr l l , r ! l ( l ! r , nr . f lc f !11 f ìc5o nìo le.o l r r f r ì ( , io

Quirt l i ie niscclc di rc.rziorìe I e 3 sono st. l te unite e(l è si. ì to l ìuri f jcak) i l prodotto delln

P.C.R. metl iantt ' l 'ul i l izzo t1i urì kit Nucle()Spin Extr.rct l l (N l acherer,-N agel) chc ha

fr 'rnìr 'sso di al lontar-rare sal i , olìgon ucì(.ot id i tr i fosfi ì t i , primers c l ì() l inlcr.rsi ott( 'n( 'nclo così

fr,rnnrenti rì i DNA puri l ic.rt i . Succ('ssiYarìrcrìte i l DNA cosi ottenulo ò sl.rk) qunnfif ic,rto

nrer. l i . tùte l 'ui i l izzo Llcl N.rnoDrolì lnstruDtent ecl è r isulLrto d|cl( 'una conccÌìtr. ìztone dl

i 7 . l n g / 1 1 1 , .

( , i j t , nz in r i ( l ì r esh i z io r ìL ' i n t l i r i r l ua t i comc ip i i r npp rop f i n t i pe r t n ! , l j l r c i n n ran i t . r : r

\ l ìr ' . i frca l ,r sequerza rl i intcrc:st 'Lodìi ic.rntt. p( 'r l 'ntt iViLì i l ì \ ert. lsic. l in 1- r lr?poli lrrrrrr sOno:

- NsiI, codificato in Neisseia sicca (AîCC 29256) e clonato e isolato da Esdoichia coli,

che riconosce la sequenza f ATGCA'T 3'

3' T,ACGTA 5';

- )GroI, codificato in friantomonis holcicola (ATCC 13461) e clonato e isolato da

Escheríchia coli, che iconosce la sequenza 5' C'TCGAG 3'

3' GAGCT,C 5';

Il plasmide utilizzato per il clonaggio è pFO4 e, allo scopo di testare preventivamente se

viene specificamente altaccato dagli enzimi di restrizione di nostro intetesse, è stato

incubato con tali enzimi a 3fC per 3 h e successivammte su gel di agarosio 0.8% si è

conhollato se tale digestione fosse realmente awenuta (Fig. 5).

A tale scopo sono state preparate he miscele di reazione:

Plasmide pFO4 (500 nglpl)

Buffer 3 (10 x)*

HzO

NsiI (10 U/ml)

Plasmíde pFO4 (500 nglrl)

Buffer 3 (10 x)"

FIrO

)OroI (20 U/ml)

Plasmide pFO4 (500 ngl pl)

Buffu 3 (10 x)*

HzO

NsiI (10 U/ml)

/rhol (20 U/ml)

*Il tampone da usare dipende

delle indicazioni presenti sul

1 p l

2 pl (concenhazione finale 1 x)

17 1tI

1 p l

1 p l

2! (concentrazione finale 1 x)

17 pl

1 u l

1 p t

2 II (concentrazione finale 1 x)

16 rtl

1 p r

1 p l

dall'erzima di restrizione e viene scelto sulla base

manuale che accompagna i vari enzimi. Nello

ro AD=

l i g . a ( ! l J r . r S r r l B i ( i ( ( ) S ) r ì . ! r . r ( \ . r Ì \ , I u ì . r r , l l ' ( i f t l j r ù , i l n r . Ì 1 , , r i r , r , \ ì l n r f L l ) \ , \ l u r ì r r , , , J , r r

, . i r , l r l , r , , i ( . . r r ( r t ( i ù r l L r . l r r r i , \ L r . r , ! \ r \ f . i l t ì r { ì ì i ( l { t , l : ( ) l l r f r r l . . r ì L , r ì : ' ( f i , f I h \ ! . / n f f / i j r J

f f r t f / i ! , r ì r r f l r ì r + \ ! r l . t l ( r - l I N s i l ' \ l r ' . 1 f t Ì l ì l - \ l r , , l

L i i l i z z . rn t l r , un 'ana I rg . r r ì r . . . 1 , r J i f a , l , , i o r ìe , s i a . i na r rL ra io . l ì a ì ì c i l L )N . \ p r ( ) ! f r ì i r l t f J . t

l ' ( l ì . r , f ! , l i spc r i l ì ( i f n r l l l l i r l i f . * t l 1z io r ì c ; sL rcccss ì \ ' , ] r r . r ì t a ' l , r i l I )N . \ c l r r ' i l p ì , r . n r ìL ì , ,

L l rS . rL t i , ( , n g l i t r ì . , i n ì i i l i r i , r h ' i . , l i , r r t s (n r ( ) s t . l t i pL l l i l i ! r i t n ì f r l t . r n l ( ' I u t i l t , , r r r J i ' L

\L r ! l i \ ì 5 f r ì L \ l f . r . t I l (N I . ì . 1 ì . r ( \ \ . r g i ' l ) r ' ( l L r . ì r ì t i f i a , r i i n ìù l i . r r t L , i l \ . r r roDrop l ì ì s t rL r ì r t r t :

l f . ( ì | r f n t f , rT i ( rn i sono r ì su l t . r t . ' r , - ' t , r ' r , r j sp f t t i \ ' . t n ì t : t ì t r , r l j l 9 | l i l . ; r rg , / ! t l - .

\ q r r i ! t t ì pLn l t ( ) s i i , l ì r o | . r f r i . r Lù r . r n l i ' . f l , l pc r ' l r l ì g . ì , , i ( r n . . . ( , n i r ' n i , r ì t r ' :

: p rc i l i co , r l u t ' s to i . ì n r l ì r ì n f . ( , n t i . r ì ( . I r ì s Ì lC l i ( l ù ì \ 1 , \ . r ( i 1 t )0 n ìN I , \ l gL l r l i l l l r \ 1 ,

J i i i o t r f i t ( ) h ) I ì ì \ 1 , f l J . 9

i

plasnìide precedcntc cligerikr (10 ng/pL);

DNA prececlente digerito;

T4 DNA ligasi (400 U/mL) (2 pl);

T4 DNA ligasi buffer (10 x: Tris-HCl 400 mM, MgCb 100 mNl, DTT 100 mNI, ATP 5

mM, pH 7.8) (1 prl);

H:O per un volume finale di 20 pL.

Tale miscela è stata incubata per 2 ore a temperatura ambiente. Successivamente si

pr<rede con la trasformazione, ovvero ai 20 pL della miscela di Jìgazione son,.r

agf:iunti 50 pL di cellule DH5o (Eschtrichia coli) già precedentemente rese competenti:

si incuba tale miscela per 30 min in ghiaccio. Successivamente la sì pone per 45

secondi a.42'C, poi per 5 min di nuovo in ghiaccio e infine si aggiungono 100 prl- di

un terreno di coltura (denomìnato SOC) e si incuba il tutto in agitazione per 45 min a

37"C. Dopo di che si piastrano 100 pL di taÌe miscela su una piastra di tcrreno LB +

ampicillina, che è poi incubata a 37 "C per 48 h.

Trascorse le 48 ore, si è osservata la pre'scnza di colonie di celluÌe trasformate (Fig. 6),

che devono però essere esarninate per saggiare la presenza o meno al loro intemo del

pÌasmide contencntc la sequenza genica di nostro interesse.

Fig. 6 Foio della piastra su cui sono cresciute aìcùne colonie del .i:ppo DHSo trasformate

Obiettivi futuri sarauo l'esprcssione del gcne clonato e la purificazione della proteina

cli interesse cla esso codificata, la cui struttura e meccanisnl() di funzionamento

t1 k-

pohanno così essere ulteriormente e approfonditamente studiate. Ciò anche al fine di

poter meglio conoscere il metabolismo degli zuccheri nel batterio termofilo anaerobio

produttore di idroge o Themotoga fleapolil4r4 e poteme così ulteriormente ottimizzare

la produzione di idrogeno.

Pertanto la perm€menza presso la Stazione Biologica di Roscoff si è conclusa con un

risultato più che positivo, sia in termini di conoscenze acquisite su tecniche di biologia

molecolare, di cui la beneficiaria del programma si è impadronita durante il suo

soggiorno e che saranno utili alla sua formazione professionale, che per i dsultati

scientifici ottenuti, che saranno oggetto di pubblicazioni su riviste internazionali.

Pozzuoli, 16 ADrile 2009

Firma del Proponente

Dott.ssa Agata Gambacota

Fima del Fruitore

Dott.ssa Laura Dipasquale

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