MICROBIOLOGIA ANALITICA

Screening Microbiologico per la ricerca di residui

di chemioterapici e antibiotici negli alimenti

Dr.ssa Monica Ceccon

SC S1 Analisi del rischio e sorveglianza in sanità pubblica

Laboratorio Controlli Ufficiali

IZS-VE Legnaro Padova

6° Congresso Nazionale F.I.Te.La.B. Verona 2 Ottobre 2015

Residui negli alimenti: un problema

di Sicurezza Alimentare

I residui di antimicrobici (chemioterapici e antibiotici) presenti negli alimenti

sono derivati dai trattamenti zootecnici per scopo terapeutico o auxinico

(favoriscono la crescita degli animali).

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Secondo le leggi vigenti viene definito residuo:

“… residuo di sostanza ad azione farmacologica, di loro prodotti di

trasformazione, nonché di altre sostanze che si trasmettono ai prodotti animali che possono essere nocivi per la saluta umana”

Monica Ceccon

I residui antimicrobici possono essere:

Antibiotici sostanze naturali prodotte da microrganismi viventi o di semi

sintesi che a basse concentrazioni possono dimostrarsi tossiche in

modo selettivo verso altri microrganismi. A questa classe

appartengono: b-lattamici penicilline e cefalosporine, aminoglicosidi,

macrolidi, tetracicline, cloramfenicolo e rifampicine

Chemioterapici sostanze prodotte per sintesi che causano gli stessi

effetti degli antibiotici e vi appartengono: sulfamidici, trimethoprim,

chinolonici, fluorochinolonici e nitrofurani

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In campo veterinario gli antimicrobici più usati sono:

β-lattamici (mastiti, artriti, malattie respiratorie)

aminoglicosidi (streptomicina infezioni aerobi gram negativi)

tetracicline (ossitetraciclina infezioni respiratorie e gastrointestinali)

macrolidi (infezioni respiratorie e gastroenteriche)

fluorochinolonici e chinolonici (infezioni gastrointestinali respiratorie e renali)

sulfamidici (infezioni respiratorie e alimentari)

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Le cause della presenza di questi residui negli alimenti sono:

Dirette il produttore non rispetta i tempi di sospensione del trattamento

farmacologico o per dosaggio improprio e uso di sostanze illecite, o non

sospensione di mangimi medicati prima dell’immissione in commercio

dell’alimento

Indirette dipendono dallo stato di salute dell’animale dal suo metabolismo e

capacità di eliminare il farmaco

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I residui di antimicrobici possono essere presenti nei diversi

alimenti:

Latte

Carni

Uova

Mangimi

Pesce

Altri alimenti

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I Rischi tossicologici che si possono manifestare nell’uomo in seguito a consumo di alimenti

contaminati con residui di antimicrobici in quantità modeste (ordine di ppb) sono:

1) DIRETTI

Tossicità organo specifica come nefrotossicità, neurotossicità ed epatotossicità

(streptomicina nefrotossicità e neurotossicità)

Effetti cancerogeni formazione e accumulo di metaboliti reattivi che modificano

il DNA cellulare

Effetti teratogenici

2) INDIRETTI

Effetti allergici vanno da forme cutanee fino allo shock anafilattico (penicilline

contenute nel latte)

Fenomeni di antibiotico resistenza trasmissione di plasmide R da germi saprofiti a

germi patogeni che può indurre a rischi gravi di patologie

Rischi per la salute

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Legislazione europea a tutela dei

consumatori La tolleranza residuale ossia la quantità massima di residuo viene definita con

L.M.R. = Limite Massimo Residuale

LMR per ogni sostanza farmacologicamente attiva negli alimenti di origine

animale è contenuto nel reg. CEE 470/2009 che abroga il reg 2377/90

Al fine di rendere più efficace il sistema di controllo dei residui il D.lgs.

158/2006 che recepisce le direttive CEE 1996/22/CE 1996/23/CE istituisce

l’annuale Piano Nazionale Residui che è considerato uno strumento di

valutazione statistica

Oltre a questo piano sussistono tutti i controlli ufficiali effettuati dagli di

vigilanza territoriale e nazionale, sono sistemi che hanno il compito di

controllo contro gli illeciti

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ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE. svolge un ruolo attivo e fondamentale nel

campo della sicurezza alimentare analizzando tutti i campioni sia ufficiali che

provenienti dal PNR

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Valutazione del prodotto alimentare

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l’analisi di ricerca dei residui è un’indagine complessa ossia

necessita di valutazione qualitativa e quantitativa

Per ridurre i tempi di risposta quindi aumentare la qualità

verso l’utenza esterna e ridurre i costi di analisi

Si utilizza una metodica di

SCREENING MICROBIOLOGICO

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Microbiologia Analitica

La microbiologia analitica è l’utilizzo di ceppi batterici per la determinazione

qualitativa di sostanze chimiche ed è un’unione tra analisi microbiologica e

chimica

Perché usare i batteri?

Al momento risulta il metodo più economico e a più largo spettro per rilevare la

presenza di sostanze antimicrobiche in un campione di alimento

Test a “singolo tubo”

specie batterica

+

indicatore di crescita

+

1 solo campione

(es.Premi Test, Delvo Test)

Test multiplo in piastra

Più specie batteriche in più piastre

+

3 – 4 campioni per piastra

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Lo scopo dello screening è di selezionare campioni dei

campioni che con molta probabilità contengono uno o più

residui (multiresiduale) che vengono successivamente

confermati chimicamente in modo più preciso

Le caratteristiche che deve rispettare sono:

1) di semplice realizzazione

2) economico

3) veloce

SCREENING MICROBIOLOGICO

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Principio della metodica di screening

microbiologico Lo screening microbiologico si basa sull’inibizione della crescita batterica, in

piastre Petri con terreno argarizzato insemenzato con ceppi batterici

specifici, causata dalla presenza nel campione alimento di eventuali residui

di antimicrobici definiti come sostanze inibenti

L’inibizione della crescita provoca la formazione di un alone definito come

alone di inibizione

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Fattori che influiscono sulla metodica

Influiscono sulla sensibilità verso la rilevazione di un residuo alcune

variabili sulla composizione e le proprietà dell’agar quali:

1. inoculo: la con. deve essere standardizzata 104-106 UFC/mL

2. ceppo batterico utilizzato: organismi test presentono sensibilità diverse

verso gli antimicrobici

3. pH del terreno: influisce sul potere inibente del residuo

4. azione enzimatica e chimica: aumento/diminuzione del diametro

dell’alone di inibizione

5. Dimensione standardizzata del campione test: omogeneità delle di

pezzi di campione 1 cm su ogni piastra test

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SVILUPPO DELLO SCREENING

MICROBIOLOGICO CEPPI BATTERICI

B. subtilis BGA: sensibilità generale ai sulfamidici, chinolonici, macrolidi e

β-lattamici

B. cereus 11778: sensibile a tetracicline

B. cereus K 250: resistente a tetracicline

Sarina lutea ATCC 9341: sensibile ai β-lattamici e meno sensibile ai

macrolidi resistente ai chinolonici

B. stearothermophilus: sensibile β-lattamici e macrolidi

E. coli ATCC 11303: sensibile ai chinolonici 6° C ongresso

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AZIONE ENZIMATICA E CHIMICA

L’impiego di determinati enzimi va a confermare la classe antibiotica

rompendo la molecola inibente, mentre alcune sostanze possono enfatizzare

la reazione inibente all’antibiotico.

In particolare si usano:

Penicillinasi (PENASI): scinde l’anello β-lattamico penicilline

Cefalosporinasi (CEFASI): scinde l’anello β-lattamico cefalosporine

Trimetoprim (TMP): azione sinergica con i sulfamidici

Acido p-amminobenzoico (PABA): neutralizzazione l’azione inibenti dei

sulfamidici effetto competitivo

Tilosina: effetto sinergico con i macrolidi 6° C ongresso

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TERRENI AGARIZZATI E VARIAZIONI DI pH

Terreno Sostanze Inibenti TSI pH 7.2: per i ceppi K 250 e1178 Sarcina L., BGA

T. SULFA/+PABA: ceppo BGA specifico per la ricerca dei sulfamidici

T. β-Lattamici/+PENASI/CEFASI: ceppo B. Stearothermophilus specifico

ricerca β-Lattamici

Standard II pH 8: ceppo di E.coli ATCC 11303

Antibiotic medium 1 pH 6.5: Sarcina L. + 2% K2HPO4 + 1%

penicillinasi + 0,75% tilosina 1mg/ml

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VARIE MATRICI ALIMENTARI E SUOI TRATTAMENTI

A seconda della natura della matrice alimentare sono sottoposti a

trattamenti fisici e chimici preliminari:

carne e derivati: cubetti da 1 cm il più possibile formato omogeneo in tutte le piastre test

mangimi: estrazione chimica con tre differenti soluzioni a pH differenti

uova: estrazione chimica con solvente e trattamento termico disattivazione

del lisozima

latte crudo e pastorizzato: si applica il D.M. 26.03.92 prevede DELVO TEST

Latte UHT e liquidi: nessun trattamento

POST DEPOSITO CAMPIONE INCUBAZIONE IIN

TERMOSTATO ALLE SPECIFICHE TEMP. PER 24 H DELLE PIASTRE TEST

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Fasi operative di esecuzione dello

screening

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Interpretazione dei risultati

Il campione viene considerato positivo allo screening per presenza

antimicrobici quando presenta un alone di inibizione superiore a 2 mm.

Per alone di inibizione si intende lo spazio che intercorre tra la fine del

campione e l’inizio della crescita batterica.

Confrontando le misure degli aloni di inibizione con la correlazione tra

sensibilità e resistenza dei vari ceppi batterici con la presenza/assenza di aloni

nelle piastre contenenti PABA, cefasi e penasi, si può risalire in modo indicativo

alle famiglie di antimicrobici presenti nel campione di alimento

Per alone di inibizione si intende lo spazio che intercorre tra la fine del

campione e l’inizio della crescita batterica.

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SCHEMA INTERPRETATIVO 22

Tetracicline ß lattamici

Macrolidi

Sulfamidici

Chinolonici

B. subtilis BGA S

B. cereus K250 R S

B. cereus 11778 S R

M. luteus S S

M. luteus + PENASI 1% + TILOSINA 0,75 % +K2HPO4 2%

R S

E. coli

S

B. subtilis + Trimetoprim S

B. subtilis + Trimetoprim + PABA (ac. paramminobenzoico)

R

B. stearothermophilus S S

B. stearotherm. + PENASI (penicillinasi)

R (penicilline) S

B. stearotherm. + CEFASI

(cefalosporinasi)

R (cefalosporine) S

S: sensibile

presenza alone

di inibi.

R: resistente no

alone inib.

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Esempio di lettura per presenza di

Residui di Tetracicline

Presenza di Alone di inibizione nella piastra di B. cereus 11778 e assenza in

quella di B. cereus K 250

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Cosa succede al campione?

Se dalla lettura si ottiene un

alone di inibizione > 2 mm

l’alimento è quindi contaminato

da a DA ANTIMICROBICI

Si procede con la

determinazione quantitativa

in HPLC per verificare se

vengono rispettati i valori di

L.M.R. specifici

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RIEPILOGO CAMPIONI ALIMENTI PER MATRICE 2005-06

MATERIALE TOTALE N P

Confermati

> LMR

Non conformi

(ALTRO) 2 1 1

ACQUA DI VARIA

PROVENIENZA 9 8 1

ALIMENTI 1^INFANZIA,

DIETETICI 1 1

CARNE 181 167 14 5

FEGATO 43 42 1 1

RENE 103 74 29 2

PRODOTTI A BASE DI CARNE

E REPARAZIONE

GASTRONOMICHE

7 7

FORMAGGIO 21 21

INSACCATI 3 3

LATTE CRUDO AZIENDALE 2 2

LATTE UHT E DERIVATI 5 5

MANGIMI 28 20 8

MATERIALE APISTICO 1 1

PRODOTTO ITTICO E

PREPARAZIONI A BASE DI

PESCE

17 15 2

UOVA DA CONSUMO 61 37 24

PRODOTTO D’UOVO 1 1

Totale complessivo 488 402 83

(17%)

8

(1,6%)

RIEPILOGO CAMPIONI ALIMENTI PER MATRICE dal 01/01/2014 al 30/09/2015

MATERIALE TOTALE N P

Confermati

> LMR

Non conformi

CARNE 3218 3202 13 3

FEGATO 13 13

RENE 3 3

FORMAGGIO E PRODOTTI A

BASE DI LATTE 17 17

INSACCATI 1 1

LATTE CRUDO AZIENDALE 221 208 13

LATTE ACIDIFICATO 1 1

MANGIMI 43 41 2

PRODOTTO ITTICO E

PREPARAZIONI A BASE DI

PESCE

2 2

UOVA DA CONSUMO 30 20 10

Totale complessivo 3549 3508 38

(1,1%)

3

(0,08%)

Confronto tra i

risultati 2005/06 e

2014/15

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ANALISI DEI TEMPI E COSTI PER PRODURRE IL RISULTANTO

con o senza applicazione dello screening 2005-2006

per 83 campioni positivi

COSTO (€)

ANALISI SENZA

SCREENING

COSTO ( €)

ANALISI CON

SCREENING

ANALISI

SCREENING

MICROBIO-

LOGICO

/ 3.000

ANALISI

CHIMICA 41.500 10.600

% di risparmio

con screening

TOTALE COSTI

(circa) 41.500 € 13.560 € 33 %

COSTO X

CAMPIONE (1

indicazione

presuntiva)

500 € 155 € 31 %

TEMPI DI RISPOSTA

I tempi di risposta con l’applicazione dello

screening sperimentale si riducono

globalmente del 50 %

TEMPI DI RISPOSTA SENZA

L’APPLICAZIONE DELLO

SCREENNING

TEMPI DI RISPOSTA CON

L’APPLICAZIONE DELLO

SCREENNING

25-30 giorni 15 giorni

TOTALE

83 campioni

di alimenti

analizzati

Analisi con screening

3.000 € an. batt. +

10.600 € an. chimica

41.500 € costo tot. senza

screening

13.500 € costo tot. con

screening

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CONCLUSIONI

Lo screening microbiologico risulta essere di semplice

realizzazione, economico e veloce, ed inoltre molto sensibile ai

fini dei test di conferma chimica

Riduce i tempi di risposta e i costi di analisi

Pertanto viene utilizzato come supporto nell’analisi di routine nei

campioni di alimenti nei quali è richiesta la ricerca di residui di

antibiotici e chemioterapici 6° C ongresso F.I.Te.La.B - Verona 02/10/2015 Monica Ceccon 27