Prove biotossicologiche nella valutazione della salubrità ... · I tossici alimentari Agenti...

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AGENZIA REGIONALE PER LA PROTEZIONE AMBIENTALEDELLE MARCHE

Prove Prove biotossicologichebiotossicologichenella valutazione della nella valutazione della salubrità degli alimentisalubrità degli alimenti

Dr.ssa Gabriella Giorgi

Il Ministero della Sanità con decreto n° 38 del 25/05/1997 ai sensi dell’art.12 del D.Lgs.

N°116/92 ha autorizzato il S.M.S.P. di Pesaro ora

Dipartimento Provinciale ARPAM

come stabilimento utilizzatore di animali

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I saggi biotossicologiciARAARA


sostanze tossiche di

natura biologica o chimica

potere patogeno di alcuni microrganismi

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I tossici alimentari

Agenti tossici Agenti tossici naturalmente presenti naturalmente presenti

negli alimentinegli alimenti

Contaminanti:Contaminanti:

Sostanze che possono essere Sostanze che possono essere addizionate addizionate volontariamentevolontariamente..

Sostanze che possono pervenire nSostanze che possono pervenire nei ei prodotti alimentari prodotti alimentari accidentalmenteaccidentalmente, , durante le fasi che dalla raccoldurante le fasi che dalla raccolta ta -- produzione produzione portano gli alimenti sulla nostrportano gli alimenti sulla nostra tavola a tavola

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Tossici naturalmente Tossici naturalmente presenti negli Alimentipresenti negli Alimenti

nei nei vegetalivegetali

in numerose specie ittiche

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AltreAltreteobromina, saponine di spinaci e asparagi, ecc.

Ittiotossine Ittiotossine

(tetraodontotossine, istamina)

Tossine presenti nei funghiTossine presenti nei funghi(muscarine, falloidine)

Sostanze tossiche presenti nelle spezieSostanze tossiche presenti nelle spezie(safrolo, estragolo ecc.)

Contaminanti degli Alimenti

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Possono avere un’origine:Possono avere un’origine:

chimicachimica biologicabiologica

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La contaminazione chimica può dipendere:

Pratiche agronomiche (pesticidi)Pratiche agronomiche (pesticidi)

Pratiche zootecniche (ormoni, Pratiche zootecniche (ormoni, chemioantibioticichemioantibiotici))

Contaminanti di processo e da imballaggio Contaminanti di processo e da imballaggio ((nitrosamminenitrosammine,IPA, monomeri di materiali di ,IPA, monomeri di materiali di

confezionamentoconfezionamento))

Contaminazione ambientale (metalli pesanti es. Contaminazione ambientale (metalli pesanti es. mercurio, cromo e cadmio, PCB, IPA)mercurio, cromo e cadmio, PCB, IPA)

Gli alimenti interagendo con l’ambiente e con l’uomo finiscono per veicolare dei microrganismi che possono essere patogeni. La mancata adozione di adeguate misure igieniche o l’adozione di processi di produzione inadeguati favoriscono la contaminazione, la moltiplicazione dei microrganismi e la produzione di tossine.

Contaminazione biologica

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Effetti tossici sull’organismoEffetti tossici

sull’organismo

TOSSICITATOSSICITA’’ ACUTA: ACUTA: ll’’effetto si manifesta effetto si manifesta rapidamente dopo rapidamente dopo

ll’’esposizioneesposizione

TOSSICITATOSSICITA’’CRONICA:CRONICA:ll’’effetto si effetto si

manifesta a manifesta a lungo termine lungo termine ((micotossinemicotossine))

Botulismo alimentareARAARA


Sindrome neuroparalitica dovuta ad ingestione di alimenti contenenti la tossina botulinica preformata

Il C. botulinum è un microrganismo ubiquitario, presente sotto forma di spore, principalmente nel suolo e nell’acqua.

Le spore possono contaminare gli alimenti sia di origine animale (salsicce, insaccati, pesce e le loro uova) che vegetale (spinaci, olive, funghi).

Le spore se sopravvivono ai processi termici, possono trovare condizioni adatte alla loro germinazione (anaerobiosi) e così in fase germinativa produrre la tossina.

trattate termicamente ad una trattate termicamente ad una temperatura e per un tempo temperatura e per un tempo

insufficientiinsufficienti

contaminate dalla contaminate dalla terraterra

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leggermente leggermente acide acide

((pHpH > 4,5)> 4,5) con valori con valori di di AAww > 0,93> 0,93

conservate conservate fuori fuori

frigoriferofrigorifero

gli alimenti pigli alimenti piùù a rischio sono le a rischio sono le conserve vegetali:conserve vegetali:

LL’’utilizzazione degli animali utilizzazione degli animali nellnell’’ambito del controllo degli ambito del controllo degli alimenti alimenti èè specificata dalla specificata dalla normativa ufficiale oppure normativa ufficiale oppure èènecessaria quando non vi necessaria quando non vi sono metodi alternativi sono metodi alternativi altrettanto efficaci altrettanto efficaci scientificamente validi, scientificamente validi, ragionevolmente e ragionevolmente e praticamente applicabili.praticamente applicabili.

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Saggi Saggi biotossicologicibiotossicologicinel controllo degli nel controllo degli

alimenti

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alimenti

Tossine Tossine botulinichebotuliniche

Topi albini razza Topi albini razza SwissSwiss

Iniezione Iniezione intraperitonealeintraperitoneale

Rapporti ISTISAN Rapporti ISTISAN 96/3596/35

TOSSINETOSSINEBATTERICHEBATTERICHE

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D.M. 31/07/95D.M. 31/07/95Decreto 16 Decreto 16

maggio 2002maggio 2002DSPDSPTopi albini Topi albini

razza razza SwissSwiss1818--20g20g

Iniezione Iniezione intraperitonealeintraperitoneale

BiotossineBiotossinealgalialgali

PSPPSP

D.M. 31/07/95D.M. 31/07/95Decreto 16 maggio Decreto 16 maggio

20022002

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n°5 Topi albini razza Swiss

16-18gIniezione

intraperitoneale

O.M.

07/12/93

Infezioni batteriche (Listeria monocytogenes)

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Tossicità acutaTossicità acutaSostanze Sostanze tossiche tossiche

sconosciutesconosciute

Topi Topi

RattiRattiGavaggioGavaggio / / inieziniez. I.p. / . I.p. /

alimentazione alimentazione normalenormale RapportoRapporto

ISTISAN 90/2ISTISAN 90/2

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Determinazione della tossicità acutaDeterminazione della tossicità acuta(sostanze tossiche sconosciute)(sostanze tossiche sconosciute)

la tossicità di una sostanza dipende dalla

dose introdotta, dalla via, dal veicolo di

somministrazione e dallo stato di salute pregresso

dell’organismo

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AGENZIA REGIONALE PER LA PROTEZIONE AMBIENTALEDELLE MARCHE Metodica

somministrazione della somministrazione della pipiùù alta quantitalta quantitàà di alimento di alimento

sospetto allsospetto all’’animale da animale da esperimento, in modo da esperimento, in modo da evidenziare gli eventuali evidenziare gli eventuali

effetti tossicieffetti tossici

osservazione degli effetti osservazione degli effetti sugli animali utilizzati per 24sugli animali utilizzati per 24--48 h massimo 72h, poich48 h massimo 72h, poichéésono richieste decisioni sono richieste decisioni rapiderapide

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Valutazione dei risultati: esclusa la responsabilità di fattori accidentali, la presenza di segni clinici o di lesioni significative anche in un solo animale (con assenza di manifestazioni nel gruppo di controllo), può essere considerata come indice della presenza di sostanze tossiche.

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Alimenti solidi omogenizz.(sol.fiologica)/ liquidi

centrifugazione a 3000 r.p.m. per 15’

somministrazione per gavaggio o per via alimentare o inoculazione i.p.

osservazione giornaliera degli animali con particolare attenzione ai sintomi

Ogni animale morto durante il trattamento o entro il successivo periodo di osservazione verrà sottoposto ad autopsia → I.Z.S.

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-- Facile da eseguire e Facile da eseguire e non richiede particolari non richiede particolari mezzimezzi

-- Possibilità di una Possibilità di una parziale parziale classificclassific. della . della tossinatossina

-- Rivela sempre l’effetto Rivela sempre l’effetto tossico del campione tossico del campione inoculato qualsiasi sia inoculato qualsiasi sia la tossina presentela tossina presente

VantaggiVantaggi

--Relazione logaritmica tra Relazione logaritmica tra dose e tempo di morte dose e tempo di morte (possibilità di compiere (possibilità di compiere errori specialmente in morti errori specialmente in morti rapide o molto lente)rapide o molto lente)

-- Risposte immunitarie Risposte immunitarie dipendenti dalla razzadipendenti dalla razza

-- Variabilità del +/Variabilità del +/-- 20%20%

-- Problemi eticiProblemi etici

SvantaggiSvantaggi

Prova biologicaProva biologica

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La necessità di una regolamentazione in materia di protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici, ha determinato l’emanazione della direttiva 89/609/CEE del 24/11/1986, che è stata recepita con il D.Lgs.n. 116 del 27/01/1992.

Il decreto disciplina tutte le attività connesse all’utilizzo di animali vivi con finalità sperimentali e/o scientifiche, individuando il concetto di “benessere animale”, che viene inteso come “assenza di stress, dolore, angoscia e sofferenza”.

FINALITA’ strettamente etica

OGGETTO attività sperimentale nel suo insieme di

PROCEDURE- allevamento -mantenimento dell’animale - sperimentazione in senso stretto

RISULTATO ridurre gli esperimentiridurre il n° di animali utilizzatiridurre la sofferenza.

NormativaNormativa

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AGENZIA REGIONALE PER LA PROTEZIONE AMBIENTALEDELLE MARCHE Il Decreto:

• individua tre tipi di stabilimento:• di allevamento• fornitore• utilizzatoreper ognuno dei quali sono presenti adempimenti specifici. Viene previsto che le attività sperimentali possono essere svolte solo presso stabilimenti utilizzatori regolarmente autorizzati e sotto la diretta responsabilità del ricercatore.A questo proposito, ricordiamo che il S.M.S.P. di Pesaro, ora Dipartimento Provinciale ARPAM, èstato autorizzato con Decreto del Ministero della Sanità n. 38/97 del 25/05/1997,ai sensi dell’art. 12 del D.Lgs. n. 116/92 come stabilimento utilizzatore di animali ed è l’unico Dipartimento Provinciale ARPAM autorizzato nella Regione Marche.

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sia implementato un sistema di AUTOCONTROLLO:- personale qualificato e in numero sufficiente ad assicurare il benessere ed il controllo degli animali: individuazione del responsabile o dei responsabili della gestione e organizzazione dello stabilimento e di riconosciuta esperienza di animali; personale tecnico in numero adeguato addetto alla cura ed al trattamento degli animali ed alla sanificazione degli ambienti e di tecnici addetti alla manutenzione degli impianti;- controllo sanitario permanente di un medico veterinario (dipendente dello stabilimento o libero professionista).STABILISCE I REQUISITI STRUTTURALI ED AMBIENTALI DELL’AREA DI PERMANENZA DEGLI ANIMALI- Area di permanenza degli animali, suddivisa nelle seguenti zone:a. zona di stabulazioneb. zona di trattamento degli animalic. zona di osservazione degli animali trattati.- Area di servizio (zona lavaggio materiali, zona deposito, zona raccolta carcasse e scarti animali.)

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Requisiti richiesti per i locali di permanenza

degli animali:ventilazione (15ventilazione (15--20 ricambi

20 ricambiaria/h)aria/h) temperatura( 20-24 °C)

rumore (isolamento da rumori intensi) rumore (isolamento da rumori intensi)

e(controllo delle(controllo dell’’intensitintensitàà luminosa e del ciclo

luminosa e del ciclo

ce/buio nel rispetto delle esigenze biologiche degli animali)

ce/buio nel rispetto delle esigenze biologiche degli animali)

illuminazionilluminazionlulu

umidità relativa, 55% (deve essere

compresacompresa tra 40-70%)

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INDIVIDUA LE CONDIZIONI DI MANTENIMENTO DEGLI INDIVIDUA LE CONDIZIONI DI MANTENIMENTO DEGLI ANIMALI:ANIMALI:

ARRIVO ALLO STABILIMENTO UTILIZZATORE

- Accettazione alla consegna

- Ispezione dei contenitori

- Ispezione degli animali (stato di salute apparente, numero, peso)

- Trasferimento in gabbie pulite, alimentati e dissetati

- Segnalazione di qualunque aspetto anomalo

REGISTRAZIONE

- Registri vidimati dal Ministero della Sanità

- Indicazioni: specie, numero, provenienza, data, lotto

- Movimenti di ciascun animale

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STABULAZIONE- Libertà di movimento

- Grandezza gabbie: stabilite misure minime

- Alimentazione adeguata alla specie

- Acqua potabile in permanenza

- Acclimatazione prima dei saggi

MODALITÀ E PRECAUZIONE DURANTE L’ESECUZIONE DEI SAGGI:Effettuare una corretta standardizzazione della preparazione dell’inoculoControllo dello stato di salute degli animali ed utilizzare per ogni saggio animali omogeneiControllo del peso

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Un altro elemento fortemente innovativo introdotto dal D.L. gsN°116/92 incoraggia l’utilizzo di metodi “alternativi”all’uso degli animali e sancisce in modo preciso che “gli animali possono essere utilizzati solamente quando non è possibile ricorrere ad altro metodo scientificamente valido, ragionevolmente e praticamente applicabile”.

Può essere definita “alternativa” qualunque tecnica che sostituisca l’uso di animali, che riduca il numero di animali necessario per un particolare test o che riduca la sofferenza provocata agli animali.

Allo stato attuale esistono pochi metodi alternativi: sono statistudiati saggi ELISA, RIA, tuttavia problemi legati alla purezza dei reagenti, alla frequenza dei risultati falsamente positivi che taluni davano e quelli legati alla sensibilità ne hanno limitato l’uso per un’applicazione routinaria.

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CARATTERISTICHE CHE DEVE POSSEDERE UN METODO

ALTERNATIVO:

Più

riproducibilità

Maggiore rapidità

Minor costo Più accettabile dal punto di vista etico

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A tuttA tutt’’oggi non sono ancora oggi non sono ancora disponibili test disponibili test validativalidati che che

sostituiscono lsostituiscono l’’uso di animali uso di animali da laboratorio nel controllo da laboratorio nel controllo

ufficiale dei prodotti alimentari ufficiale dei prodotti alimentari

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Saggi biotossicologici anno 1997

24660

63 5tossine botuliniche

DSP

PSP

sostanze tossichesconosciute

Saggi biotossicologicianno 1998 10

35

35

46tossine botuliniche

DSP

PSP


Saggi biotossicologici

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Saggi biotossicologici - anno 2000

29

12

32 DSP

PSP


Saggi biotossicologicianno 1999 10

40

39

9

15

tossine botuliniche

DSP

PSP

listeriamonocytogenes


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Saggi biotossicologici anno 2001

4513

13 2

tossine botuliniche

DSP

PSP


Saggi biotossicologicianno 2002

191

7tossine botuliniche

DSP


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