Micelle come nanoMicelle come nano--contenitori per sensori contenitori per sensori fluorescenti fluorescenti autoassemblatiautoassemblati..

Luca Pasotti

un contributo del Dipartimento di Chimica Generale dell’Università di Pavia, in collaborazione con l’ Institut de Chimie Moléculaire de l'Université de Bourgogne, Dijon e il Dipartimento di Chimica e Tecnologie Farmaceutiche, Università degli Studi di Palermo,

Un approccio molto efficace nella costruzione di Un approccio molto efficace nella costruzione di dipositividipositivi molecolari:molecolari:

utilizzare le micelle come strutture utilizzare le micelle come strutture autoassemblateautoassemblate per contenere molecole per contenere molecole che svolgono funzioni complesse.che svolgono funzioni complesse.

Diverse molecole Diverse molecole lipofilichelipofiliche possono possono inserirsi all’interno inserirsi all’interno della micella e della micella e interagire tra loro.interagire tra loro.

Approccio multicomponente

Sopra la CMC (critical micelle concentration)

Core Core idrofobicoidrofobico

Strato Strato idrofilicoidrofilico

= acqua= acqua

_ Sistema dinamico che permette diffusione al suo interno e scam_ Sistema dinamico che permette diffusione al suo interno e scambio con bio con l’esternol’esterno

_ Scarsa idratazione dovuta all’ambiente idrofobico_ Scarsa idratazione dovuta all’ambiente idrofobico

L’inclusione in micella influenza molto le proprietà L’inclusione in micella influenza molto le proprietà termodinamiche osservate delle molecoletermodinamiche osservate delle molecole

= SO3-=

N

logKlogK = 7.84= 7.84 logKlogK = 11.51= 11.51

N logKlogK = 10.77 in acqua= 10.77 in acqua

La micella di La micella di TritonTriton XX--100100

CMC = 2 x 10CMC = 2 x 10--44 M M

AN AN ~ 110/140~ 110/140

Aumentata concentrazione locale dovuta alla confinazione delle specie idrofobiche in un volume molto piccolovolume molto piccolo

Raggio medio 4.6 Raggio medio 4.6 nmnm

Volume medio 410 nmVolume medio 410 nm33

Tirando le somme

_lavoriamo in acquaacqua anche con molecole poco solubilipoco solubili

_il confinamento in un volume confinamento in un volume nanometriconanometrico e la scarsa idratazionescarsa idratazione all’interno della micella permettono l’approccio l’approccio multicomponentemulticomponente

Vedremo in particolare il funzionamento di due dispositivi molecolari:

Un sensore per H+ a finestra di pH

Un misuratore di lipofilicità

Sensori a finestra di pHSensori a finestra di pH

Sono dispositivi molecolari in grado di segnalare quando il pH si sposta da un’intervallo scelto.

Possono essere usati come indicatori fluorescenti che ci dicono quando, in un microambiente, il pH si sposta da un valore che sappiamo essere la situazione normale.

Sono facilmente regolabili sul range di pH richiesto.

Sensori a finestra di pHSensori a finestra di pH

fluoroforo Quencher pH dipendenti

logKlogK = 3.90= 3.90

logKlogK = 7.84= 7.84

Spostamento delle finestreSpostamento delle finestre

La costanti di La costanti di protonazioneprotonazione cambiano cambiano coco--micellizzandomicellizzando un un tensioattivo carico negativamente che stabilizza le forme tensioattivo carico negativamente che stabilizza le forme protonateprotonate..

Aumenta SDS

11.5011.5011.8811.8811.7311.7311.2011.2010.4210.429.909.909.139.138.518.517.847.84DNMeDNMe22

7.127.127.267.266.706.706.306.305.865.865.435.434.944.944.394.393.903.90DPiridDPirid..

110.90.90.80.80.70.70.50.50.30.30.20.20.10.100X SDSX SDS

SO3-

Micelle di Triton X-100 non sono biocompatibili e hanno scarsa stabilità alla diluizione.

Per questo scopo sono, invece, preferibili micelle micelle polimerichepolimeriche.

Poliaspartamide funzionalizzate: bassa CMC, alta stabilità alla diluizione, alta compatibilità biologica.

La carica negativa di SDS sposta la finestra a pH maggiori.

La carica positiva di CTABr (cetiltrimetilammonio bromuro) destabilizza le specie protonate e sposta la finestra a pH minori.

Controllo delle finestreControllo delle finestre

Misuratore di Misuratore di LipofilicitàLipofilicità

IUPAC - Lipophilicity “represents the affinity of a molecule or a moiety for a lipophilic environment”

Questa grandezza è biologicamente rilevante :

È uno dei parametri di cui tenere conto nel design di farmaci perché influenza la farmacocinetica: solubilità, assorbimento, metabolismo, distribuzione ed solubilità, assorbimento, metabolismo, distribuzione ed escrezioneescrezione sono fortemente influenzate dalla lipofilicità.

I metodi di valutazione comunemente usati sfruttano la ripartizioni delle molecole neutremolecole neutre attraverso sistemi bifasici: distribuzione liquidodistribuzione liquido--liquidoliquido(ottanolo-acqua, LogPLogP), distribuzione liquidoliquido--solidosolido (cromatografie su colonne a fase inversa)

Con questo metodo sfruttiamo la ripartizione tra le due pseudofasi micellamicella--acquaacqua, cercando di mimare l’interfaccia tra acqua e membrana cellulare a pH7.4 (lavoriamo con molecole carichemolecole cariche).

Le micelle non solo promuovono l’interazione tra sensore e substrato,

ma intervengono attivamente discriminando la molecole che possono entrare e interagire con il recettore

da quelle che non possono entrare e non provocano cambiamento nel segnale

OO

NNN

N

OO

O

O

NNNN

O

OO

O

Un sensore per spostamentoUn sensore per spostamento

Misuratore di Misuratore di lipofilicitàlipofilicitàsistema ONsistema ON--OFFOFF

[Zn(DTMCyc)(H2O)]2+ [Zn(DTMCyc)(OH)]+ FluorescenteFluorescente Scarsamente Scarsamente fluorescentefluorescente

LcZnLcZn::

NNN

NZnZn2+2+

O

O

O

OH

A pH 7.4

Molar concentration of added Zn complex

0.0 5.0e-6 1.0e-5 1.5e-5 2.0e-5 2.5e-5

If

100

200

300

400

500

600

700

wavelength, nm380 400 420 440 460 480

If0

50

100

150

200

pH 7.4 Aggiungo LcZn a una soluzione di PyCOO-

In acqua e In acqua e TritonTriton l’interazione è promossal’interazione è promossa

In acqua non c’è interazione, la In acqua non c’è interazione, la fluorescenza rimane a livello inizialefluorescenza rimane a livello iniziale

NNN

NZnZn2+2+

O

O

pH2 4 6 8 10 12

% o

f sp

ecie

s

0

20

40

60

80

100

I f%

(39

0 n

m)

50

100

150

200

250

300

PC

OO

H

[(C

12-M

e3C

ycle

n)Z

n(P

CO

O)]

+ PC

OO

-

Formazione del complesso LcZn-PyCOO-

Formazione del complesso LcZn-OH-

Scalzando Scalzando PyCOOPyCOO-- la fluorescenza si spegnela fluorescenza si spegne

fluorescenza del PyCOO- da solo

concentration of added CH3(CH2)nCOOH, molL-1

0 2e-5 4e-5 6e-5 8e-5

I f%

(39

0 n

m)

20

40

60

80

100 nn tra 0 e 3

nn tra 4 e 9

nn tra 10 e 15

condizioni: TX-100 10-2 M

Pyrene-COOH 8×10-7 M

Aggiungendo acidi carbossilici lineari [CH3(CH2)[CH3(CH2)nnCOOCOO--] ] alla soluzione di sensore si ottiene una variazione del segnale che dipende dalla lunghezza della catena

OO

O

O

NNNN

OO

NNN

N

OO

NNN

N

OO

OO

OO

OO

OO

OO

OO

OO O

O

OO

OO

OO

OO

NNN

N

O

O

NNNN

O

O

NNNN

n in CH3(3(CH2)nCOOH

0 2 4 6 8 10 12 14 16If a

t 4.

00 X

10-5

M C

H3(

CH

2)n

CO

OH

at

pH

7.4

20

40

60

80

100

esclusioneesclusione ripartizioneripartizione inclusioneinclusione

condizioni: TX-100 10-2 M

Zn(C12Me3Cy)]2+ 1.667×10-5 M

Pyrene-COOH 8×10-7 M

N

S

O

R

OO

NH2

O

NH

N NH

NH

O

NH

O

ON

N

O NH

O

O

NH

O

Ampicillin

Azlocillin

Mecillinam

Penicillin V

Nafcillin

OH

NH2

O

NH

O

NH

O

NH

ON

O

NH

ONCl

O

NH

ONCl

Cl

Amoxicillin Penicillin G

Oxacillin Cloxacillin Dicloxacillin

conc of added RCOOH

0 2e-4 4e-4 6e-4 8e-4

Flu

ore

scen

ce I

nte

nsi

ty

40

50

60

70

80

90

100

[C1-COOH][C4-COOH][C5-COOH]

[C6-COOH][C7-COOH][C8-COOH]

LogP

I f, r

elat

iva

Con lo stesso principio è possibile realizzare Con lo stesso principio è possibile realizzare anche un sistema OFFanche un sistema OFF--ONON

N O O

O

O

N NN

NCuCu2+2+

Cumarina 343Cumarina 343

Fluorescente su tutto il Fluorescente su tutto il rangerange di pHdi pH

LcCuLcCu

[Cu(DTMCyc)(H2O)]2+ [Cu(DTMCyc)(OH)]+

Abbiamo ottenuto un nuovo sistema funzionante spostato in una diversa regione spettrale (molte molecole biologiche assorbono nell’ultravioletto)

nm

pH2 4 6 8 10 12

0

20

40

60

80

100

If%

, (48

5 n

m)

0

20

40

60

80

100

% o

f sp

ecie

s

Co

um

CO

OH

[(C

12-M

e 3Cyc

len

)Cu

(Co

um

CO

O)]

+

Co

um

CO

O-

pH 7.4

Aggiungo il complesso a una soluzione 8x10-7 M di Cumarina 343

Formazione del complesso

LcCu-Cum

Formazione del complesso

LcCu-OH-

Scalzando la Scalzando la cumarina 343 la cumarina 343 la fluorescenza si fluorescenza si accendeaccende

Molar concentration of added Cu complex

0.0 5.0e-5 1.0e-4 1.5e-4 2.0e-4 2.5e-4

If, r

elat

ive

scal

e

0

20

40

60

80

100

120

wavelenght, nm

460 480 500 520 540 560 580

If

0

100

200

300

400

nn tra10 e 14

nn tra 4 e 9

nn tra 0 e 3

Ora aggiungendo gli acidi carbossilici lineari di varie lunghezze [CH3(CH2)[CH3(CH2)nnCOOCOO--] ] vedo una riaccensione

Concentration M

0 2e-4 4e-4 6e-4

I f %

100

150

200

250

300

350

OO

N

OO

OO

NNNN

N

OO

O

O

O

O

NN NN

N

OO

O

O

N

OO

O

O

OO

OO

OO

OO

N

OO

OO

NNNN

N

OO

OO

NNNN

OO

OO

OO

OO

OO

OO

O

O

NNNN

O

O

NN NN

condizioni: TX-100 10-2M

Cu(C12Me3Cy)]2+ 3.5×10-4M

Cumarina 343 8×10-7 M

esclusioneesclusione ripartizioneripartizione inclusioneinclusione

Concentration M

0 2e-4 4e-4 6e-4

I f %

100

150

200

250

300

350 [Ibuprofen] [Tolmetin] [Naproxen][Flurbiprofenen][Flufenamic acid][Diclofenac][Mefenamic Acid]

Delta If% (min = 100)

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

logP

lite

ratu

re

1

2

3

4

5

6

Antiinfiammatori non steroidei

OH

O O

OH

O

N

Cl

Cl

O

OH

O

OH

F

N

OHO

N

OHO

F3C

N

O

OHO

IbuprofenNaproxen

Diclofenac Flurbiprofen

Mefenamic acid Flufenamic acid

Tolmetin

ConcludendoConcludendo:

Abbiamo realizzato un sensore per pH facilmente controllabile, sfruttando il confinamento e il trasporto da parte delle micelle

Abbiamo realizzato un misuratore per lipofilicità sfruttando la capacità delle micelle di discriminare le molecole organiche.

Ringraziamenti:Ringraziamenti:

P.PallaviciniP.Pallavicini

Yuri Diaz FernandezYuri Diaz Fernandez

il LabFab e il NanoLab Generaleil LabFab e il NanoLab Generale

Giuseppe Chirico, Maddalena Collini, Laura D’Alfonso Giuseppe Chirico, Maddalena Collini, Laura D’Alfonso (Dipartimento di Fisica “G. Occhialini”, Università Milano Bicocca, Piazza della Scienza, 3, 20126, Milano)

Franck Denat, Franck Denat, YoanncRousselinYoanncRousselin, Nicolas , Nicolas SokSok ((Institut de ChimieMoléculaire de l'Université de Bourgogne, UMR CNRS 5260, 9 avenue AlainSavary - BP 47870 - 21078 DIJON cedex – France)