V Congresso Nazionale “Le Micotossine nella Filiera Agro-Alimentare” 28-29-30 Settembre 2015

Istituto Superiore di Sanità - Roma

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Michele Solfrizzo**, Rita Bibi*, Martina Ciriaci*, Lucia Gambacorta **, Angela Paoloni*, Ivan Pecorelli**Istituto Zooprofilattico Sperimentale Dell’Umbria e delle Marche, Area Sicurezza Alimentare, Via Salvemini 1 - 06126 Perugia

** CNR, Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari, Via Amendola 122/o - 70126 Bari

Progetto di Ricerca Corrente realizzato con i fondi del Ministero della Salute, RC 13/2011 IZSUM

Tempo

(min)

Flusso

(µL/min)

Fase Mobile A %

(H2O 0.1% HCOOH 0.1 mM

AcONH4)

Fase Mobile B %

(MeOH 0.1% HCOOH 0.1 mM

AcONH4)

0 500 85 15

1,2 500 85 15

2 500 35 65

7 500 35 65

7,1 500 85 15

12 500 85 15

Molecola/transizione R.T.

(min)

Q1

(amu)

Q3

(amu)DP EP CE CXP

DON 1 2.1 297 249 43 4.3 15 3.7

DON 2 2.1 297 203 43 4.3 18 2.4

AFL G2 1 4.2 331 313 72 6.5 27 4.3

AFL G2 2 4.2 331 245 72 6.5 40 4.3

AFL G1 1 4.2 329 243 64 6.0 35 3.1

AFL G1 2 4.2 329 215 64 6.0 40 3.7

AFL B2 1 4.3 315 259 70 5.0 37 3.4

AFL B2 2 4.3 315 287 70 5.0 34 4.2

AFL B1 1 4.4 313 241 72 3.8 48 2.5

AFL B1 2 4.4 313 213 72 3.8 56 2.6

HT2 1 4.9 442 263 33 4.0 17 2.2

HT2 2 4.9 442 215 33 4.0 23 2.2

FUMB11 5.0 723 334 87 11.0 56 3.5

FUMB12 5.0 723 352 87 11.0 48 3.9

T2 1 5.3 484 215 37 3.9 26 2.3

T2 2 5.3 484 305 37 3.9 23 4.7

FUMB3 1 5.7 707 337 92 7.2 45 2.4

FUMB3 2 5.7 707 355 92 7.2 45 2.4

ZON 1 6.0 319 283 40 5.1 18 4.6

ZON 2 6.0 319 187 40 5.1 26. 2.4

OTA 1 6.1 404 239 43 5.1 30 3.9

OTA 2 6.1 404 221 43 5.1 48 2.9

FUMB2 1 6.9 707 337 92 7.2 45 2.4

FUMB2 2 6.9 707 319 92 7.2 52 2.4

Tabella 4: Parametri strumentali di acquisizione degli analiti.

DETERMINAZIONE MULTI-MICOTOSSINA IN CEREALI E MANGIMIMESSA A PUNTO E VALIDAZIONE DI UNA METODICA IN LC-MS/MS:

ATTIVITÀ SVOLTE NELL’AMBITO DELLA RICERCA CORRENTE FINANZIATA

DAL MINISTERO DELLA SALUTE

Tabella 3: Condizioni Cromatografiche Colonna Thermo Hypersil GOLD 5 µ; 100x2.1 mm.

Performance del metodo (Recupero % e Ripetibilità)

MANGIMI

DO

N

AF

LG

2

AF

LG

1

AF

LB

2

AF

LB

1

FU

M B

1

HT

2

FU

M B

3

FU

M B

2

T2

OT

A

ZO

N

Ca

lib

razi

on

e

Est

ern

a

Recu

pero

%

72 87 82 80 68 88 102 87 85 78 86 66

DS 7 10 6 10 1 5 8 7 8 8 10 12

RSDr

%9 11 7 13 1 6 8 8 9 11 11 18

Ca

lib

razi

on

e

inte

rna

Recu

pero

%

80 95 78 79 72 94 102 100 94 76 86 55

DS 11 13 10 17 6 5 2 12 3 1 4 22

RSDr

%14 14 13 21 8 5 2 12 4 1 5 39

Performance del metodo (Recupero % e Ripetibilità)

MAIS

DO

N

AF

LG

2

AF

LG

1

AF

LB

2

AF

LB

1

FU

M B

1

HT

-2

FU

M B

3

FU

M B

2

T-2

OT

A

ZO

N

Ca

lib

razi

on

e

Est

ern

a

Recupe

ro %81 87 73 87 75 71 82 73 69 50 103 61

DS 11 5 24 6 10 24 25 24 27 28 56 16

RSDr% 14 6 32 7 14 34 31 33 40 55 54 27

Ca

lib

razi

on

e

inte

rna

Recupe

ro %87 85 88 78 75 73 99 89 78 70 82 61

DS 13 9 13 2 8 22 14 20 22 7 22 17

RSDr% 15 10 15 3 11 30 14 22 28 10 26 28

Le micotossine sono metaboliti secondari prodotti da funghi microscopici che infestano un gran numero di alimenti destinati al consumo

umano e zootecnico. A causa dei loro molteplici ed importanti effetti tossici la loro presenza costituisce un serio pericolo per la salute degli

uomini e degli animali.

Al fine di tutelare la salute pubblica, l’Unione Europea, ha stabilito una serie di tenori massimi di tali sostanze ammessi negli alimenti e nei

mangimi. La letteratura scientifica riporta non solo casi di contaminazione multipla da micotossine negli alimenti e mangimi, ma anche,

effetti sinergici dovuti all’assunzione di più micotossine contemporaneamente.

E’ quindi necessario mettere a punto metodiche analitiche che consentano la rilevazione simultanea di tutte le molecole per le quali il

Legislatore Comunitario ha fissato dei limiti massimi in alimenti e mangimi, che al contempo, forniscano dati sulla loro simultanea presenza

al fine della valutazione del rischio complessivo. A tale scopo è stata messa a punto e validata una metodica analitica multiresiduo e

multiclasse che consente, per mezzo della spettrometria di massa tandem accoppiata all’HPLC, la contemporanea rilevazione di aflatossine

B1, G1, G2, B2, Ocratossina A, Zearalenone, Deossinivalenolo, Tossina T-2, HT-2, Fumonisine B1, B2 e B3 in cereali ed alimenti ad uso

zootecnico con purificazione mediante colonnine di immunoaffinità multianticorpo in tandem di tipo AOF (AFL/OTA/ZON) e DZT

(DON/ZON/T2HT2).

La separazione e rivelazione è stata ottenuta mediante un'unica corsa cromatografica con interfaccia di tipo ESI+. Il metodo è stato validato

su alimenti a base di cereali ed alimenti ad uso zootecnico verificando le performance in termini di linearità strumentale, effetto matrice,

limite di quantificazione (LOQ), recupero, precisione in condizioni di ripetibilità. La metodica consente di rilevare tutte le molecole oggetto

dello studio a livelli compatibili con i limiti di legge ed ha delle performance in linea con quanto previsto dalla normativa vigente.

La metodica prevede l’estrazione degli analiti dalla matrice mediante

miscela binaria MeOH/H2O. La miscela di estrazione viene tamponata

con PBS e purificata mediante colonnine IAC in tandem. Dopo

lavaggio, le colonnine IAC, vengono eluite con MeOH e H2O e gli

estratti purificati e concentrati vengono iniettati in LC-MS/MS

monitorando due transizioni per ciascuna molecola. Gli analiti

vengono quantificati mediante retta di calibrazione esterna in solvente

per la matrice zootecnica e mediante calibrazione interna ed esterna in

solvente (a seconda della molecola utilizzando gli analoghi marcati13C) per quanto concerne gli alimenti destinati all’uomo.

La metodica proposta, che ha come suo punto di forza la semplicità da un punto di vista

operativo, permette con un unico processo di estrazione/purificazione la contemporanea

rivelazione e quantificazione di tutte le micotossine attualmente normate dalla UE (+

Fumonisina B3) negli alimenti e nei mangimi tenendo conto rispettivamente, degli specifici

tenori massimi e dei tenori di riferimento previsti dalla legislazione. I risultati ottenuti dalla

validazione sono conformi alle prescrizioni della normativa europea di settore e, di

conseguenza, il metodo può essere utilizzato per il controllo ufficiale di micotossine in

alimenti e mangimi. Gli ottimi risultati dello studio di validazione del metodo analitico e i

valori di z-score ottenuti dalla partecipazione ai PT, confermano la robustezza del metodo

messo a punto in questo studio.

TEST VERITAS MA 1550 A-1 (Mais)

AFL B1 AFL B2 AFL G1 AFL G2 FUM B1 FUM B2 FUM B1+ B2

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Metodo Mult-

imicotossina (LC-

MS/MS) 14,00

18,10 0,96

1,25

1,71 1,62

5,06

8,80 3,36Non

assegnato

0,89 --

4326

4696 0,34Non

assegnato

506 --

5202

5202 0,00

Metodo utilizzato nel

laboratorio

14,05 0,00* 1,32 0,20* 6,60 1,40* 1,02 -- N.A. -- N.A. -- 3640 -1,20

HPLC-FL HPLC-FL HPLC-FL HPLC-FL ELISA

TEST VERITAS MA 1550 A-2 (Mais)

AFL B1 AFL B2 AFL G1 AFL G2 FUM B1 FUM B2 FUM B1+ B2

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Metodo Multi-

micotossina (LC-

MS/MS) 5,99

7,30 1,00

0,51

0,64 0,76Non

assegnato

3,20 --Non

assegnato

ND --

1755

1893 0,31Non

assegnato

192 --

2085

2085 0,00

Metodo utilizzato nel

laboratorio

6,26 0,20* 0,57 0,50* 3,74 -- 0,47 -- N.A. -- N.A. -- 1093 -1,90

HPLC-FL HPLC-FL HPLC-FL HPLC-FL ELISA

TEST VERITAS F1553 A-1 (Mangime)

AFL B1 OTA

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Metodo Multi-

micotossina (LC-

MS/MS) 16,78

19,00 0,50*

< 0,50

< 20,00Soddisfacent

e*

Metodo utilizzato nel

laboratorio

21.10 0,87 < 25,00 soddisfacente

HPLC-FL HPLC-FL

TEST VERITAS 1576 A (Mais)

DON

Valore

assegnato

(mg/Kg)

Valore

rilevato

(mg/Kg)

Z-score

Metodo Multi-

micotossina (LC-

MS/MS)1,230

1,518 1,06

Metodo utilizzato nel

laboratorio

(KIT ELISA)

1,276 0,20

Per verificare le performance analitiche del metodo, il laboratorio ha

partecipato ad una serie di PT. Nelle tabelle sono riportati i risultati

ottenuti con il metodo multi-micotossina confrontati con quelli ottenuti

con i metodi standard attualmente utilizzati dal Laboratorio.

I valori di z-score contrassegnati con asterisco sono ricavati dai dati del PT

Il metodo è stato validato verificando le performance in termini di recupero % e ripetibilità su alimenti ad uso umano a

base di mais e su mangimi. Le due matrici sono state fortificate a tre diversi livelli di concentrazione di ciascuna

micotossina. I livelli di fortificazione variano tra 0,14-1609 µg/kg per gli alimenti e 0,58-4024 µg/kg per i mangimi. Il

LOQ è stato verificato valutando le performance sperimentali al livello di concentrazione opportuno. I valori globali

ottenuti per le due matrici sono riportati nelle tabelle 1 e 2. I risultati ottenuti con rette di calibrazione con e senza

standard marcati con 13C sono comparabili grazie all’efficienza della purificazione su colonnine ad immunoaffinità ed

alla buona separazione cromatografica.

Figura. 1: Total Ion Current (TIC) delle micotossine in LC-MS/MS

TEST VERITAS F1553 A-2 (Mangime)

AFL B1 OTA

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Valore

assegnato

(µg/Kg)

Valore

rilevato

(µg/Kg)

Z-score

Metodo Multi-

micotossina (LC-

MS/MS) < 0,50

< 2,00Soddisfacen

te*17,10

< 20,00Soddisfacent

e*

Metodo utilizzato nel

laboratorio

< 2,00soddisfacent

e< 25,00 soddisfacente

HPLC-

FLHPLC-FL

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PARTECIPAZIONE A PROFICIENCY TEST.

Tabella 1 Tabella 2