Relazione RAE 2020 - Haflinger Italia · razza con relativo codice, dopo il quality control (QC)....

Dipartimento di Medicina Veterinaria via S.Costanzo, 4 06126 Perugia

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Analisi Molecolari

Come previsto nel terzo anno del PSRN-Biodiversità - sottomisura 10.2 progetto EQUINBIO, proponente ANACRHAI, è proseguita l’attività di raccolta dei campioni genetici sulle popolazioni equine ed asinine da registro anagrafico (RAE) interessate dal progetto, sulle quali si è proceduto ad analisi genomica.

Durante la prima annualità erano stati raccolti ed analizzati campioni biologici su cinque razze alle quali nella seconda annualità se ne sono aggiunte altre nove, come evidenziabile dalla tabella sotto riportata, suddivisa tra cavalli ed asini:

Asini Genotipizzati (190)

ASINO AMIATA 22

ASINO DELL'ASINARA 29

ASINO MARTINA FRANCA 22

ASINO PANTESCO 20

ASINO RAGUSANO 35

ASINO ROMAGNOLO 25

ASINO SARDO 22

ASINO VITERBESE 15

Cavalli Genotipizzati (295)

CAVALLINO DELLA GIARA 5

CAVALLO APPENNINICO 21

CAVALLO DEL CATRIA 23

CAVALLO DEL DELTA 25

CAVALLO DEL VENTASSO 19

CAVALLO DI MONTERUFOLI 25

CAVALLO PENTRO 18

CAVALLO PERSANO 14

CAVALLO ROMANO DELLA MAREMMA LAZIALE 20



2

NAPOLETANO 18

PONY ESPERIA 21

SALERNITANO 26

SANFRATELLANO 22

SARCIDANO 13

TOLFETANO 25

Totale complessivo 485

La prima considerazione fatta è che queste razze/popolazioni, in particolare gli equini, sono state, nel corso degli anni, più volte soggette ad accorpamenti e successive divisioni. In mancanza di genealogie accertate e, in aggravio, fenotipi simili se non addirittura sovrapponibili tra le popolazioni, la caratterizzazione delle singole realtà diventa molto difficile.

Tutte le popolazioni sono state esaminate con gli strumenti genomici disponibili (SNP-CHIP) cercando di evidenziare differenze significative tra i gruppi.

Le genotipizzazioni svolte nel progetto, sono analizzate con modelli statistici avanzati per il monitoraggio approfondito della variabilità genetica al fine di stimare: molteplici parametri di genetica di popolazione, dalla demografia alla struttura fine.

Per quasi tutte le popolazioni indicate, sono stati prelevati un numero di campioni superiore a quelli previsti dal progetto, non equamente distribuiti per popolazione, sia per avere la certezza della qualità del crine sia per permettere una scelta mirata ai fini della genotipizzazione, tenendo conto di vari fattori quali ad esempio il sesso, il grado di parentela e la dislocazione geografica.



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Analisi Demografica

L’analisi demografica è stata effettuata su tutte le razze a disposizione. I dati ottenuti all’interno del progetto sono stati analizzati sia da soli che fusi, mediante apposite procedure informatiche, con dati pubblici di razze cosmopolite e altre italiane da Libro Genealogico.

Dopo appropriata pulizia per variabili di qualità legate all’individuo, alla popolazione e al marcatore, nei dataset prodotti rimanevano:

Tabella 1: soggetti e marcatori usati (specie equina, razze RAE) dettagliati per razza con relativo codice, prima e dopo il quality control (QC).

Tabella 2: soggetti e marcatori usati (specie asinina, razze RAE) dettagliati per razza con relativo codice, prima e dopo il quality control (QC).

Marker X soggetti / 532 X 186 Acronimo Pre-QC Post-QC

Asino Amiatino AAM 22 22 Asino dell’Asinara AAN 29 29 Asino di Martina Franca AMF 22 19 Asino Pantesco APT 20 19 Asino Ragusano ARG 35 35 Asino Romagnolo ARO 25 25 Asino Sardo ASS 22 22 Asino Viterbese AVT 15 15

Marker X soggetti / 52305 X 282 Acronimo Pre-QC Post-QC

Cavallo Appenninico CAP 21 21 Cavallo del Catria CDC 23 22 Cavallo del Delta CDD 25 25 Cavallo del Pentro CDP 18 18 Cavallo del Ventasso CDV 19 19 Cavallo Romano della Maremma Laziale CRM 20 20 Cavallo della Giara GIA 5 5 Cavallo di Menterufoli MRF 25 20 Napoletano NAP 18 18 Persano PER 14 14 Pony Esperia PES 21 21 Salernitano SAL 26 22 San Fratellano SAN 22 20 Sarcidano SAR 13 13 Tolfetano TOL 25 24



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Tabella 3: soggetti e marcatori usati (specie equina, razze RAE + Libro genealogico + cosmopolite) dettagliati per razza con relativo codice, dopo il quality control (QC).

Numero Marker = 39617 X 565 Acronimo Post-QC

Andaluso (Pura razza Spagnola) AND 18 Puro Sangue Arabo ARB 24 Cavallo Belga BEL 30 Cavallo Appenninico CAP 21 Cavallo del Catria CDC 21 Cavallo del Delta CDD 25 Cavallo del Pentro CDP 18 Cavallo del Ventasso CDV 19 Cavallo Romano della Maremma Laziale CRM 20 Franches Montagnes FRM 19 Cavallo della Giara GIA 5 Hafflinger HAF 30 Lipizzano LIP 30 Maremmano MAR 30 Cavallo di Menterufoli MRF 20 Murgese MUR 30 Napoletano NAP 18 Norico NOR 19 Persano PER 14 Pony Esperia PES 21 Salernitano SAL 21 San Fratellano SAN 20 Sarcidano SAR 13 Standardbred (Trottatore) STB 25 Puro Sangue Inglese THO 30 Tolfetano TOL 24

Con questa mole di dati è stato possibile innanzitutto creare una rappresentazione grafica della distanza tra gli individui RAE (Figura 1 e 2), dalla quale si evince che le popolazioni italiane sono tra di loro molto connesse, con l’unica eccezione del Cavallo del Delta, di origine Camargue.



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Figura 1. Multidimensional Scaling delle popolazioni equine analizzate. È evidente la grande omogeneità dei soggetti fatto salvo il Cavallo del Delta (CDD). Si apprezza per le razze italiane una certa corrispondenza del gradiente Nord-Sud, nella componente Pcs 1, sull’asse X.

−0.1 0.0 0.1 0.2

−0.1

0.0

0.1

0.2

MultiDimensional Scaling

Pcs 1 (7.62%)

CAP

CDC

CDD

CDPCDVCRMGIA

MRF

NAP

PER

PES

SAL

SAN

SAR

TOL

−0.1 0.0 0.1 0.2

−0.1

0.0

0.1

0.2


Pcs 1 (7.62%)

Pcs

2 (5

.07%

)

CAPCDCCDDCDPCDVCRMGIAMRF

NAPPERPESSALSANSARTOL



6

Figura 2. Multidimensional Scaling delle popolazioni equine analizzate (dataset completo). I cluster Lipizzano (LIP), Arabo (ARB), Purosangue (THO) e Belgian (BEL) e Noriker (NOR) e Haflinger (HAF) si posizionano correttamente agli estremi dello spazio cartesiano. Si apprezza, anche qui, per le razze italiane, il gradiente Nord-Sud, evidente nella componente Pcs 1, asse X.

−0.1 0.0 0.1 0.2 0.3

−0.1

0.0

0.1

0.2


Pcs 1 (8.59%)

Pcs

2 (3

.78%

)

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abcde#

ANDARBBELCAPCDCCDDCDPCDVCRM

FRMGIAHAFLIPMARMRFMURNAPNOR

PERPESSALSANSARSTBTHOTOL

−0.1 0.0 0.1 0.2 0.3

−0.1

0.0

0.1

0.2


Pcs 1 (8.59%)

AND

ARB

BEL

CAP

CDC

CDDCDP CDV

CRM

FRM

GIA

HAF

LIP

MARMRFMUR

NAP

NOR PER

PES

SAL

SANSARSTB

THO

TOL



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Anche per le popolazioni asinine è stato tentato lo stesso approccio visibile in Figura 3.

Figura 3 Multidimensional Scaling delle popolazioni asinine analizzate. È evidente la separazione di Asino Pantesco (APT), Asino dell’Asinara (AAN) e Asino Sardo (ASS). Le altre popolazioni sembrano essere più confuse.

Dal Multi Dimensional Scaling risultano ben evidenti le popolazioni dell’Asinara, Sarda e Pantesco. Va precisato che probabilmente l’asino Pantesco risente di una forte contrazione della

−0.3 −0.2 −0.1 0.0 0.1

−0.1

0.0

0.1

0.2

0.3


Pcs 1 (14.16%)

Pcs

2 (7

.13%

)

AAMAANAMFAPTARGAROASSAVT



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popolazione e dei riproduttori. Con componenti meno esplicative dal punto di vista della variabilità assorbita (PC3, PC4 etc., non mostrati) il cluster principale tende a separarsi un po’ meglio ma, data la scarsità di marcatori, tendiamo a prendere questi risultati con molta cautela.

Le analisi sugli asini si fermano qui, quindi, per scarsità di marker (solo 532): la non corretta ibridazione con il genoma di asino ha fatto si che la stragrande maggioranza dei marcatori fosse monomorfica, ovvero, senza variazione. Questo fenomeno è dovuto con tutta probabilità al all’Ascertainment bias, o “distorsione di accertamento”, visto che i marker utilizzati sono stati scoperti e caratterizzati in cavallo.

Analisi Struttura

Il software Admixture è stato utilizzato per analizzare la struttura delle popolazioni interessate dal progetto e ricostruirne l’ascendenza. In breve, l’analisi assegna al genoma di ogni individuo la popolazione ancestrale di appartenenza. Il numero di popolazioni (K) testato è predefinito: per ogni K il software cerca K gruppi con i dati a disposizione. In questo modo si possono identificare animali, e più in generale le razze, meticce o "pure", ovvero che hanno componenti genomiche ancestrali riconducibili ad un pool o a più di uno.

Il K migliore, è risultato il 23 (Figura 4 e 5), con il quale si differenziano correttamente tutte le razze cosmopolite mentre le razze italiane più meticciate mostrano, senza ombra di dubbio, la loro derivazione eterogenea.

Figura 4 Analisi ADMIXTURE. Barplot delle popolazioni. Ad ogni colore corrisponde un “genoma ancestrale” diverso. Le razze verso la destra sono evidentemente influenzate da varie componenti.

ADMIXTURE analyses K 23

Ancestralidade

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

THO

BEL

LIP

CDD

STB

FRM

CAP

ARB

HAF

MRF

NAP

MUR

AND

SAR

SAL

NOR

MAR

CRM

PER

SAN

PES

CDC

GIA

CDP

CDV

TOL



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Figura 5. Analisi ADMIXTURE. Moon plot delle popolazioni, da K2 a K30. Ad ogni cluster aggiunto si differenzia una razza in particolare e, al contempo, si evidenziano l’admixture delle razze meno selezionate.

Dal moon plot in Figura 5 si nota come la componente hotblood (THO) e quella coldblood (BEL) siano correttamente individuate come prima separazione. Le razze che in qualche modo condividono origini dal Purosangue o da razze “a sangue freddo” sono già evidenti nei primi K.

Quasi tutte le popolazioni italiane, ad eccezione delle razze nella parte destra del grafico, Cavallo del Ventasso e Tolfetano, raggiungono, anche se a K molto elevati, una loro identità genomica. Fa piacere notare come il Cavallo del Delta, già evidente nell’MDS precedenti, si distingua con la sua unicità nei primi K, probabilmente grazie alla sua origine “aliena” al patrimonio italiano. La distanza dal CDD dalle altre razze italiane si attenua però quando analizzata nel contesto internazionale, dove Purosangue Inglese, Lipizzano, Arabo e razze pesanti definiscono al meglio lo spazio di indagine (vedi MDS Figura 2).

In alcune delle razze, l’effetto fondatore appare importante: Napoletano, Monterufoli e Giara sono un ottimo esempio di come dei patrimoni genetici tutto sommato mescolabili ad altre razze (vedi MDS) siano poi riscontrabili come razze “monolitiche” nella analisi admixture addirittura prima delle razze dalle quali molto hanno attinto per la loro ricostituzione (Maremmano ad esempio). L’effetto fondatore potrebbe essere anche la causa della netta separazione in due sottopopolazioni nelle razze: Sarcidano, Pony Esperia, Persano e Salernitano.



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Questa ipotesi sembra ben avvalorata dallo studio dell’eterozigosi. Ulteriori indagini con un campionamento più ampio potrebbero risolvere il nodo in questione.

Analisi Distanze

Per quanto riguarda l’analisi delle distanze genetiche, riassunte in Figura 6, si nota come in particolare 3 popolazioni siano mediamente più distanti dalle altre. Purosangue Inglese, Lipizzano e Cavallo Del Delta sono le razze che presentano valori di distanza di Reynolds più elevati confermando in parte quello che già i risultati struttura e demografia avevano evidenziato.

AND 0,00

ARB 0,05 0,00

BEL 0,06 0,08 0,00

CAP 0,06 0,07 0,05 0,00

CDC 0,05 0,06 0,05 0,04 0,00

CDD 0,08 0,09 0,08 0,08 0,07 0,00

CDP 0,05 0,06 0,05 0,06 0,05 0,08 0,00

CDV 0,04 0,04 0,06 0,05 0,04 0,07 0,05 0,00

CRM 0,04 0,05 0,05 0,05 0,04 0,07 0,04 0,03 0,00

FRM 0,06 0,07 0,05 0,03 0,03 0,08 0,05 0,04 0,04 0,00

GIA 0,07 0,07 0,06 0,07 0,06 0,09 0,08 0,06 0,06 0,07 0,00

HAF 0,03 0,05 0,03 0,03 0,03 0,04 0,02 0,03 0,03 0,03 0,02 0,00

LIP 0,08 0,08 0,09 0,09 0,08 0,11 0,08 0,07 0,07 0,08 0,08 0,06 0,00

MAR 0,03 0,03 0,04 0,03 0,02 0,05 0,02 0,02 0,01 0,03 0,02 0,06 0,06 0,00

MRF 0,07 0,07 0,06 0,07 0,06 0,09 0,06 0,06 0,05 0,07 0,08 0,03 0,09 0,03 0,00

MUR 0,04 0,05 0,05 0,04 0,04 0,06 0,03 0,04 0,03 0,04 0,03 0,05 0,07 0,04 0,05 0,00

NAP 0,08 0,08 0,09 0,09 0,08 0,11 0,09 0,06 0,06 0,08 0,10 0,05 0,10 0,03 0,10 0,06 0,00

NOR 0,07 0,08 0,05 0,06 0,05 0,08 0,06 0,06 0,05 0,06 0,08 0,02 0,09 0,03 0,07 0,04 0,10 0,00

PER 0,07 0,06 0,09 0,08 0,07 0,10 0,08 0,05 0,05 0,07 0,10 0,05 0,10 0,02 0,09 0,05 0,09 0,10 0,00

PES 0,05 0,06 0,04 0,05 0,04 0,07 0,04 0,04 0,04 0,05 0,06 0,02 0,07 0,02 0,05 0,03 0,08 0,05 0,07 0,00

SAL 0,07 0,06 0,08 0,08 0,07 0,10 0,07 0,04 0,05 0,07 0,08 0,05 0,10 0,03 0,08 0,05 0,08 0,09 0,05 0,07 0,00

SAN 0,05 0,05 0,06 0,05 0,05 0,08 0,05 0,04 0,03 0,05 0,06 0,03 0,08 0,02 0,06 0,04 0,07 0,06 0,06 0,04 0,06 0,00

SAR 0,06 0,06 0,06 0,05 0,05 0,08 0,07 0,05 0,05 0,05 0,08 0,03 0,08 0,03 0,07 0,04 0,09 0,07 0,08 0,05 0,07 0,06 0,00

STB 0,07 0,07 0,08 0,07 0,07 0,09 0,07 0,05 0,05 0,07 0,07 0,05 0,10 0,04 0,08 0,06 0,08 0,08 0,07 0,07 0,07 0,06 0,07 0,00

THO 0,08 0,07 0,11 0,09 0,08 0,11 0,08 0,05 0,05 0,08 0,07 0,08 0,11 0,04 0,09 0,08 0,08 0,10 0,04 0,08 0,04 0,07 0,08 0,07 0,00

TOL 0,04 0,04 0,04 0,04 0,03 0,06 0,03 0,02 0,02 0,04 0,04 0,03 0,07 0,01 0,04 0,03 0,06 0,04 0,05 0,03 0,04 0,03 0,04 0,05 0,06 0,00

AND ARB BEL CAP CDC CDD CDP CDV CRM FRM GIA HAF LIP MAR MRF MUR NAP NOR PER PES SAL SAN SAR STB THO TOL

Figura 6 Distanze di Reynolds. Maggiore è la distanza, più intenso il colore della cella di confronto.



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È altresì evidente come ad esempio Maremmano e Cavallo Romano della Maremma Laziale sono praticamente la stressa popolazione (già evidente nell’analisi Admixture).

Analisi Eterozigosi e Inbreeding

Sono state calcolate anche eterozigosi attesa e osservata (He , Ho) nelle singole razze per avere un quadro seppur indiretto, e con limitazioni dovute alla scarsa numerosità di alcune razze, dell’inbreeding.

Dalla tabella seguente si evince che, laddove il delta tra He e Ho è negativo, alcune razze presentano una più alta consanguineità, mentre popolazioni anche piccole possono essere ben gestite.

Tabella 4. Eterozigosi osservata (HO), Attesa (HE) e relativo delta

Ho He Delta

AND 0,293 0,309 -0,016 ARB 0,307 0,314 -0,007 BEL 0,287 0,282 0,005 CAP 0,301 0,292 0,009 CDC 0,315 0,304 0,011 CDD 0,270 0,266 0,005 CDP 0,294 0,283 0,012 CDV 0,340 0,336 0,004 CRM 0,336 0,334 0,002 FRM 0,303 0,300 0,003 GIA 0,277 0,232 0,045 HAF 0,280 0,282 -0,002 LIP 0,282 0,268 0,014 MAR 0,336 0,340 -0,005 MRF 0,333 0,292 0,041 MUR 0,311 0,309 0,002 NAP 0,322 0,286 0,036 NOR 0,285 0,278 0,008 PER 0,328 0,315 0,013 PES 0,300 0,305 -0,006 SAL 0,334 0,323 0,011 SAN 0,321 0,316 0,005 SAR 0,284 0,288 -0,005 STB 0,302 0,303 -0,001 THO 0,330 0,328 0,002 TOL 0,336 0,336 0,000



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Per quanto riguarda l’eterozigosi, il grafico sopra riportato indica la distribuzione dei valori individuali di eterozigosi osservata. È possibile notare nelle popolazioni che strutturalmente si dividono in due sottogruppi, un allungamento della struttura a violino, indice di gruppi di valori differenti (ad esempio: Persano [PER], Napoletano [NAP] e Sarcidano [SAR]).

0.25

0.30

0.35

0.40

CAP

CDC

CDD

CDP

CDV

CRM

GIA

MRF NAP

PER

PES

SAL

SAN

SAR

TOL

Beanplot of Observed Heterozygosity

Obs.Het



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In generale le popolazioni italiane risultano avere un buon livello di eterozigosi, tranne che per alcune popolazioni dove sia il campionamento che la limitata consistenza possono aver contribuito ad un abbassamento.

Ovviamente, data la scarsa numerosità degli individui, alcune analisi (ad esempio questa) potrebbero beneficiare di un aumento dei soggetti sottoposti a genotipizzazione.

A questo proposito l’inbreeding medio delle popolazioni è stato calcolato mediante l’utilizzo delle Runs of Homozigosity (ROH) che dovrebbe restituire una stima più accurata anche in presenza di mumerosità per razza relativamente scarse.

In Tabella 5 è riportato il valore medio di inbreeding e la relativa deviazione standard. I valori sono gli stessi riportati in figura. Sostanzialmente l’analisi conferma quanto osservato in precedenza (ad esempio su CDD e SAR). Il valore di inbreeding F_ROH, sebbene calcolato escludendo marcatori in forte LD (Linkage Disequilibrium, potrebbe risultare leggermente sovrastimato.

Tabella 5. F_ROH, inbreeding medio calcolato per razza, e relativa deviazione standard.

Codice Razza F_ROH (inbreeding) DEV.ST

CAP 0,204 0,042 CDC 0,169 0,030 CDD 0,248 0,042 CDP 0,132 0,015 CDV 0,156 0,030 CRM 0,154 0,030 GIA 0,232 0,060 MRF 0,134 0,040 NAP 0,189 0,036 PER 0,208 0,061 PES 0,186 0,034 SAL 0,190 0,044 SAN 0,175 0,032 SAR 0,259 0,049 TOL 0,140 0,024



14

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

CAP CDC CDD CDP CDV CRM GIA MRF NAP PER PES SAL SAN SAR TOLBreed

F

BreedCAP

CDC

CDD

CDP

CDV

CRM

GIA

MRF

NAP

PER

PES

SAL

SAN

SAR

TOL

F ROH genome wide



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Commento finale

Dai dati molecolari si evince che le Razze di Registro Anagrafico, generalmente, presentino una struttura variegata e di molteplice origine (forte la componente estera in determinate popolazioni) con alcune eccezioni che invece sembrano aver raggiunto una identità anche di tipo genomico oltre che fenotipico. È il caso del cavallo Napolitano che, sulla carta, sembra avere una sua unicità di razza, sebbene quest’ultima potrebbe esser dovuta ad un forte effetto fondatore. Le altre razze sembrano risentire molto dell’effetto della popolazione dominante Italiana (Maremmano).

Perugia, 14 Luglio 2020

Il Direttore

Prof. Maurizio Silvestrelli

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