Sintesi di nuovi liquidi ionici e Sintesi di nuovi liquidi ionici e studio degli effetti su alcune studio degli effetti su alcune attività enzimatiche di cellule attività enzimatiche di cellule

in colturain coltura

Presentato da:

Danilo Malferrari

Relatore:

Dott.ssa Paola Galletti

Correlatore:

Prof. Giorgio Sartor

Anno Accademico 2006/2007

•Direttiva VOC 1999/13/EC - Regolamento REACH

Anastas, P.; Warner, C.; Green Chem.; 1998Anastas, P.; Warner, C.; Green Chem.; 1998

I solventi nell’industria chimicaI solventi nell’industria chimica

Necessità dell’abbandono o diminuzione nell’uso di solventiNecessità dell’abbandono o diminuzione nell’uso di solventi

Refinery

bulk chemicals

fine chemicals

pharmaceuticals

Production tons / yearProduction tons / year

101077

101055

101033

101022

Roger A. Sheldon, 2007Roger A. Sheldon, 2007

E-FactorE-Factor0.10.155

5050100100

Prevenzione

Solventi e prodotti ausiliari più sicuri

Reazioni chimiche meno pericolose

È meglio prevenire l’inquinamento piuttosto che intervenire per ridurlo dopo che lo si è prodotto

Quando possibile, la sintesi dei prodotti chimici deve essere progettata in modo da utilizzare e generare sostanze non

tossiche o poco tossiche per l’uomo e per l’ambiente

L’uso di sostanze ausiliarie (solventi, agenti di separazione) dovrebbe diventare non necessario o almeno innocuo

Principi della green chemistry

I liquidi ionici – Solventi alternativiI liquidi ionici – Solventi alternativi

• Non infiammabili, non esplosivi

• Non volatili

• Alta miscibilità con i gas: CO2, H2

• Riciclabili, reazioni selettive

N+

R

N+

NR CH3

N+

CH3

CH3

CH3

CH3

P+

CH3CH3

CH3

CH3

Cationi comuni

N-alchil-piridinio 1-alchil-3-metil-imidazolio tetra-alchil-ammonio tetra-alchil-fosfonio

Anioni comuni

immiscibili in acqua miscibili in acqua

PF6- BF4

- Cl-

NO3-N(SO2CF3)2

-

CF3SO3- CF3SO2

-

CH3CO2-

Paul Walden - 1913

Etilammonio nitrato

N+

CH3

HHHNO3

-

• [MOEMIM][BF4] meno tossico rispetto al [BMIM][BF4] di 2 ordini di grandezza

• La presenza di ossigeni nella catena laterale ne diminuisce l’idrofobicità

• L’inserzione di funzioni ossigenate nelle catene laterali diminuisce la tossicità del liquido ionico?

Samorì C., Pasteris A., Galletti P., Tagliavini E., Environ. Toxicol. Chem., 2007

Scopo tesiScopo tesi

N+

NCH3

CH3

B-

F

F F

F

[BMIM][BF4]

N+

NCH3

O

CH3

B-

F

F F

F

[MOEMIM][BF4]

N+

N

CH3

CH3

N+

N

O

CH3

CH3N

+N

CH3

O

CH3

N+

NCH3

O

CH3

2 3

[BMIM][BF4] [MOEMIM][BF4] [MOE2MIM][BF4] [MOE3MIM][BF4]

ANALISI STRUTTURA ANALISI STRUTTURA CHIMICACHIMICA

SAR / QSARSAR / QSAR

SINTESI SINTESI

STRUTTURA CHIMICASTRUTTURA CHIMICA

APPLICAZIONE SALUTE UMANA AMBIENTE

ASPETTI ECONOMICI

VALENZA SOCIALE IMPATTO ECOLOGICO

DATI TOSSICOLOGICI -

ECOTOSSICOLOGICI

VALUTAZIONE

La sintesiLa sintesi

N NCH3

+R1

X

N

CH3

+R1

X

N

+R1

X

N N+CH3 R1

+ M+ Y-

N+

CH3R1

+ M+ Y-

+ M+ Y-

N+

R1

-M+

-M+

-M+

X-

X-

X-

X-

X-

X-

N N+

CH3 R1

N+

CH3R1

N+

R1

Y-

Y-

Y-

I Liquidi ionici I Liquidi ionici sintetizzatisintetizzati

N+

CH3

CH3

N+

CH3

O

CH3

N+

CH3

O

CH3

OTs-

Cl-

Cl- , Br-

n

2

N+

CH3

N+

OCH3

N+

OCH3

OTs-

Cl-

Br-Cl- ,

n

2

N+

NCH3

CH3

N+

NCH3

O

CH3

N+

NCH3

O

CH3

n

n= 2,3

B-

F

F F

F

B-

F

F F

F

B-

F

F F

F

N(CN)2

N(CN)2

n

N(CN)2

Test biologiciTest biologici

Qualità dell’analisi QSAR

Livello di organizzazione biologico

Membrane modelloMembrane modello

N

N

N

N+

N

S

CH3

CH3Br

-

MTT-testMTT-test

Lattato deidrogenasiLattato deidrogenasi

Inibizione acetilcolinesterasiInibizione acetilcolinesterasi

Saggio di vitalità cellulare MTT-testSaggio di vitalità cellulare MTT-test

PC12Vitalità cellulare (16h)

[BMIM][BF4] (mM)

0 10 20 30

AB

S (

% c

on

tro

llo)

0

20

40

60

80

100

120

NN

N NH

N

S

CH3

CH3

N

N

N

N+

N

S

CH3

CH3

N+

NCH3

CH3

B-

F

F F

F

BMIM BF4

EC50 [mM]

Errore standard

MTT-test (16 h)

1,20 0,05

I dati sono il risultato di 3 esperimenti distinti in cui ogni concentrazione è stata replicata 4 volte.

Saggio di vitalità cellulare MTT-testSaggio di vitalità cellulare MTT-test

Vitalità cellulare (16 h)

Ctr

l

[BM

IM][

BF4

]

[BM

IM][

NC

N2]

[MO

EM

IM][

NC

N2]

[MO

E2M

IM][

NC

N2]

[MO

E3M

IM][

NC

N2]

Ab

s (

% c

trl)

0

20

40

60

80

100

120

NN

N NH

N

S

CH3

CH3

N

N

N

N+

N

S

CH3

CH3

In entrambe le serie si identificano delle differenze significative tra [BMIM][BF4]

e liquidi ionici con 1 e 2 funzionalità etossi.

Vitalità cellulare(16 h)

Ctr

l

[BM

IM][

BF4

]

[MO

EM

IM][

BF4

]

[MO

E2M

IM][

BF4

]

[MO

E3M

IM][

BF4

]

AB

S (

% C

trl )

0

20

40

60

80

100

120

PC12Attività AChE (16h)

[BMIM][BF4] (mM)

0 2 4 6 8 10 12

Attiv

ità

(n

mo

l/m

g*m

in)

2

3

4

5

6

7

8

9

Inibizione dell’acetilcolinesterasiInibizione dell’acetilcolinesterasi

EC50 [mM]

Errore standard

Acetilcolinesterasi

(16 h)4,80 0,32

N+

NCH3

CH3

B-

F

F F

F

BMIM BF4

I dati sono il risultato di 3 esperimenti distinti in cui ogni concentrazione è stata replicata 4 volte.

Inibizione dell’acetilcolinesterasiInibizione dell’acetilcolinesterasi

Si osserva un andamento differente nell’attività dell’enzima per le due famiglie di anioni.

Non vi sono differenze significative tra i liquidi ionici con catene etossilate e polietossilate.

Attività AChE (16 h)

[BM

IM][

BF4

]

[MO

EM

IM][

BF4

]

[MO

E2

MIM

][B

F4

]

[MO

E3

MIM

][B

F4

]

Att

ivit

à (

% c

trl)

0

20

40

60

80

100

Attività AChE (16 h)

[BM

IM][

BF4]

[BM

IM][

N(C

N)2

]

[MO

EM

IM[N

(CN

)2]

[MO

E2

MIM

][N

(CN

)2]

[MO

E3

MIM

][N

(CN

)2]

Att

ivit

à (

% c

trl)

0

20

40

60

80

100

Stabilità membrane cellulari –Stabilità membrane cellulari –

lattato deidrogenasilattato deidrogenasi

PC12Stabilità membrane cellulari (16h)

[BMIM][BF4] (mM)

0 2 4 6

% L

DH

rila

scia

to

0

10

20

30

40

50

60

EC50 [mM]

Errore standard

LattatoDeidrogenasi

(16 h)1,66 0,22

N+

NCH3

CH3

B-

F

F F

F

BMIM BF4

I dati sono il risultato di 3 esperimenti distinti in cui ogni concentrazione è stata replicata 4 volte.

Stabilità membrane cellulari –Stabilità membrane cellulari –

lattato deidrogenasilattato deidrogenasi

PC12Stabilità membrane cellulari (16 h)

Ctr

l

[BM

IM][

BF4]

[BM

IM][

N(C

N)2

]

[MO

EM

IM][

N(C

N)2

]

[MO

E2M

IM][

N(C

N)2

]

[MO

E3M

IM][

N(C

N)2

]

% L

DH

rilascia

to

0

2

4

6

8

Diminuzione dell’LDH rilasciato per liquidi ionici contenenti fino a due atomi di ossigeno nella catena laterale.

Si osservano differenze significative tra [BMIM][BF4] e [BMIM][N(CN)2].

PC12Stabilità membrane cellulari (16h)

Ctr

l

[BM

IM][

BF4

]

[MO

EM

IM][

BF4

]

[MO

E2

MIM

][B

F4]

[MO

E3

MIM

][B

F4]

% L

DH

rilascia

to

0

2

4

6

8

Tendenza generaleTendenza generale

N+

NCH3

CH3

N+

NCH3

O

CH3 N+

NCH3

O

CH3

3

A-

A-

A-

N+

NCH3

O

CH3

2

A-

Nel test di inibizione dell’acetilcolinesterasi si osservano delle differenze tra anioni ed un allontanamento dalla tendenza generale

Non si osservano differenze significative nei liquidi ionici dipendentemente dall’allungamento della catena

Anisotropia di fluorescenza tramite DPHAnisotropia di fluorescenza tramite DPH

NNH

NNH

NNH

Qual è l’effetto dei liquidi ionici sull’anisotropia di fluorescenza?

Si possono identificare delle variazioni nella fluidità di membrana nella serie di liquidi ionici con catene polietossilate?

DPH

1,6-DIFENILESATRIENE

Anisotropia di fluorescenza di DPH in presenza di Anisotropia di fluorescenza di DPH in presenza di [BMIM][BF[BMIM][BF44]]

Temperature [° C]

16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

DP

H F

luor

esce

nce

anis

otro

py

-0.02

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

none4mM 50mM 500mM 2000mM

Temperature [°C]

16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

DP

H F

luor

esce

nce

anis

otro

py

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

none4 mM 50 mM 500 mM 2000 mM

N+

NCH3

CH3

B-

F

F F

F

BMIM BF4

Anisotropia di fluorescenza con [MOEAnisotropia di fluorescenza con [MOE22MIM][N(CN)MIM][N(CN)22]]

Temperature [° C]

16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

DP

H F

luor

esce

nce

anis

otro

py

-0.02

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

none4mM 50mM 500mM 2000mM

N+

NCH3

O

O CH3

MOE2MIM N(CN)2

N(CN)2

Variazione dell’andamento dell’anisotropia per molarità superiori a 500 mM

Fluorescenza - Proprietà spettrali del [BMIM][BFFluorescenza - Proprietà spettrali del [BMIM][BF44]]

4

6

8

10

12

14

16

260265

270275

280285

290295

300380

400420

440460

480500

Fluore

scence

inte

nsi

ty (

a.

u.)

Excitation Wavelength (nm)

Emission Wavelength (nm)

[BMIM][BF4] 0.10 M in H2O

100

200

300

400

260265

270275

280285

290295

300360

380400

420440

460480

500

Fluore

scence

inte

nsi

ty (

a.

u.)

Excitation Wavelength (nm)

Emission Wavelength (nm)

[BMIM][BF4] 0.10 M in CH3CN

Massimi di emissione a 415 e 427 nm con eccitazione a 260 nm

•Si osserva un andamento generale per il test di vitalità MTT-test e il test di integrità di membrana

•Vi è una diminuzione della tossicità introducendo delle funzioni etossi nella struttura, ma la tendenza si inverte in presenza di tre atomi di ossigeno

•Non si evidenziano differenze sistematiche tra i tipi di anioni impiegati

ConclusioniConclusioni

•La purezza dei liquidi ionici è fondamentale per un utilizzo nei test biologici

•Sono necessari passaggi sintetici che migliorino la sostenibilità del processo, diminuendo l’uso di solventi nelle fasi di purificazione

•I liquidi ionici a catena alchilica variano la fluidità di membrana anche a basse molarità, con formazione di strutture miste