Progetto

Monitoraggio dell’accumulo di composti chimici nel biota delle acque marino-

costiere e di transizione della Regione Puglia.

Obiettivi del progetto

Il progetto si propone il monitoraggio della qualità delle acque marino-costiere e di transizione della Regione Puglia mediante l’utilizzo di organismi marini filtratori. In particolare, in 42 stazioni (Figura 1 e Tabella 1) sarà effettuata un’indagine per verificare la presenza di allevamenti e/o banchi naturali di mitili. Per un set ridotto di stazioni (n° 12), considerate indicative per ognuno dei siti di produzione designati dalla Regione Puglia con DGR 785/99, il prelievo e l’analisi sono state effettuate essere effettuate nel secondo semestre del 2008.

Figura 1 - Ubicazione delle stazioni di campionamento.

Tabella 1 - Elenco stazioni di campionamento (in giallo le stazioni campionate entro il secondo semestre 2008 ed in verde le stazioni da campionare anche nel periodo maggio-luglio 2009).

Ambito geograficodelle stazioni

x y g° m' s'' dec. g° m' s'' dec.

MC 1TR Tremiti a 200 m dalla riva 2561205.582 4662918.707 42 7 2 0 15 29 53 99MC 1A Foce T.te Saccione a 500 m dalla riva 2531531,03 4642234,54 41 55 54 91 15 8 20 25MC 2A Foce Fiume Fortore a 500 m dalla riva 2544389,11 4641555,12 41 55 31 84 15 17 38 48MC 3A P.ta Pietre Nere (foce Acquarotta) a 500 m dalla riva 2548246,94 4641080,72 41 55 16 0 15 20 25 90MC 4A Foce Schiapparo a 500 m dalla riva 2562173,28 4640361,50 41 54 50 45 15 30 30 31MC 5A Foce di Capoiale a 500 m dalla riva 2575298,67 4641698,58 41 55 30 89 15 40 0 51MC 6A Foce di Varano a 500 m dalla riva 2585807,15 4641698,58 41 55 27 99 15 47 36 73MC 7A Molino di Mare a 500 m dalla riva 2595973,70 4643176,24 41 56 12 61 15 54 58 77MC 11A Mattinata a 200 m dalla riva 2609002,83 4616432,70 41 41 40 72 16 4 10 4MC 12A Manfredonia a 500 m dalla riva 2596351,11 4607980,94 41 37 11 42 15 54 58 89MC 13A Foce T.te Candelaro a 500 m dalla riva 2595017.258 4604070.539 41 35 5 10 15 53 59 49MC 14A Foce T.te Cervaro a 500 m dalla riva 2596237,78 4597717,63 41 31 38 71 15 54 49 30MC 15A Foce T.te Carapelle a 500 m dalla riva 2597760,28 4594239,04 41 29 45 40 15 55 53 38MC 16A Saline (Foce Carmosina) a 500 m dalla riva 2609501,75 4585399,68 41 24 54 41 16 4 15 0MC 17A Foce Fiume Ofanto a 500 m dalla riva 2620772.23 4580056.45 41 21 56 40 16 12 17 19MC 18A Barletta Est a 500 m dalla riva 2624176,34 4577455,03 41 20 30 50 16 14 42 8MC 24A Bari est (Il Trullo) a 500 m dalla riva 2682560.252 4553009.398 41 6 43 50 16 56 9 69MC 30A Torre Canne a 500 m dalla riva 2728485,66 4523884,15 40 50 22 13 17 28 21 98MC 34A Brindisi (Capo Bianco) a 500 m dalla riva 2774119.41 4504226.403 40 38 59 20 18 0 19 49MC 48A Porto Cesareo a 200 m dalla riva 2766196.085 4459214.793 40 14 49 90 17 53 39 79MC 49A Torre Colimena a 500 m dalla riva 2752855,20 4463731,16 40 17 29 93 17 44 21 68MC 50A Campomarino a 200 m dalla riva 2737771,92 4463759,39 40 17 45 46 17 33 43 53MC 55A Foce F. Patemisco a 500 m dalla riva 2698173,34 4487454,17 40 31 7 16 17 6 11 36MC 57A Foce F. Lato a 500 m dalla riva 2689118.832 4484008.488 40 29 22 30 16 59 43 49MC 58A Marina di Ginosa a 100 m dalla riva 2680502,47 4476595,71 40 25 28 16 16 53 30 94AT 7 Lago di Varano Incile Foce Capoiale 2576924,46 4638990,84 41 54 2 68 15 41 10 15AT 9 Lago di Varano Bocca del Terzagno 2586127,43 4639520,81 41 54 17 29 15 47 49 76AT 10 Lago di Varano S. Nicola di Varano 2579666,84 4637081,27 41 53 0 4 15 43 8 48AT 11 Lago di Varano Loc. Bagno 2583216,80 4634061,28 41 51 21 14 15 45 41 34AT 1 Laguna di Lesina Incile C.le Acquarotta 2548718,29 4637257,93 41 53 11 99 15 20 45 70AT 2 Laguna di Lesina Lesina 2550039,01 4635297,88 41 52 8 26 15 21 42 65AT 4 Laguna di Lesina Foce Zanella 2559872,89 4636240,05 41 52 37 25 15 28 49 46AT 5 Laguna di Lesina Incile C.le Schiapparo 2564558,50 4638999,26 41 54 5 81 15 32 13 48AT 14 Laghi Alimini c/o foce Alimini Grande 2813730,73 4455927,15 40 12 8 36 18 27 3 8AT 15 Laghi Alimini Idrovora Alimini Piccolo 2813549,54 4453571,66 40 10 52 33 18 26 51 56VM 60A Parco allev. Mitili (Capoiale) a 3000 m dalla riva 2575919,18 4643625,12 41 56 33 20 15 40 28 11VM 61D Impianto mollusc. (Manfredonia) a 3500 m dalla riva 2597982,59 4601434,44 41 33 38 61 15 56 6 32VM 69A Mar Grande (Loc. Sabbione) a 500 m dalla riva 2708886,58 4477674,71 40 25 41 70 17 13 35 84VM 70A Mar Grande (Loc. Tarantola) a 500 m dalla riva 2710139,95 4478561,93 40 26 9 43 17 14 29 95VM 71A Mar Piccolo (I seno - Loc. Galeso) a 500 m dalla riva 2710897,79 4485381,56 40 29 49 81 17 15 9 47VM 72A Mar Piccolo (II Seno - Loc. Cimini) a 500 m dalla riva 2715292,10 4482898,67 40 28 25 68 17 18 13 26VM 73A Mar Piccolo (II Seno - Loc. Battentieri) a 500 m dalla riva 2716040,91 4485322,44 40 29 43 59 17 18 47 73

Coordinate

Long. ELat. NGeografiche WGS84

Gauss-BoagaSiti di campionamento

delle stazioni

codicecartografico

 

Composizione dell’Unità Operativa Per il CNR-IAMC: Dr. Nicola Cardellicchio, Dr.ssa Antonella Di Leo, Dr.ssa Santina Giandomenico, Dr.ssa Lucia Spada, Sig.ra C. Annicchiarico. Per Arpa Puglia: Dr. Massimo Blonda, Dr. Vito Perrino, Dr. Nicola Ungaro, Dott.ssa Anna Maria Pastorelli, Sig.ra Rosanna Zingaro.

Indagini e campionamenti I campionamenti degli organismi sono iniziati nel giugno 2008 dopo alcune indagini preliminari rivolte ad accertare la presenza dei molluschi nelle stazioni da monitorare. L’attenzione è stata rivolta prioritariamente alle 12 stazioni indicate in giallo nella tabella 1. Qui di seguito è riportato l’elenco dei campionamenti effettuati.

ELENCO DEI CAMPIONI PRELEVATI ED ANALIZZATI

VM71A (Mar Piccolo, I Seno, loc. Galeso): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno 16/06/2008 mediante il mezzo nautico “Cerruti” del CNR di Taranto presso allevamento di molluschi. VM72A (Mar Piccolo, II Seno, loc. Cimino): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno 16/06/2008 mediante il mezzo nautico “Cerruti” del CNR di Taranto presso allevamento di molluschi. VM70A (Mar Grande, loc. Tarantola): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno 19/06/2008 presso un impianto di molluschicoltura. AT14 (presso foce Alimini Grande): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno 23/06/2008 presso un impianto di allevamento ittico alla foce di Alimini Grande. AT9 (Lago Varano, bocca del Terzagno): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno 24/06/2008 presso allevamento di molluschi. VM60A (Parco allevamento mitili Capoiale): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno 24/06/2008 presso l’impianto di allevamento a mare di Capoiale. MC2A (Foce fiume Fortore): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno 01/07/2008 presso la foce del fiume. MC17A (Foce fiume Ofanto): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno 02/07/2008 presso la foce del fiume. MC11A (Mattinata): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno 03/07/2008 nei pressi dell’impianto di allevamento ittico (Maricoltura Mattinatese) con mezzo nautico fornito dalla società che gestisce l’impianto. VM61D (Impianto molluschicoltura Manfredonia): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno 16/07/2008 nell’impianto di allevamento di molluschi con il mezzo nautico di una cooperativa di miticoltori del luogo. MC13A (Foce torrente Candelaro): non essendoci presenza di molluschi del genere Mytilus il giorno 19/09/2008 sono stati prelevati esemplari di vongole Ruditapes philippinarum mediante una vongolara di una cooperativa locale.

AT2 (Laguna di Lesina): non è stato possibile effettuare il prelievo di esemplari sia di molluschi bivalvi che di pesci a seguito delle particolari condizioni ambientali della stazione constatate il giorno 01/07/2008, grazie al mezzo nautico del CNR-ISMAR di Lesina e la collaborazione scientifica del Dr. Breber. Il giorno 30/07/2008 sono state impiantate nella stessa laguna in località San Clemente, n. 5 reste di mitili prelevati in un’area poco contaminata di Taranto. Un mese dopo, al momento del prelievo, gli organismi sono stati ritrovati morti a causa delle precarie condizioni fisico-chimiche delle acque della laguna, che ha presentato un esteso fenomeno di anossia. La bassa salinità delle acque non consente poi la sopravvivenza dei molluschi.

ELENCO DEI CAMPIONI PRELEVATI MA NON ANCORA COMPLETAMENTE

ANALIZZATI MC14A (Foce torrente Cervaro): non essendoci presenza di molluschi del genere Mytilus sono stati prelevati il giorno 19/09/2008 esemplari di vongole Ruditapes philippinarum mediante vongolara di una cooperativa di pescatori locali. MC15A (Foce torrente Carapelle): non essendoci presenza rilevante di molluschi del genere Mytilus sono stati prelevati il giorno 19/09/2008 esemplari di vongole Ruditapes philippinarum mediante vongolara di una cooperativa di pescatori locali. VM73A (Mar Piccolo, II Seno, loc. Battentieri): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno 17/11/2008 presso un allevamento di molluschi. VM69A (Mar Grande, loc. Sabbione): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno 17/11/2008 mediante il mezzo nautico del CNR di Taranto “Cerruti” presso impianto dismesso di allevamento molluschi con l’ausilio di un subacqueo. MC55A (Foce Fiume Lato): non essendoci esemplari di molluschi nella località indicata e lungo tutta la costa adiacente al fiume Lato, i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno 25/11/2008 presso la foce del fiume Lenne (località più a sud, con l’ausilio di un subacqueo. MC57A (Foce Fiume Patemisco): i campioni di Mytilus galloprovincialis sono stati prelevati il giorno 25/11/2008 presso la foce del fiume, con l’ausilio di un subacqueo.

Preparazione del campione

Per ogni stazione di campionamento sono stati selezionati 300-350 individui di taglia più o meno omogenea (Tabella 2). Per l’analisi dei metalli, in particolare, sono state utilizzati 150-170 individui; gli altri 150-170 individui sono stati utilizzati per l’analisi di composti organici. Per la determinazione di biomarkers (stabilità della membrana lisosomiale) sono stati utilizzati circa 20 individui, mantenuti in vita fino all’analisi, in acqua marina areata (circa 1 individuo per litro di acqua) alla temperatura di circa 14-16 °C. Per la rimozione della polpa intera sono stati utilizzati un coltello di teflon per l’analisi dei metalli e un coltello di acciaio inox per l’analisi di composti organici. Prima della rimozione della polpa, le valve degli organismi sono state ripulite da incrostazioni, rimuovendo il materiale estraneo. Ogni esemplare è stato lavato con acqua distillata; per i mitili è stato estratto il bisso dalle valve chiuse. La polpa è stata poi rimossa, lavata con acqua distillata, fatta sgocciolare su un foglio di carta bibula e conservata in contenitori di vetro. Prima dell’analisi i campioni sono stati omogeneizzati con un omogenizzatore Ultra Turrax T25 e liofilizzati. Su una aliquota di campione è stata calcolata la perdita in acqua.

Tabella 2 – Intervallo di lunghezza delle valve dei mitili campionati 

Campione Lunghezza (cm)

Mytilus galloprovincialis

MC 2A (Foce Fortore) 2.81-3.70

MC 11A (Mattinata) 4.73-5.11

MC 17A (Foce Ofanto) 3.50-4.12

AT 9 (Lago Varano) 5.75-6.53

AT 14 (Alimini Grande) 4.95-5.64

VM 60A (Capoiale) 5.83-6.67

VM 61D (Impianto mollusc. Manfredonia) 5.80-6.85

VM 70A (Mar Grande Loc. Tarantola) 5.38-6.48

VM 71A (Mar Piccolo I Seno Loc. Galeso) 4.97-6.01

VM 72A (Mar Piccolo II Seno Loc. Cimino) 4.68-5.90

Parametri analizzati e metodologie analitiche Sui vari campioni i parametri determinati sono stati:

• Metalli (Ag, Al, As, Cd, Cr, Cu, Fe, Hg, Ni, Pb, Va, Zn) • Pesticidi clorurati (4,4'-DDT; 2,4'-DDT; 4,4'-DDE; 2,4'-DDE; 4,4'-DDD; 2,4'-DDD; alfa-

HCH; beta-HCH; gamma-HCH; δ-HCH; Aldrin; Dieldrin; alfa-Endosulfan; Esaclorobenzene; pentaclorobenzene)

• Solventi clorurati (1,2,4-triclorobenzene; esaclorobutadiene) • Fenoli (pentaclorofenolo) • Pesticidi fosforati (Clorpyrifos; Clorfenvinfos) • Policlorobifenili (PCB) (Congeneri = 28, 52, 77, 81, 101, 118, 126, 128, 138, 153, 156,

169, 180) • Ftalati (Ftalato di bis (2-etilesile)) • Difenileteri bromati (pantabromo difeniletere) • Alchilfenoli (4(para)nonilfenolo; para-terz-octilfenolo) • Idrocarburi policiclici aromatici (IPA) (acenaftene; acenaftilene; antracene;

benz(a)antracene; benzo(a)pirene; benzo(b)fluorantene; benzo(ghi)perilene; benzo(k)fluorantene; crisene; dibenzo(ah)antracene;fenantrene; fluorantene; fluorene; indeno(1,2,3-cd)pirene; naftalene; pirene)

• Composti organostannici (monobutilstagno; dibutilstagno; tributilstagno) • Prodotti fitosanitari (trifuralin) • Biomarkers (test sulla stabilità delle membrane lisosomiali)

Le metodologie analitiche utilizzate sono state:

1. Metalli: digestione acida con microonde (Metodo EPA 3052) e determinazione mediante ICP-MS.

2. IPA e ftalato bis (2-etilesile): estrazione con microonde (metodo EPA 3546); purificazione mediante allumina (metodo EPA 3610B) e gel di silice (metodo EPA 3630). Determinazione in GC-MS-SIM (metodo EPA 8270).

3. Composti organostannici: estrazione con tropolone, derivatizzazione con reattivo di Grignard e determinazione in GC-MS-SIM. Metodo ICRAM riportato in ”Metodologie analitiche - Programma di monitoraggio per il controllo dell’ambiente marino-costiero. Triennio 2001- 2003”.

4. PCB, pesticidi clorurati, fosforati e fitofarmaci: estrazione con metodo EPA 3546); purificazione con Florisil e determinazione in GC-ECD. Metodo ICRAM riportato in ”Metodologie analitiche - Programma di monitoraggio per il controllo dell’ambiente marino-costiero. Triennio 2001- 2003”.

5. PBDE: metodo EPA 1614 6. Solventi clorurati: metodo EPA 5030, EPA 8260 7. Pentaclorofenolo: estrazione in microonde, determinazione in HPLC con rivelatori LC-35 a

fotodiodi e fluorimetrico (metodo IRSA19A); conferma in LC-MS. 8. Alchilfenoli: Metodica dell'ISS riportata nel volume "Rischio chimico associato alla qualità

delle acque del mare Adriatico"; Rapporti ISTISAN 04/4 (parte seconda).

Risultati e discussione I risultati ottenuti, riferiti sia al peso secco che umido dei molluschi sono riportati nelle tabelle allegate. 1) Concentrazioni dei metalli Le concentrazioni di metalli (Hg, Cd, Ni, V, Pb, Cr, Cu, Ag, As, Zn, Al e Fe) in peso umido e peso secco nella polpa di Mytilus galloprovincialis e di Tapes philipinarum sono riportate nelle Tabelle allegate. I risultati consentono di trarre alcune importanti considerazioni. La normativa vigente (Regolamento CE 1881/2006), relativamente alla commercializzazione dei molluschi bivalvi, impone dei limiti massimi di 0.5 mg kg-1 p.u per il mercurio, di 1.5 mg kg-1 p.u. per il piombo e di 1.0 mg kg-1 p.u per il cadmio. I valori determinati nella presente indagine per questi tre metalli sono al di sotto di questi limiti; modeste sono anche le concentrazioni riscontrate degli altri metalli analizzati. Per quanto riguarda il mercurio le concentrazioni più basse (0.01 mg Kg-1 p.u.) sono state riscontrate nelle stazioni AT9 (Lago di Varano) e VM60A (Parco allevamento mitili Capoiale); anche nella stazione MC13A (Foce T.te Candelaro), nella quale sono state campionate le vongole, è stato trovato lo stesso livello di concentrazione. Nella stazione VM71A (Mar Piccolo, I Seno, Loc. Galeso) è stata riscontrata la concentrazione più alta (0.05 mg Kg-1 p.u.). Il livello più basso di Pb (0.02 mg Kg-1 p.u.) è stato trovato nella stazione AT9 (Lago di Varano), quello più alto (0.33 mg Kg-1 p.u) nella stazione AT14 (Laghi Alimini). Per il Cd la concentrazioni più bassa (0.06 mg Kg-1 p.u.) è stata trovata nella stazione VM 72A (Mar Piccolo II Seno Loc. Cimino), quella più alta (0.35 mg Kg-1 p.u.) nella stazione AT 9 (Lago di Varano). Per quanto riguarda arsenico, nichel e alluminio le concentrazioni più basse sono state trovate nella stazione AT9 (Lago di Varano) con valori di 1.66 mg Kg-1 p.u., 0.06 mg Kg-1 p.u. e 11 mg Kg-1 p.u. rispettivamente, mentre per il rame e il ferro i livelli più bassi, rispettivamente di 0.73 mg kg-1 p.u. e 16 mg Kg-1 p.u. sono stati riscontrati nella stazione VM61D (Impianto molluschicoltura Manfredonia). Nelle stazioni AT9 (Lago di Varano), VM61D (Impianto molluschicoltura Manfredonia) e MC13A (Foce T.te Candelaro) sono stati trovati i livelli più bassi di Cr (inferiori al limite di rivelabilità, < 0.0002 mg Kg-1 p.u.), mentre nella stazione VM 72A (Mar Piccolo II Seno Loc. Cimino) è stato trovato il valore più basso di zinco (14 mg Kg-1 p.u.), anche se nella stazione MC13A (Foce T.te Candelaro), dove sono state campionate le vongole, è stato riscontrato il valore più basso (7.7 mg Kg-1 p.u.). Nella stazione AT14 (Alimini Grande) sono state determinate le concentrazioni più alte di As, Zn e Cu con livelli di 5.76 mg Kg-1 p.u., 31 mg Kg-1 p.u., e 2.08 mg Kg-1 p.u. rispettivamente, mentre nella stazione MC2A (Foce Fortore), VM60A (Capoiale) e MC 17A sono state trovate le concentrazioni più alte di Ni (1.03 mg Kg-1 p.u.), Al (96 mg Kg-1 p.u. ) e Fe (68 mg Kg-1 p.u.) rispettivamente. Nella stazione MC 2A (Foce Fortore) è stato trovato il valore più alto di Cr (0.29 mg Kg-1 p.u.). Il vanadio, invece, presenta livelli più o meno simili in tutte le stazioni campionate. Qui di seguito sono riportati i grafici di distribuzione relativi ai tre metalli più tossici.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

mg

kg-1

(p.u

.)

MC

2A

MC

11A

MC

13A

MC

17A

AT9

AT2

AT1

4

VM

60A

VM

61D

VM

70A

VM

71A

VM

72A

Stazioni

Cd

 Figura 2 - Distribuzione di Cd (mg Kg -1 p.u.) nei mitili prelevati nelle stazioni di campionamento (nella stazione MC 13A sono state campionate le vongole).

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

mg

kg-1

(p.u

.)

MC

2A

MC

11A

MC

13A

MC

17A

AT9

AT2

AT1

4

VM

60A

VM

61D

VM

70A

VM

71A

VM

72A

Stazioni

Hg

 Figura 3 - Distribuzione di Hg (mg Kg -1 p.u.) nei mitili prelevati nelle stazioni di campionamento (nella stazione MC 13A sono state campionate le vongole).

 

 

 

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5m

g kg

-1 (p

.u.)

MC

2A

MC

11A

MC

13A

MC

17A

AT9

AT2

AT1

4

VM

60A

VM

61D

VM

70A

VM

71A

VM

72A

Stazioni

Pb

 

Figura 4 - Distribuzione di Pb (mg Kg -1 p.u.) nei mitili prelevati nelle stazioni di campionamento (nella stazione MC 13A sono state campionate le vongole)

2) Concentrazioni di composti organici  Per quanto riguarda gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) i livelli sono compresi tra n.d. (non determinabile) (st. MC13A foce Candelaro) e 51.7 µg/Kg p.u.(st. VM70A Mar Grande loc. Tarantola). In nessuna stazione il benzo[a]pirene, indicato come marcatore della presenza di IPA cancerogeni, ha superato la concentrazione di 10 µg/Kg p.u. che è il limite fissato per questo composto nei molluschi bivalvi (regolamento CE N. 1881 /2006). Per quanto concerne i pesticidi clorurati, il 4,4’ DDE ( metabolita del DDT risultato praticamente assente in tutte le stazioni) è stato l’unico composto determinato in tutti i campioni. I livelli più elevati sono stati riscontrati nella stazione VM72A (II seno del Mar Piccolo loc. Cimino) e nella stazione MC17A (foce fiume Ofanto) con concentrazioni rispettivamente di 5.6 µg/Kg p.u e 4.5 µg/Kg p.u. Secondo il D.M 27/08/2004 la somma di tutti gli isomeri e metaboliti del DDT nei prodotti della pesca e dell’acquacoltura con contenuto di grassi inferiore al 5% non deve superare il limite di 50 µg/Kg p.u. Poiché il contenuto di grassi nei mitili oscilla intorno all’1%, le concentrazioni, in tutte le stazioni, sono da ritenersi inferiori ai limiti previsti. Tra i pesticidi fosforati il Clorpyrifos è stato riscontrato solo in campioni prelevati alle foci dei fiumi Fortore (MC 2A), Candelaro (MC13A) e Ofanto (MC 17A) con concentrazioni rispettivamente di 0.8, 3.8 e 7.4 µg/Kg p.u. Attualmente non esiste nessun riferimento legislativo per i limiti di concentrazione. I composti organostannici (TBT, DBT e MBT) sono stati determinati in mitili in corrispondenza della stazione VM 71A (Galeso, I seno del Mar Piccolo) con concentrazioni rispettivamente di 2.4, 3.9, e 0.9 µg Sn/Kg p.u. Per quanto concerne i policlorobifenili (PCB), la somma dei congeneri determinati ha presentato valori minimi di 0.4 µg/Kg p.u in corrispondenza della stazione foce Candelaro (MC 13A), mentre i livelli più elevati sono stati determinati in corrispondenza della stazione VM 71A (Galeso – Taranto) (70.8 µg/Kg p.u).  

Non-orto Mono-orto (77, 81, 126, 169) (118, 156)

MC 2A < 0.2 < 0.2MC 11A < 0.2 < 0.2MC 13A < 0.2 < 0.2MC17A < 0.2 0.3AT 9 < 0.2 < 0.2AT 2 * _ _

AT 14 < 0.2 < 0.2VM 60A < 0.2 < 0.2VM 61D < 0.2 < 0.2VM 70A < 0.2 1.5VM 71A < 0.2 9.4VM72A < 0.2 1.1

0.70.130.4

PCB (ng/g p.u.) Non Diossina simili

(28, 52,101,138,153,180)

1.51.3

_

0.91.40.916

61.48.7

Stazioni

 

∗ stazione non campionata 

Tabella 3 – Livelli dei PCB congeneri non-orto, mono-orto e non diossina simili  

Sebbene i policlorobifenili costituiscono un gruppo di 209 congeneri diversi, solo 12 di questi presentano proprietà tossicologiche analoghe a quelle delle diossine e sono pertanto denominati diossina-simili. Si tratta dei PCB non-orto 77, 81, 126, 169 e dei PCB mono-orto 105, 114, 118, 123, 156, 157, 167, 189. Poiché, ciascun congenere diossina-simile presenta un diverso livello di tossicità (TEF), il rischio derivante dalla presenza di questi composti viene espresso, più comunemente, in termini di Tossicità Equivalente (TEQ), ottenuto moltiplicando i valori di TEF per la relativa concentrazione nella matrice di interesse. Il regolamento CE 199/2006 del 3 febbraio 2006 stabilisce che la somma di diossine, furani e PCB diossina-simili non deve essere superiore, nel muscolo di pesce, a 8.0 pg TEQ/g p.u. (OMS-PCDD/F-PCB-TEQ). In assenza di normative inerenti i molluschi bivalvi, nel fare riferimento a questo limite, si è potuto prendere in considerazione solo i PCB non-orto come i congeneri 77, 81, 126, 169 e alcuni dei PCB mono-orto previsti (e precisamente i congeneri 118 e 156) (Tabella 3). Sebbene la contaminazione in località Galeso sia significativa, per nessuna stazione i valori di TEQ sono risultati superiori ai limiti di legge (Tabella 4). E’ da tenere presente, comunque, che nell’indagine condotta, il TEQ determinato è sottostimato in quanto le diossine e i furani non sono stati determinati, mentre dei 12 congeneri diossina-simili dei PCB indicati dal regolamento, l’analisi è stata prevista solo per i quattro non-orto e per due dei mono-orto. Sarebbe pertanto auspicabile, prevedere in futuro, la determinazione degli altri parametri (diossina, furani e PCB diossina-simili) al fine di avere una valutazione tossicologica più approfondita e, soprattutto, in linea con le direttive CE. Nelle figure 5-7 sono illustrati gli andamenti di alcuni contaminanti organici determinati nelle varie stazioni.

 

 

Non-orto Mono-orto (77, 81, 126, 169) (118, 156)

MC 2A 0.000 0.000MC 11A 0.000 0.000MC 13A 0.000 0.000MC17A 0.000 0.030AT 9 0.000 0.000AT 2 * _ _

AT 14 0.000 0.000VM 60A 0.000 0.000VM 61D 0.000 0.000VM 70A 0.000 0.150VM 71A 0.000 1.220VM72A 0.000 0.110

PCB (pgTEQ/g p.u.)Stazioni

 

Tabella 4 – Livelli dei PCB congeneri espressi come pg TEQ/g p.u.  

µg/Kg p.u. Clorpyrifos

8

7

6

5

4

3

2

1

0MC 2A  MC 11A MC 13A  VM 70A  VM 71A VM 72A MC17A AT 9 AT 14 VM 60A VM 61D

STAZIONI

 

Figura 5 - Distribuzione del pesticida Clorpyrifos nelle stazioni campionate.

 

 

 

 

 

 

 

µg/Kg p.u. 4,4' DDE

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 MC 2A  MC 11A MC 13A  VM 70A  VM 71A  VM 72A MC17A AT 9 AT 14 VM 60A VM 61D

STAZIONI

Figura 6 - Distribuzione del 4,4 DDE nelle stazioni campionate

 

µg/Kg p.u.  PCB (totali)

80

70

60

50

40

30

20

10

0 MC 11A MC 13A  VM 70A  VM 71A VM 72A MC 2A MC17A AT 9 AT 14 VM 60A VM 61D

STAZIONI

Figura 7 - Distribuzione dei PCB totali nelle stazioni campionate. 

 

 

 

 

DECRETO LEGGE N. 131 del 27 gennaio 1992

Attuazione della direttiva 79/923/CEE relativa ai requisiti di qualità delle acque destinate alla molluschicoltura.

Norme sanitarie – molluschi – allevamenti - acquacoltura

Allegato 2

Requisiti delle acque destinate alla molluschicoltura per la classificazione ai sensi dell'art.2 della legge 2 maggio 1997,

N.192.

nel corpo del mollusco in mg/kg peso fresco

Hg 0.7

Pb 2.0

REGOLAMENTO (CE) N. 1881/2006 DELLA COMMISSIONE del 19 dicembre 2006

che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari

Parte 3: Metalli

Prodotti alimentari

Tenori massimi (mg/kg peso fresco)

Pb Molluschi bivalvi 1.5

Hg Molluschi bivalvi 0.5

Cd Molluschi bivalvi 1.0

Parte 5: Diossine e PCB*

Prodotti alimentari

Tenori massimi (pg TEQ/g peso fresco)

Somma di diossine Muscolo di pesce e prodotti della

pesca e loro derivati esclusa l'anguilla

4.0

Somma di diossine e PCB diossina simili

Muscolo di pesce e prodotti della pesca e loro derivati esclusa

l'anguilla 8.0

Somma di diossine Muscolo di anguilla e derivati 4.0

Somma di diossine e PCB diossina simili

Muscolo di anguilla e derivati 12.0

*Diossine [somma di policlorodibenzo-para-diossine (PCDD) e policlorodibenzofurani (PCDF), espressi in equivalenti di tossicità dell'Organizzazione mondiale della sanità (OMS) utilizzando gli OMS-TEF (fattori di tossicità equivalente)], e somma di diossine e PCB diossina-simili [somma di PCDD, PCDF e policlorobifenili (PCB), espressi in equivalenti di tossicità dell'OMS, utilizzando gli OMSTEF].

Parte 6: Idrocarburi policiclici aromatici

Prodotti alimentari Tenori massimi

(µg/kg peso fresco)

Benzo(a)pirene * Molluschi bivalvi 10.00

*Utilizzato come marcatore della presenza e degli effetti degli IPA cancerogeni.

RGOLAMENTO (CE) N. 565/2008 DELLA COMMISSIONE del 18 giugno 2008

che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari; per quanto riguarda la definizione del tenore massimo di diossine e PCB nel fegato di pesce.

Articolo 1: Diossine e PCB*

Prodotti alimentari

Tenori massimi (pg TEQ/g peso fresco)

Somma di diossine Fegato di pesce e suoi derivati

-

Somma di diossine e PCB diossina simili

Fegato di pesce e suoi derivati

25.0

DECRETO MINISTERIALE del 27/08/2004 Prodotti fitosanitari: limiti massimi dei residui delle sostanze attive nei prodotti destinati

all’alimentazione

Prodotti fitosanitari, allegato 4

Prodotti della pesca e dell'acquacoltura citati nell'allegato 1 parte E

valori espressi in mg/kg peso fresco

Gruppo % di

sost.grassa nel prodotto

Aldrin e/o dieldrin

Esacloro-benzene

HCH (somma di isomeri diversi dal gamma)

Linadano (gamma

HCH)

DDT (isomeri e metaboliti compreso il

DDD espressi come DDT

1 ≤ 5 0.005 0.010 0.010 0.025 0.05

2 > 5-20 0.010 0.020 0.020 0.050 0.10

3 >20-40 0.020 0.040 0.080 0.100 0.15

4 >40 0.040 0.080 0.080 0.100 0.50 La presente tabella contiene solo le sostanze esaminate nella campagna di monitoraggio effettuata.

Di seguito sono riportati alcuni riferimenti bibliografici inerenti il contenuto lipidico dei molluschi bivalvi M. galloprovincialis.

Riferimento bibliografico

Perugini et al., 2004 Naso et al., 2005 Bayarry et al., 2001 Stefanelli et al., 2004

Mar Adriatico Golfo di Napoli Mar Adriatico Mar Adriatico

% di grasso nel Mytilus

galloprovincialis 1.00 % 1.00 ± 0.23 % 1.4 % 1.16% - 0.9% - 1.51%

La quantità di grasso varia comunque a seconda delle stagioni e del periodo riproduttivo.

Bibliografia

Bayarry S, Baldassarri LT, Iacovella N, Ferrara F, di Domenico A, 2001. PCDDs, PCDFs, PCBs and DDE in edible marine species from the Adriatic Sea.

Naso B, Perrone D, Ferrante MC, Bilancione M, Lucisano A, 2005. Persistent organic pollutants in edible marine species from the Gulf of Naples, Southern Italy. Science of the Total Environment, 343: 83-95.

Perugini M, Cavaliere M, Giammarino A, Mazzone P, Olivieri V, Amorena M, 2004. Levels of polychlorinated biphenyls and organochlorine pesticides in some edible marine organisms from the Central Adriatic Sea. Chemosphere, 57(5):391-400.

Stefanelli P, Di Muccio A, Ferrara F, Attard Barbibi D, Generali T, Pelosi P, 2004. Estimation of intake of organochlorine pesticides and chlorobiphenils through edible fishes from the Italian Adriatic Sea during 1997. Food Control, 15: 27-38.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Determinazione in vivo della stabilità delle membrane lisosomiali mediante test NRR per

campioni di bivalvi prelevati in ambienti acquatici pugliesi.

Premessa

Attività svolta:

1) determinazione degli indici biometrici e determinazione del sesso di campioni di bivalvi

quali mitili della specie Mytilus galloprovincialis e vongole della specie Tapes philippinarum;

2) determinazione in vivo della destabilizzazione delle membrane lisosomiali (NRRa) in

campioni di emolinfa di mitili della specie M. galloprovincialis;

3) messa a punto del protocollo sperimentale per la determinazione in vivo della

destabilizzazione delle membrane lisosomiali (NRRa) in campioni di emolinfa di vongole;

4) determinazione in vivo della destabilizzazione delle membrane lisosomiali (NRRa) in

campioni di emolinfa di vongole della specie T. philippinarum;

5) elaborazione dei dati ottenuti mediante analisi statistica.

1. Introduzione

1.a. Biomarker

Biomarker viene attualmente definito quella risposta biologica alla contaminazione chimica

ambientale che si verifica a livello sub-individuale segnalando una deviazione dallo stato normale;

tale risposta può essere misurata all’interno di un organismo o in suoi prodotti (urine, feci, capelli,

penne etc.) e non può essere rilevata nell’organismo intatto (Van Gastel e Van Brummelen, 1996).

D’altra parte, in senso lato, biomarker viene inteso come qualsiasi misurazione che rifletta il

rischio (che può essere chimico, fisico o biologico) cui un sistema biologico è sottoposto (WHO,

1993).

I biomarkers, in funzione della specificità di risposta nei confronti di agenti inquinanti, si possono

distinguere in specifici e generici (Peakall et Shugart, 1993).

Fanno parte dei biomarkers specifici quelle risposte molecolari e biochimiche che si

manifestano in un organismo a seguito dell’esposizione ad una specifica classe di contaminanti.

Si definiscono come biomarkers generici quelle risposte molecolari, cellulari e fisiologiche che

segnalano effetto e/o esposizione senza fornire indicazioni più precise sulla classe di contaminanti

responsabile della sindrome di stress. Pertanto, tale deviazione dallo stato normale può essere

attribuita ad un insieme complesso di contaminanti accumulato nei tessuti dell’organismo

sentinella. A questo secondo gruppo appartengono biomarkers come la destabilizzazione delle

membrane lisosomiali.

1.b. Destabilizzazione delle membrane lisosomiali

La stabilità della membrana lisosomiale nel mitilo risulta un indice estremamente sensibile dello

stato funzionale delle cellule dell’organismo (Moore, 1985), strettamente correlato all’insorgenza

di situazioni patologiche provocate da metalli pesanti e inquinanti organici. Tale indice, pertanto, è

in grado di segnalare l’esistenza di una generica sindrome di stress ascrivibile all’insieme dei

contaminanti chimici accumulati nei tessuti degli organismi.

2. Materiali e Metodi

2.a. Metodi: NRRa

Il metodo utilizzato per la determinazione della stabilità lisosomiale corrisponde a quello descritto

in MANUAL ON THE BIOMARKERS RECOMMENDED FOR THE MED POL

BIOMONITORING PROGRAMME messo a punto nell’ambito dell’UNEP-MAP (United Nations

Environment Programme – Mediterranean Action Plan) e raccomandato per il programma di

biomonitoraggio MED POL (UNEP, 1999). In base a tale metodica la stabilità della membrana

lisosomiale viene misurata su emociti di mitilo attraverso Neutral Red retention assay (Lowe et

al., 1992). Il Neutral Red (NR) è un colorante lipofilico e come tale attraversa facilmente le

membrane plasmatica e lisosomiale. Nei lisosomi, a causa del pH fortemente acido di questi

organuli cellulari, passa nella forma dissociata che gl’impedisce di ritornare liberamente nel

citoplasma e lo rende visibile microscopicamente.

L’efficienza con cui il NR rimane intrappolato nei lisosomi dipende dal pH dei lisosomi ossia dalla

funzionalità della pompa protonica (Segien,1983) presente sulla membrana lisosomiale che

trasporta attivamente H+ dal citoplasma nei lisosomi (Ohkuma et al., 1982). Eventuali danni alla

membrana lisosomiale e possibile inibizione della pompa protonica provocati da inquinanti

chimici possono essere indagati con il test del neutral red retention assay poiché esso risulta, in

ultima analisi, un indice per la misura del rilascio del contenuto lisosomiale nel citosol. Come

dimostrato da Lohse nel 1990 il metodo NRRa è sensibile a molte classi di contaminanti chimici

sia organici sia inorganici.

Praticamente, 40 µl di emolinfa diluita 1:1 in soluzione salina (Hepes 20mM, NaCl 436 mM,

MgSO4 53mM, KCl 10mM, CaCl2 10mM) sono stati posti su un vetrino polilisinato e lasciati

incubare in camera umida (16°C) per 30 minuti. Sulle cellule aderite al vetrino sono stati aggiunti

40μl di NR (20mg di NR in 1ml di DMSO; 5 μl di tale soluzione si diluiscono in 995 μl di

soluzione salina fisiologica) e lasciati incubare in camera umida (16°C) per 15 minuti.

Pool di almeno 10 individui sono stati selezionati per il prelievo dei campioni di emolinfa.

2.b. Analisi d’immagine

Il preparato è stato osservato al microscopio (Eclipse 600 by Nikon) con obiettivo ad

ingrandimento 20X e 40X; le letture sono state effettuate in triplo per ciascun campione per 3 ore

consecutive, ogni 15 minuti per la prima ora e successivamente ogni 30 minuti per le due ore

successive.

Mediante il sistema per analisi d’immagine Lucia Measurement (Nikon) è stato determinato il

tempo in corrispondenza del quale il 50% dei lisosomi delle cellule visibili in un determinato

campo del campione perde la colorazione caratteristica del rosso neutro.

Figura 1. Sequenza di rilascio del NR dai lisosomi al citosol durante il test del NRR tratta da Dailianis et al. (2003). La barra dimensionale

indica 21 µm in (a), 25 µm in (b–d).

In Fig. 1 (a-d) sono riportati i vari stadi che gli emociti di M. galloprovincialis attraversano

durante il test NRR. In 1a è possibile osservare come dopo 30 min d’incubazione con il Rosso

Neutro i lisosomi degli emociti ritengano tutto il colorante. In 1b è riportato il caso dei 45 min

d’incubazione dove si possono notare i primi segni d’espansione dei lisosomi. In fig. 1c

corrispondente al tempo 60 minuti d’incubazione è possibile osservare la maggiore espansione dei

lisosomi e l’iniziale rilascio del colorante all’interno del citoplasma. Quando entrambe le

alterazioni si verificano in più del 50% delle cellule il test del NRR si considera terminato. In Fig.

1d i lisosomi mostrano il totale rilascio del colorante nel citoplasma.

2.c. Analisi statistica dei dati

L’analisi statistica dei dati è stata effettuata mediante software dedicato GraphPad PRISM

versione 2.0..

3. Risultati

3.a. Indici biometrici

In Tab. 1 sono riportati gli indici biometrici medi relativi ai campioni di M. galloprovincialis.

Lunghezza, larghezza ed altezza valve sono stati determinati mediante calibro ventesimale. Il

campione con dimensioni medie maggiori è risultato proveniente da impianto d’allevamento:

VM61D (Manfredonia). D’altra parte mitili non allevati ma bensì nativi come, ad esempio, MC2A

proveniente dalla foce del Fortore hanno mostrato dimensioni nettamente inferiori.

Il differenziamento sessuale dedotto dal colore delle carni (il colore delle carni bianco latteo

definisce gli organismi di sesso maschile, rosso arancio gli organismi di sesso femminile) è stato

manifestato dai campioni con dimensioni maggiori o uguali a circa 5 cm; d’altra parte i campioni

MC17A (Ofanto) ed MC2A (Foce Fortore) con lunghezza valve compresa all’incirca tra 3.5 cm e

3.8 cm, dimensioni inferiori al minimo necessario per lo sviluppo degli organi sessuali, non hanno

manifestato alcun differenziamento sessuale degli individui. VM72A (Cimino Taranto), VM61D

(Manfredonia) ed AT14 (Alimini Grande) hanno presentato un forte sbilanciamento nella

distribuzione in sessi.

Campione Lunghezza Er. St. Larghezza Er. St. Spessore Er. St. Sesso

(M. galloprovincialis) % M / FVM61D (Manfredonia) 6.37 ± 0.27 3.19 ± 0.10 2.29 ± 0.09 20 / 80VM60A (Capoiale) 6.06 ± 0.15 2.81 ± 0.08 2.04 ± 0.04 70 / 30AT9 (Varano) 6.00 ± 0.17 2.91 ± 0.07 2.09 ± 0.09 60 / 30VM70A (Tarantola) 5.78 ± 0.08 3.03 ± 0.08 2.19 ± 0.08 50 / 50VM71A (Galeso) 5.38 ± 0.15 2.62 ± 0.08 1.75 ± 0.06 40 / 40AT14 (Alimini Grande) 5.19 ± 0.19 2.96 ± 0.07 2.01 ± 0.08 80 / 20VM72A (Cimino - Taranto) 5.17 ± 0.15 2.62 ± 0.08 1.86 ± 0.09 90 / 10MC11A (Mattinata) 4.93 ± 0.12 2.72 ± 0.09 1.71 ± 0.05 60 / 40MC17A (Ofanto) 3.76 ± 0.08 2.00 ± 0.04 1.43 ± 0.04 NCMC2A (Foce Fortore) 3.48 ± 0.08 1.74 ± 0.07 1.54 ± 0.05 NCTabella 1: lunghezza, larghezza e spessore valve determinati mediante calibro ventesimanle su campioni di almeno 10 individui di M. galloprovincialis . I dati sono espressi come media ± errore standard (N=10). Nell'ultima colonna è riportata la percentuale media di individui di sessomaschile. Il sesso è stato dedotto dalla colorazione delle carni (NC = non classificato).

cm cm cm

In Tab. 2 sono riportati gli indici biometrici medi relativi ai campioni di vongole. Il campione di

dimensioni medie maggiori (lunghezza e larghezza) è risultato MC13A (Foce Candelabro),

tuttavia MC15A ha mostrato un maggiore spessore medio.

3.b. Determinazione in vivo della stabilità delle membrane lisosomiali: N.R.R.a. (Neutral

Red Retention assay)

In Tab. 3 sono riportati i risultati ottenuti relativamente ai campioni di M. galloprovincialis. Il

tempo di ritenzione medio (determinato considerando per ciascun pool di 10 individui il NRR time

in triplo) corrisponde al NRR time della rispettiva stazione di campionamento. Le varie stazioni di

campionamento hanno mostrato tempi di ritenzione del rosso neutro significativamente diversi tra

loro con P = 0.0099. L’analisi statistica dei dati è stata effettuata mediante un test non parametrico

come il Kruscall-Wallis test avendo assunto come non gaussiana la distribuzione dei valori di

NRR time per ogni singolo campione. Si sottolinea come il tempo di ritenzione del rosso neutro

nel mitilo corrisponda alla relativa stabilità delle membrane lisosomiali e, di conseguenza,

rappresenti un indice estremamente sensibile dello stato funzionale delle cellule dell’organismo. Campione

M. galloprovincialisAT14 (Alimini Grande) 100.00 ± 10.00VM71A (Galeso) 80.00 ± 10.00AT9 (Varano) 80.00 ± 10.00VM70A (Tarantola) 70.00 ± 10.00MC17A (Ofanto) 70.00 ± 10.00VM60A (Capoiale) 45.00 ± 8.66VM72A (Cimino - Taranto) 45.00 ± 10.00VM61D (Manfredonia allevamento) 30.00 ± 10.00MC2A (Foce Fortore)MC11A (Mattinata)

NRRtmin

NCNC

Tabella 3. Tempo di ritenzione del Rosso Neutro (espresso in minuti) dicampioni di emolinfa provenienti da pool composti da almeno 10 individui.Le prove sono state condotte in triplo e i dati sono espressi come media ± Err.St. Le righe con i simboli NC si riferiscono a campioni fortemente parassitati.

Com’è possibile notare osservando la tabella, AT14 (Alimini Grande) è stata la stazione di

campionamento che ha mostrato il maggiore tempo medio di ritenzione del NR (100.0 ± 10.0),

corrispondente ad una elevata stabilità delle membrane lisosomiali e ad un probabile minore

impatto dello stress chimico sugli organismi viventi al suo interno. D’altra parte notevolmente

inferiore è risultato il NRR time della stazione di campionamento VM61D (Manfredonia) dove i

mitili hanno mostrato un tempo di decolorazione dei lisosomi degli emociti compreso tra 40 e 20

minuti. Occorre a tal proposito notare come, in base ai dati presenti in letteratura, tempi di

destabilizzazione della membrana lisosomiale inferiori a 60 min vengano considerati patologici

(Moore et al, 2006; Lowe et al., 2006; Regoli et al., 2004). Tuttavia, sui bassi valori di stabilità

lisosomiale della stazione di Manfredonia potrebbe aver influito il lungo periodo di tempo

intercorso tra il prelievo del campione ed il suo dosaggio (si veda Tab. 1 del capitolo Materiali e

Metodi). Tempi medi di ritenzione del NR compresi tra il valore massimo di AT14 (Alimini

Grande) ed il valore minimo di VM61D (Manfredonia), nonchè prossimi a 60 minuti, tempo

minino da ritenersi possibile indicatore di situazione non patologica, sono stati determinati

nell’emolinfa degli altri campioni. In Fig. 2(A-F) sono riportate le immagini rappresentative del

grado di decolorazione dei lisosomi degli emociti dei campioni di mitili durante il test del NRR, al

tempo d’incubazione massimo di 60 minuti. Osservando la figura è possibile notare come

l’espansione dei lisosomi aumenti passando dall’immagine 3.A. (dove, in realtà, non è visibile

alcun segno di rilascio del colorante) all’immagine 3.E. (le immagini 3.A-E. sono relative allo

stesso tempo d’incubazione ossia 60 min); allo stesso modo si può notare, oltre all’espansione dei

lisosomi, il rilascio del colorante nel citoplasma nelle immagini 3.F–H.. (tali immagini sono

relative al tempo d’incubazione 45 min per Capoiale-Cimino e al tempo d’incubazione 30 min per

Alimini).

In Tab. 4 sono riportati i risultati ottenuti relativamente ai campioni di T. philippinarum. Il tempo

di ritenzione medio (determinato considerando per ciascun pool di 10 individui il NRR time in

triplo) per ciascun pool di 10 individui corrisponde al NRR time della rispettiva stazione di

campionamento. Le stazioni MC13A (Foce Candelaro) ed MC15A (Foce Carapelle) si attestano su

valori di ritenzione del NR compresi tra 80 min e 52 minuti circa, mentre la stazione MC15A è

risultata non classificabile.

A tal proposito occorre precisare come l'emolinfa prelevata dai campioni MC2A (Foce Fortore),

MC11A (Mattinata) e MC15A (Carapelle) abbia mostrato al suo interno la presenza di un’elevata

quantità di organismi presumibilmente parassiti. Non è stato possibile effettuare il riconoscimento

degli organismi suddetti, tuttavia occorre notare come una tale condizione patologica sia

determinante per l'alterazione delle variabili fisiologiche indipendentemente da ulteriori fattori di

stress quali, ad esempio, l'esposizione a sostanze chimiche contaminanti. In Fig. 3 (A-C) sono

riportate alcune immagini rappresentative acquisite durante l'osservazione dei preparati relativi ai

campioni parassitati.

Figura 2.A.: AT14 (Alimi Grande), tempo d’incubazione 60 minuti, ingrandimento 40X.

Figura 2.B.: VM71A (Galeso), tempo d’incubazione 60 min, ingrandimento 40X.

Figura 2.C.: AT9 (Varano), tempo d’incubazione 60 min, ingrandiamneto 40X.

Figura 2.D. VM70A (Tarantola), tempo d’incubazione 60 min, ingrandimento 40X.

Figura 2.E.: MC17A (Ofanto), tempo d’incubazione 60 min, ingrandimento 40X.

Figura 2.F.: VM60A (Capoiale), tempo d’incubazione 45 min, ingrandimento 40X.

Figura 2.G.: VM72A (Cimino), tempo d’incubazione 45 min, ingrandimento 40X.

Figura 2.H.: VM61D (Manfredonia), tempo d’incubazione 30 min, ingrandimento 40X.

Figura 3.A.: MC2A (Fortore), ingrandimento 40X

Figura 3.B.: MC15A (Carapelle), ingrandimento 40X

Figura 3.C.: MC15A (Carapelle), ingrandimento 40X

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