UNIVERSITÁ DEGLI STUDI DI ROMA

“SAPIENZA”

Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

Corso di Laurea Triennale in Chimica Industriale

“PREPARAZIONE DI NANOGEL DI CHITOSANO

GALATTOSILATO PER RETICOLAZIONE IN MICELLE DI

COMPLESSI POLIIONICI”

TUTOR LAUREANDO

Prof. Giancarlo Masci Jacopo Cautela

Matr.1169538

Scopo della ricerca Preparazione e caratterizzazione di nanogel di chitosano galattosilato (ChitGal)

di dimensioni inferiori a 100 nm a partire da micelle di complessi poliionici

(PIC).

• Degradazione del chitosano nativo (Mn=1,5x10^5 Da, DD=87%, pKa 6,5)

• Funzionalizzazione del chitosano degradato (Galattosilazione).

• Preparazione dei PIC mediante interazione tra il ChitGal e un copolimero a

blocchi ionico, carico negativamente (PEO-b-PAMPS)

• Reticolazione dei PIC con genipina

• Liberazione dei nanogel mediante l’aumento della forza ionica.

Genipina

Residui di

ChitGal

NanogelI nanogel sono reticoli tridimensionali idrofilici di dimensioni nanometriche in

grado di immagazzinare acqua, mantenendo inalterata la loro struttura.

Biocompatibilità

Biodegradazione

DIMENSIONI RIDOTTE (INFERIORI A

100 nm)

NOTEVOLE AREA SUPERFICIALE

RETICOLO INTERNO

per incorporamento di agenti

terapeutici

Hanno molte applicazioni in campo biomedico nel

trasporto di molecole bioattive e per il rilascio

controllato e mirato in cellule bersaglio.

Indirizzamento specifico dei

nanogel verso tessuti malati

salvaguardando i tessuti

sani.

Dimensioni inferiori

a 100 nm

consentono di ridurre

l’escrezione

renale.

Riduzione della frequenza e

quantità delle somministrazioni.

Chitosano

• Solubile a pH fisiologico

•Capacità di disperdere le

nanoparticelle

•Attività biologica intrinseca

Il residuo galattosilico di molte proteine plasmatiche viene riconosciuto dai

recettori asialoglicoproteici (ASGP-R) che le cellule epatiche presentano sulla

superficie. Tale residuo favorisce l’endocitosi delle molecole ad esso legate.

Proprietà

•Agente chelante

•Emulsionante

•Addensante

Impieghi nei settori

•Biomedicale

•Farmaceutico

•Alimentare

•Cosmetico

Vantaggi

•Polielettrolita

•Potenziali siti di legame

per fattori bioattivi

•Biocompatibile

•Processo estrattivo

semplice ed economico

ChitGal

Preparazione dei nanogel tramite nanoreattori PIC.

1. La metodologia è stata quella di utilizzare delle micelle di complessi poliionici

come nanoreattori, all’interno del quale far avvenire la reazione di

reticolazione per la creazione del nanogel.

2. La reticolazione avviene tra il solo reticolante e le catene di biopolimero

mentre il copolimero a blocchi rimane intrappolato all’interno del reticolo.

3. L’allontanamento del copolimero avviene per aumento della forza ionica

della soluzione e ha come risultato finale la presenza in soluzione di particelle

di nanogel di dimensioni inferiori ai 100nm.

Poli(etilenossido)114-b-poli-(2acrilammido-

2-metilpropansolfonato)x

Micelle di complessi poliionici (PIC)

Rapporto tra le lunghezze dei segmenti carichi nel nucleo delle

micelle (se non confrontabili si possono ottenere micelle grandi

con nucleo mal definito)

Forza ionica.

il rapporto molare tra le cariche

dei polimeri (f+ = è 0,5)

pH (completa ionizzazione di tutti i polimeri carichi.

FRAZIONE DI MESCOLAMENTO

Parametri che controllano la morfologia e la

dimensione dei PIC:

Degradazione del Chitosano

-0,5

-0,3

-0,1

0,1

0,3

0,5

0,7

0,9

1,1

20 25 30 35

V el (ml)

Inte

nsi

tà n

orm

aliz

zata

(m

V)

Chitosano

Chit15 min

Chit60 min

Chit24 h

Chit44

Campione Mn

(104

Da)

Mw(104

Da)

I =Mn /

Mw

Xn

sperimentale

Chitpartenza 15.0 39.4 3.00 875

ChitDEG15minuti 10.5 28.2 2.68 701

ChitDEG30minuti 8.9 23.3 2.60 595

ChitDEG60minuti 4.2 12.9 3.25 280

ChitDEG230minuti 3.7 12.2 3.11 251

ChitDEG24h 3.3 10.9 3.08 200

Campione Mn (104

Da)

Mw(104

Da)

I =Mn /

Mw

Xn

Chitpartenza 13.1 39.4 3.00 875

ChitDEG15minuti 3.6 11.1 3.13 237

ChitDEG60minuti 1.8 4.22 2.37 119

ChitDEG24ore 0.71 2.4 3.34 48

y = -0.749x + 20.36R² = 0.999

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

8.5

15 17 19 21 23

log [n

]xM

vol rit (ml)

Xn (teorico) 40(Mn=7*103Da)

Retta di taratura (standard pullulano Sigma Aldrich, Mw=0,58xDa, 1,12 x Da, 38xDa, 85xDa)

Xn (teorico) 160

Mn=1,5x10^5Da

La degradazione viene effettuata per ottenere

catene di polisaccaride di dimensioni

confrontabili con le catene di copolimero a

blocchi.

(Mn=3*104Da)

Sintesi del Chitosano galattosilato (ChitGal)

Amminazione riduttiva del chitosano per

reazione con lattosio .

•Chitosano + lattosio + NaBH3CN in 1:1

metanolo:AcOH 1% pH 4.5

• t = 5 giorni, T = 25 C

2

b

4

5

6,6’

7

8

98a

3

15 Spettri 1H-NMR di ChitGal53 e del Chitosano in D2O e 10% di acido acetico deuterato

a 87 C in concentrazione 10 mg/ml. In alto: figura del Chitgal con relativa assegnazione dei picchi.

.

100*I(8)I(9)

I(9)DD(%) 100*

I(8a)I(9)

I(8a)DG(%)

Campione DG teor (%) DG sper (%)

ChitGal20 20 18

ChitGal40 40 20

ChitGal60 60 33

ChitGal80 80 46

ChitGal100 100 53

Percentuali di galattosilazione del chitosano

Preparazione dei PIC

CHITGAL

CHITGALCHITGAL

ChitGal

C

PE

Vn

COPOLIMERO

CHITGAL

copolimeroC

n(ml)V COPOLIMEROPE

0

20

40

60

80

100

120

4 11 24 40 58 75 87 95 98 100

Dh (nm)

Inte

ns

ità

no

rma

lizza

ta

Distribuzione del diametro idrodinamico ottenuto tramite

analisi CONTIN della micella PIC A20C40G20 in acido

acetico 0.05 M ad una concentrazione di 3 mg/ml e a T =

25˚C.

Campione Diametro idrodinamico (nm)

A20C40G20 53

A20C40G53 65

A40C40G20 51

A40C40G53 113

Campione f+ del chitosano Dh (nm)

A20C40G20 (a. acetico 0,05M) 0.5 51

A20C40G20 (a. acetico 0,05M) 0.4 67

A20C40G20 (acqua) 0.5 95

A20C40G20 (acqua) 0.4 124

acido acetico 0.05 M , concentrazioni di 3 mg/ml e f+ = 0.5.

PIC preparati in AcOH

0.05M, in concentrazione 3

mg/ml++

La minore dimensione delle nanoparticelle

in acido acetico potrebbe in primo luogo

essere dovuta al pH della soluzione. La

dissociazione del chitosano è presso che

completa, ottimizzando l’interazione tra

cariche.

Immagine TEM del PIC A20C40G20

Dissociazione dei PIC, analisi DLS e ¹H-NMR

Andamento dell’intensità

diffusa in funzione della

concentrazione totale della

soluzione

Andamento del rapporto tra

l’integrale degli idrogeni in 2

del PEO e quello dei protoni

in 5 del PAMPS

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0,2 0,4 0,6 0,8

C sale,tot (mol/l)

Inte

ns

ità

dif

fus

a (

kc

ps

) PIC A20C40G20

PIC A20C44

0

5

10

15

20

25

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

C sale, tot (mol/l)

I P

EO/I P

AM

PS

CHITGAL

rapporto teorico

CHITOSANO

O

CH2OH OH

C

O OCH3

1

3

4

6 5

7

89

10

11

0

20

40

60

80

100

120

49 56 65 75 87

Dh (nm)

Inte

ns

ità

no

rma

lizza

ta

Distribuzione del diametro idrodinamico

ottenuto tramite analisi CONTIN PIC A20C40G20

reticolata con genipina in rapporto molare 10:1

Campione reticolato Rapporto

Genipina:ChitGal

Dh(nm) prima

della reticolazione

Dh (nm) dopo la

reticolazione

A20C40G20 4:1 53 56

A20C40G20 10:1 53 52

A20C40G53 10:1 65 65

A40C40G20 10:1 51 53

A40C40G53 10:1 113 83

Analisi DLS dei reticolati

i diametri idrodinamici dei complessi poliionici

reticolati

60

80

100

0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4

C sale, tot (mol/l)

Dh

(n

m)

Campione reticolato Rapporto molare

genipina : chitosanoDh (nm)

dei nanogel

A20C40G20 4 : 1 100

A20C40G20 10 : 1 61

A20C40G53 10 : 1 78

A40C40G2010 : 1 55

A40C40G5310: 1 86

Le dimensioni dei nanogel sono superiori alle dimensioni dei PIC originari, poiché il reticolo

dell’idrogel si rigonfia come risultato della penetrazione dell’acqua tra le maglie.

Nanogel in soluzione

4:1

0

5

10

15

20

25

30

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

C sale, tot (mol/l)

I P

EO/I P

AM

PS

rapporto teorico

nanogel di chitosano

nanogel di ChitGal

Immagine TEM dei nanogel di Chit40Gal20

Conclusioni

• Sono stati preparati nanogel di ChitGal a partire da complessipoliionici.

• Misure di diffusione della luce e di microscopia elettronica hannodimostrato la formazione di particelle sferiche con bassapolidispersione e dimensioni comprese fra 45 e 90 nm.

• Da quanto visto, Xn = 40, f+ = 0.5 e DG = 20%(teor.) sono iparametri fondamentali per ottenere dei nanogel. Con lecaratteristiche richieste

Durante il tirocinio

• Ho acquisto le conoscenze necessarie per preparare dei nanogelchitosano glattosilato a partire da micelle di complessi polionici.

• Ho inoltre acquisito le principali tecniche strumentali che sono statenecessarie per la caratterizzazione dei nanogel.

O

CH2OH OH

C

O OCH3

+ NH2R

OH

CH2OH

C

O OCH3

C NHR

N

CH2OH OH

C

O OCH3

R

O

CH2OH OH

C

O OCH3

+ NH2R

N

CH2OH OH

R

O

CH2OH OH

CO- OCH3

NH2+R

CO- OCH3

NHR

O

CH2OH OH

C

O NHR

+ CH3OH

1

2

Meccanismo di reticolazione della genipina

11

PIC + genipina a t = 0

Genipina

3 7

110

9 5 6 6

PAMPS

O

CH2OH OH

C

O OCH3

1

3

4

6 5

7

89

10

11

PEO

Analisi ¹H-NMR della reazione di reticolazione dei PIC

PAMPS

0

5

10

15

20

25

30

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

I P

EO

/I P

AM

PS

C sale, tot (mol/l)

rapporto teorico

nanogel di chitosano

nanogel di ChitGal

O C CH CH2

O

CH Cly

3 4

C O

N

C CH3H3C

H

5

6CH2

SO3Na

5

2

CH2O CH2

2

H3C

1

x

CH3

Nanogel reticolato senza

NaCl

Nanogel liberato

Genipina

ChitGal

PAMPS

Analisi ¹H-NMR della liberazione dei nanogel