Preparazione di campioni biologici per la microscopia ottica

ed elettronica

Il microscopio ottico ed elettronico (T.E.M)

OCULARE

OBBIETTIVI

TAVOLINO PORTA CAMPIONE

CONDENSATORE

DIAFRAMMA DI CAMPO

LAMPADA

CANNONE ELETTRONICO

PORTA CAMPIONE

CONDENSATORE

OBBIETTIVO

SCHERMO FLUORESCENTE

CAMERA FOTOGRAFICA

Occhio umano

Microscopio ottico

Microscopio elettronico a trasmissione

Microscopio elettronico a scansione

Aumentando la risoluzione aumentano proporzionalmente anche gli artefatti e la loro visibilità

• la luce del microscopio ed il fascio di elettroni possono

attraversare solo materiale di spessore molto ridotto

• il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi ed utramicrotomi

• la maggioranza dei tessuti biologici sono molli

• prima del taglio, il tessuto deve essere indurito

– Fissazione

– Inclusione

– Congelamento

• i tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrasto

• prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato o contrastato

• coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica

Problematiche…

Fasi della preparazione

• Prelievo • Fissazione • Disidratazione • Inclusione • Taglio • Colorazione

Prelievo

• Il prelievo è l’operazione fisica con la quale si ottiene il campione da esaminare

• Deve essere eseguito da materiale biologico vivente

• Riduzione 10x10x3 mm per la microscopia ottica

Spessore ≤ 2 mm per la microscopia elettronica

• Deve essere eseguito il più velocemente possibile

La Fissazione

Ha lo scopo di bloccare i processi di degenerazione del tessuto prelevato rendendolo stabile nel tempo ed inalterabile all’azione dei successivi trattamenti

Mantiene inalterate le caratteristiche strutturali del campione, preservandone la morfologia

Protegge il campione da danni osmotici (swelling e shrinking)

FISICA

CHIMICA

Congelamento in N2 o -30°C

Calore (fiamma viva per materiale biologico strisciato su vetrino

Esposizione del tessuto a T molto alte o molto basse:

Uso di sostanze chimiche:

Perfusione

Immersione

Con vapori

La fissazione chimica LE ALDEIDI

FORMALDEIDE

• usata in soluzione (4-10%) in tampone pH 7.4

• elevato potere di penetrazione ( 0.8 mm/h)

• agisce formando legami crociati con gli aa delle proteine (reversibili)

• preserva una buona morfologia

PARAFORMALDEIDE

• preserva la reattività delle macromolecole

• indicata per indagini biochimiche

Formaldeide 4-10% + Saccarosio 2% in PBS pH 7.4

4 ore 4°C

Microscopia Ottica

PFA 10% + Saccarosio 2% in PBS pH 7.4

4 ore 4°C

GLUTARALDEIDE

• penetra bene nei tessuti, ma meno rapidamente della formaldeide

• forma cross-legami più velocemente e più stabilmente della formaldeide

• non fissa i lipidi, quindi per preservare le membrane

La fissazione chimica LE ALDEIDI

Microscopia Elettronica

GA 2-4% in Tampone Fosfato pH 7.4

2-4 ore 4°C

Post-fissazione con Osmio Tetrossido

• Fissa i lipidi insaturi

• agisce rapidamene, ma penetra molto poco Fissativo 2°

• reagisce in modo differente con i vari componenti cellulari accentuando le differenze di densità e fornendo una sorta di colorazione

OsO4 1-2% In Tampone Fosfato pH 7.4 2 ore 4°C buio

I Tamponi

I fissativi devono essere diluiti in tamponi a pH 7-7.4 in modo che non ci sia diversità di pH fra il tessuto e la soluzione fissativa e per evitare artefatti dovuti a differenze di osmolarità

Gli stessi tamponi utilizzati per diluire i fissativi devono essere impiegati per effettuare i lavaggi che seguono la fissazione (1-2 ore)

PBS

Tampone fosfato di Sorensen

Tampone Cacodilato

Fosfato bisodico 0.2M + Fosfato monosodico 0.2M

Cacodilato di Na 0.24M + HCl 0.2M

Più stabile nel tempo, ma contiene arsenico che è tossico

La Disidratazione E’ il passaggio che permette la sostituzione dell’acqua contenuta nel tessuto con un solvente dei mezzi di inclusione (Paraffina o resine)

La disidratazione si effettua mediane passaggi del campione in soluzioni di alcool in una scala crescente di concentrazioni

Alcool 70%

Alcool 90% Alcool 100%

Fissazione 3° con Acetato di Uranile in alcool 70% (T.E.M.)

Chiarificazione L’ultimo agente deve essere miscibile con i mezzi di inclusione

Xilolo

Acetone assoluto

Ossido di propilene

Paraffina

Resine idrofobiche per T.E.M.

Infiltrazione Dopo aver concluso la disidratazione del campione bisogna sostituire gradualmente lo xilolo o l’acetone con il mezzo di inclusione in forma liquida (Xilolo/acetone:mezzo di inclusione)

3:1 2:1 1.1 1:2 1:3

Inclusione E’ il passaggio che permette di impregnare il campione in un materiale abbastanza duro ed omogeneo tale da poter essere tagliato in fette molto sottili

PARAFFINA (M.O.)

RESINE (T.E.M.)

• Miscela di idrocarburi saturi

• solida a T ambiente

• punto di fusione a 54-60°

• insolubile in H2O, solubile in xilolo

• Epon, Araldite

• liquida a T ambiente

• polimerizza a 60-70°C

• insolubile in H2O, solubile in acetone

• si preparano a partire da soluzioni di monomeri, da sostanze plasticizzanti che migliorano la consistenza finale del polimero e da un acceleratore chimico per la reazione di polimerizzazione

Il campione viene immerso in paraffina o resina pura per completarne l’infiltrazione

T ambiente 4°C

Polimerizzazione

Paraffina (m.o.) Resina (T.E.M)

60-70°C

Blocchetti pronti per essere tagliati in sezioni

Il taglio delle sezioni

MICROTOMO

Strumento che permette di sezionare i blocchetti di paraffina contenenti il campione in fette spesse 3-10 uM

La raccolta delle sezioni

La colorazione

I coloranti sono di solito in soluzione acquosa.

Le sezioni devono essere sparaffinate in xilolo e reidratate con scala decrescente di alcool (100, 90, 80, 70, 50,H2O)

Metodica ematossilina eosina

Ematossilina 10 min

Lavaggio con H2O corrente

Eosina 1 min

Disidratazione

Montaggio

Vetrini Xilanizzati

COLORANTI PER MICROSCOPIA OTTICA

I tessuti assumono i coloranti in base alle caratteristiche delle strutture che li compongono

ACIDI carica negativa formano sali con basi colorano citoplasma BASICI carica positiva formano sali con acidi colorano i nuclei NEUTRI formati dall’unione di un colorante acido con uno basico

NATURALI animali : es. carminio (colorante acido nucleare) vegetali: es. ematossilina (colorante acido) ARTIFICIALI eosina (colorante basico citoplasmatico)

fucsina, violetto di genziana (coloranti nucleari)

Materiale vegetale incluso in gel e tagliato con

microtomo a vibrazione

COLORAZIONI

• chimiche: reazione tra colorante e substrato

evidenziano molecole come lipidi e zuccheri

COLORAZIONI ISTOCHIMICHE

OLIO ROSSO O O.R.O (PER LIPIDI)

• o.r.o. sciolto in soluzione di alcool etilico ed etere

• alcool etilico ed etere estraggono dalle cellule i lipidi

• o.r.o si deposita al loro posto

P.A.S. (PER ZUCCHERI)

• acido periodico di schiff ossida i gruppi CHOH-CHOH

degli zuccheri

CHOH-CHOH

reagisce con composto fucsina-acido solforoso e da’ colorazione fucsia

CHO-CHO

chimiche

fisiche

chimico fisiche

• FISICHE: precipitazione di metalli su strutture biologiche

• CHIMICO-FISICHE : meccanismo di assorbimento elettrico

substrato e colorante hanno cariche diverse e formano sali fra loro

EMATOSSILINA

EOSINA

Es. impregnazione argentica Sali d’argento + sostanza riducente

liberazione di Ag metallico che si deposita sulle strutture biologiche argentofile (fibre nervose)

ULTRAMICROTOMO

Strumento usato per sezionare i blocchetti di resina in sezioni molto sottili

SEMIFINI: sezioni di 1 uM di spessore, la cui osservazione al m.o. permette di selezionare i campi utili destinati ell’esame ultrastrutturale al T.E.M.

SEZIONI ULTRAFINI: sezioni di 60-70 nm di spessore

Lama di diamante

Il taglio delle sezioni

Raccolta delle sezioni

retino

LA COLORAZIONE

• il contrasto dipende dal numero atomico degli atomi del campione

• piu’ e’ alto il numero atomico, piu’ elettroni sono dispersi, maggiore e’ il contrasto

• le molecole biologiche sono costituite da atomi con numero atomico basso (H, C, O)

• le sezioni vengono contrastate con sali di metalli pesanti

Acetato di Uranile e Citrato di Piombo

…un esempio di applicazione

semifini fini

Sezione trasversale di una foglia Ultrastruttura di cellule a palizzata