TEST RAPIDI IN DIAGNOSI PRENATALE

SOD Diagnostica Genetica Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi

Francesca Torricelli

www.ao-careggi.toscana.it/citogenetica

Le aneuploidie rappresentano oltre il 90% delle anomalie cromosomiche con difetti

congeniti

Un po’ di storia

• 1970 : possibilità di diagnosi di S. di Down su liquido amniotico mediante analisi cromosomica

• 1980: introduzione della FISH per l’identificazione della trisomia 21 su nuclei interfasici di amniociti non coltivati

• 1993 / 1997: QF-PCR per la diagnosi prenatale di aneuploidie

• 2002: Multiple ligation-dependent probe amplification (MLPA)

Diagnosi Prenatale Classica

Villocentesi

• Metodo più usato• Dopo la 15 settimana, spesso tra 16/17• Prelievo di 1ml di liquido amniotico per

settimana gestazionale • Cariotipo dopo coltura di 8-14 giorni• 0.5-1% rischio di aborto• 0,2% fallimento della coltura• 0.2-0.5 rischio di mosaicismo• Possibilità di ripetere amniocentesi o

sangue funicolare• Possibilità di eseguire ITG se il risultato

è patologico

Amniocentesi

• Si esegue tra 10-12 settimane • Prelievo • Biopsia dei villi coriali• Cariotipo su preparato diretto, analisi del

citotrofoblasto metafasi spontanee, risposta 24 ore

• Cariotipo su coltura, mesenchima, risposta dopo 8-10 giorni coltura

• 1% rischio di aborto• 1% rischio di mosaicismo placentare• Possibilità di ripetere amniocentesi• Possibilità di eseguire IVG se il risultato è

patologico

Prenatal Diagnostic Methods

FISH

QF-PCR

MLPA

Quali test rapidi oggi……..3 metodi

FISH su amniociti non coltivati

L’interpretazione clinica di qualsiasi risultato deve essere eseguita unitamente all’analisi citogenetica

standard

Campioni con nuclei aneuploidi inferiori al 10% sono considerati normali sebbene la presenza di

aneuploidie non si possa escludere completamente

Campioni con il 10-60% dei nuclei aneuploidi vengono considerati a mosaico

Campioni con oltre il 60% dei nuclei aneuploidi vengono considerati come dotati di un clone

anormale

FISH in interfase: parametri per l’interpretazione dei segnali

FISH interfasica

Sonde per cromosoma 13 e cromosoma 21

Sonde per cromosoma 18

X e Y

Autori PaeseTipo di

studio

Tipo di popolazio

neNumer

o

Analisi fallite o non informative

%Sensibilità Specificit

à FN FP

Jalal et al. 1998 USA coorte

Alto rischio 310 0.6 100 (44/44) 100 0 0

D’Alton et al. 1997 USA coorte

Alto rischio 315 19.4 100 (21/21) 100 0 0

Aviram-Goldring et al. 1999 Israele coort

eAlto rischio 30 0 100 (7/7) 100 0 0

Eiben et al 1999 Germania

coorte

Alto rischio 3.280 5.7 100

(153/153) 100 0 0

Bink et al. 2000 Germania

coorte

Alto rischio 1.126 16 96.4 (27/28) 100 1 0

Bryndorf et al. 2000 Danimarca

coorte

Alto rischio 463 1 83 (29/35) 100 2 0

Feldman et al 2000 USA coorte

Alto rischio 301 0 100 32/32) 100 0 0

Marguerat et al. 2000 Svizzera coorte

Alto rischio 199 0 83.3 (5/6) 100 1 0

Pergament et al 2000 USA coorte

Alto rischio 2.336 0 100 (87/87) 100 0 0

Thilaganathan et al 2000 UK coort

eAlto rischio 3.202 0.1 99 (93/94) 99.9 1 1

Ulmer et al. 2000 Germania

coorte

Alto rischio 230 5.2 100 (34/34) 100 0 0

Cheon Leung et al. 2001 Canada coorte

Alto rischio 309 6 100 (50/50) 100 0 0

Meyer et al. 2000 USA coorte

Alto rischio 244 0.5 94.7 (17/18) 100 1 0

Sawa et al. 2001 Giappone

coorte

Alto rischio 1.525 4.9 100 (76/76) 100 0 0

Teppemberg et al. 2001 USA coorte

Alto rischio 5.348 2.8 99.6

(570/572) 99.8 2 1

Weremowicz et al. 2001 USA coorte

Alto rischio 911 3 94 (75/80) 100 5 1

Luquet et al. 2002 Francia coorte

Alto rischio 2.000 1.6 98.5

(204/207) 99.8 3 1

Locatelli et al. 2005 Italia coorte

Alto rischio 48 0 100 (20/20) 100 0 0

Wyandt et al 2006 USA coorte

Alto rischio 1.788 ND 98.7 (75/76) 100 1 0

Legenda: FN falsi negativi; FP falsi positivi; ND non disponibile

Accuratezza della FISH in interfase per trisomie 13, 18, 21 e aneuploidie dei cromosomi sessuali

Modificato da: Lisa G.Shaffer and The-Hung Bui, A.J.M.G. 145C:87-98 (2007)

Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) è una tecnica semplice e rapida che consente la diagnosi molecolare delle aneuploidie più comuni (trisomia 21, 13, 18 e aneuploidie dei cromosomi sessuali)

Questo tipo di approccio non richiede colture cellulari: la diagnosi può essere completata in 2-3 giorni

QF-PCR

Il metodo si basa sull'amplificazione di brevi sequenze del DNA che contengono blocchi ripetuti di 2-6 basi (marcatori STRs). Queste sequenze sono specifiche per il cromosoma che si intende analizzare. Usando marcatori per i cromosomi 21, 13, 18, X e Y è possibile diagnosticare le aneuploidie più frequenti.

QF-PCRQuantitative fluorescent PCR

Ratio: 1 : 1 : 1Amplificazione di STR localizzati in differenti regioni del cromosoma

21 mediante PCR

Ratio: 1 : 2

Trisomia del cromosoma 18

I marcatori diallelici si considerano trisomici quando il rapporto fra le aree dei due picchi è <0.65 o >1.8

1 : 1 : 1 1 : 2

Triploidia

Cr. 21

1:2

Cr. 21

1:1:1

Cr. 18

1:1:1

Cr. 13

1:2

Cr. 21

2:1

Cr. 18

2:1

Cr. 13

2:1

Cr. 18

1:1:1

Cr. 13

1:2

Cr. 18

1:2

Cr. 21

1:2 Cr. 18

1:1:1

Cr. 13

Non inf.

Criticità del metodo

Contaminazione con DNA materno

Interpretazione della monosomia X e diagnosi della Sindrome di Turner

Criticità del metodo

Sindrome di Turner ?

Contaminazione con DNA materno

AM XY

Cr. X

Cr. X

Cr. 7

Cr. 13

Cr. X

Cr. 13

Cr. X Cr.

X

Cr. XCr. 7

2:1Turner

Cr. XCr. 7

1:1 XX

Assenza del segnale dell’Y

Verma et al. 1998 2.139 2139 / / / 21: 2-3 32/33

Pertl et al. 1999 247 / 247 / / 21: 4 15/1513: 2 1/118: 3 4/5

Levett et al. 2001 5.000 5.000 / / / 21: 6 57/5713: 6 8/818: 6 17/17X:5-Y:2 20/20

Voglino et al. 2000 1.563 1.302 61 10 280 21: 110/11013: 15/1518: 40/40XY: 25/25

Curcio et al 2004 1.277 996 281 / / 21: 4 26/2613: 3 2/218: 3 8/8XY: 5 6/6

Cirigliano et al. 2004 18.000 16.746 625 123 / 21: 6 344/34413: 4 61/6118: 5 162/162XY: 8 224/224

Ogilvie et al. 2005 9.080 7.327 1.753 / / 21: 2-4 333/33313: 2-4 54/5418: 2-4 130/130XY: 10 36/36

Choueri et al. 2006 420 420 / / / 21: 8 20/2013: 5 1/118: 5 3/3

N° di

campioni

N° di Liquidi

Amniotici

N° di C

VS

N° di S

angue

Fetale N° d

i Aborti

Cromosoma :

N° markers

Sensibilit

à

Accuratezza della QF-PCR per trisomie 13, 18, 21 e aneuploidie dei cromosomi sessuali

Modificato da: Lisa G.Shaffer and The-Hung Bui, A.J.M.G. 145C:87-98 (2007)

MLPA Mulptiple ligation-dependent probe amplification

• Esistino kit commerciali per la diagnosi rapida di aneuploidie con MLPA

• Non necessita di informatività dei markers usati perché quantifica i segmenti analizzati

• Presenta le stesse limitazioni della QF-PCR

• Non evidenzia contaminazione materna

• Non permette di diagnosticare triploidie

MLPA

Autori Paese Totale Normali

concordanti

Anormali concordanti S ND NS FP

Evans et al. 1999USA,UK, svizzera,

svezia146.128 141.965 2.889 / 1.274 / 0

Thilaganathan et al 2000 UK 3.200 3.088 93 5 / 13 1(0.03%)

Thein et al. 2000 UK 1.687 1.576 97 7 / 7 0

Lewin et al. 2000 Francia 27.407 26.268 818 99 / 222 0

Ryall et al. 2001 Australia 3.380 3.251 104 6 / 19 0

Cheong et al 2001 Canada 294 234 50 9 / 1 0

Witters et al. 2002 Belgio 5.036 4.853 125 9 / 49 0

Leung eta l. 2003 Hong kong 1.526 1.461 61 2 / 2 0

Homer et al. 2003 USA 21.609 20.860 524 145 / 80 0

Grimshaw eta l. 2003 UK 3.764 3.666 86 / 12 / 0

Leung et al. 2004 UK 1.548 1.466 60 13 / 9 0

Cirigliano et al. 2004 Spagna, Italia 17.917 17.129 732 / 56 / /

Totale 233.496 225.817 (96.7%)

5.639 (2.4%)

2.039 (0.9%) 1 (0%)

Totale S e NS 295 (0.4%)

402 (0.6%)

Modificato da: Lisa G.Shaffer and The-Hung Bui, A.J.M.G. 145C:87-98 (2007)

Legenda: S clinicamente significativo; NS clinicamente non significativoND non disponibile; FP falsi positivi

DiscordantiDiscordanti Falsi Negativi

Rischio residuo per anomalia cromosomica dopo FISH in interfase o QF-PCR

Test rapidi in diagnosi prenatale

• Identificano solo le aneuploidie dei cromosomi in analisi

• Non è in grado di diagnosticare traslocazioni e delezioni

• La contaminazione con DNA materno può rappresentare un problema

• La presenza di mosaicismo fetale è un problema

• La FISH non si può eseguire se è presente una piccola contaminazione da sangue materno

Svantaggi Vantaggi • Tempi rapidi di risposta• Risultato entro 2-3 giorni• Il rischio di falsi positivi e falsi

negativi riportato in letteratura è basso

• E’ necessario poco materiale di partenza

• QF-PCR è meno costosa e laboriosa della FISH e della citogenetica classica

• QF-PCR può essere automatizzata• La QF-PCR può essere eseguita

anche se nel campione è presente una certa contaminazione da sangue materno

Linee guida 7. QF-PCR FOR RAPID PRENATAL DIAGNOSIS OF ANEUPLOIDY

This technique is a useful adjunct to prenatal diagnosis and is a more appropriate technique than FISH when dealing with large numbers of prenatal referrals. Internal validation is essential before using this technique. Close liaison with Molecular Genetics colleagues is necessary to establish this technique in a cytogenetic laboratory. The limitations of QF-PCR in identifying chromosome abnormalities must be clearly known. It is recommended that testing for trisomies 13, 18 and 21 is carried out, whilst it is acceptable to test for sex chromosome aneuploidy in only a subset of referrals. QF-PCR analysis provides information only about the probe locus in question. It does not substitute for a complete chromosome analysis.

For amniotic fluid, between 0.5 and 4 ml or 1/10 of the sample is recommended for QF-PCR analysis, ……………

For chorionic villus samples, it is recommended that at least two chorionic villi taken from different regions of the biopsy should be processed to minimise the risk of misdiagnosis due to confined placental mosaicism…………..

A chelex-based method is recommended for DNA preparation as this does not require any tube-tube transfers…………

7.3 ANALYSISIt is recommended that both the electrophoretogram and peak measurements,…………………..

To interpret a result as abnormal, at least two informative marker results should be consistent with a triallelic genotype, with all the other markers uninformative. It is unacceptable to interpret a result as abnormal if shown by only one marker. Confirmation of sample identity when a result is abnormal by repeat PCR of the DNA, re-extraction of samples, or maternal blood analysis is recommended. …………………

To interpret a result as normal at least two informative marker results consistent with a normal diallelic pattern are required, with all other markers uninformative.

7.4 REPORTING….. report normal QF-PCR results as ‘consistent with a normal diploid complement forchromosomes 13, 18 and 21’, ‘an apparently normal complement of chromosomes 13, 18 and 21 was detected’, ‘no evidence of trisomy’ or similar statement………

Abnormal reports should include an interpretative statement such as ‘consistent with Down syndrome’, ‘associated with Down syndrome’, ‘indicative of Down syndrome’ or ‘predicted to be affected with Down syndrome’.

http://images.google.it/imgres?imgurl=http://www.ao-careggi.toscana.it/mednuc/IMAGES/logoaouc.jpg&imgrefurl=http://www.ao-careggi.toscana.it/mednuc/index-it.htm&h=252&w=252&sz=52&hl=it&start=1&tbnid=_X5cMD5sH06BbM:&tbnh=111&tbnw=111&prev=/images%3Fq%3Dazienda%2Bospedaliero%2Buniversitaria%2Bcareggi%26gbv%3D2%26svnum%3D10%26hl%3Dit

7.1 Blood-stained Amniotic Fluid Sample

It is acceptable to process all blood-stained samples, though care must be taken when interpreting the results as the blood may be fetal or maternal in origin. Levels of blood-staining in the cell pellet may also correlate with the level of the maternal genotype, though this should be carefully validated before being applied to interpret results. ………………..

The presence of two genotypes in DNA from bloodstained samples is consistent with maternal cell contamination. Results from bloodstained samples can be divided into three categories; ………………………

7.2 Chorionic Villus samples

Maternal material may be present in CVS material prepared for QF-PCR analysis if the sample is of poor quality and/or the removal of maternal decidua is incomplete. Maternal cell contamination in CVS of reasonable quality is generally avoidable and may compromise the QF-PCR and/or karyotype results; every effort should be made to consistently remove all maternal decidua from CVS.

8 MOSAICISM

Mosaicism for trisomy and normal cell lines can be detected by QF-PCR analysis, evident as extra peaks and skewed allele ratios on a chromosome-specific group of markers. These results may be subtle; skewed allele ratios representing the mosaic chromosome may remain in the normal or abnormal ranges (i.e. ratios may all be borderline inconclusive or where the greater area/height is noted to be associated with the larger allele)…………………….

If the QF-PCR result can be confidently interpreted the mosaic result should be reported, although the clinical significance of a mosaic result should be carefully considered in the report. ……………………..

Rare completely discrepant QF-PCR and karyotype results due to placental mosaicism in CVS have been reported ………………………..

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Linee guida per la diagnosi citogeneticaConsensus 2007

Sociatà Italiana di Genentica Umana

6.6.1 FISH Interfasica per l’aalisi delle aneuploidie dei cromosomi 13,18,21,X,Y

.. può essere utilizzata per la ricerca rapida delle principali aneuploidie, il risultato è disponibile in 24-48 ore…….. Può essere utilizzata su trofoblasto nel caso in cui siano assenti metafasi o per estendere l’analisi di un caso di mosaicismo.

Questa indagine non costituisce un’alternativa all’analisi completa del cariotipo, ma è un test integrativo, preliminare e parzialeche può essere utile quando viene richiesta una diagnosi specifica urgente.

6.6 identificzione rapida di aneuploidie

6.6.1 FISH Interfasica per l’aalisi delle aneuploidie dei cromosomi 13,18,21,X,Y

.. può essere utilizzata per la ricerca rapida delle principali aneuploidie, il risultato è disponibile in 24-48 ore…….. Può essere utilizzata su trofoblasto nel caso in cui siano assenti metafasi o per estendere l’analisi di un caso di mosaicismo.

Questa indagine non costituisce un’alternativa all’analisi completa del cariotipo, ma è un test integrativo, preliminare e parzialeche può essere utile quando viene richiesta una diagnosi specifica urgente.

6.6.2 PCR Quantitativa florescente (QF-PCR)

……………..fornisce informazioni limitate ai “sequence tagget site” (STS) utilizzati e che per la definizione dell’assetto cromosomico deve essere associata alla citogenetica convenzionale

….. È necessaria una quantità di liquido amnioticotra 0,5 e 4ml, mentre nel trofoblasto si raccomanda di eseguire l’estrazione di DNA da almeno due frammenti di villo coriale per limitare il rischio di errori diagnostici correlati ai mosaicismi confinati alla palcenta

Linee guida per la diagnosi citogeneticaConsensus 2007

Sociatà Italiana di Genentica Umana

6.6 identificzione rapida di aneuploidie

6.6.3 Multiple Ligation Probe-dependent Assay (MLPA)

…… è una tecnica rapida e relativamente economica che permette di quantificare il numero di copie di oltre 45 sequenze di DNA in un’unica reazione di PCR………………………..

…………… sono sufficienti 20ng di DNA………..

…….è in gradi di discriminare anche una singola copia di DNA………….

Può firnire una diagnosi rapida delle aneuploidie , ma deve sempre essere associata alla diagnosi citogentica tradizionale

External quality assessment of rapid prenatal detection of

numerical chromosomal aberrations using molecular

genetic techniques: 3 years experience.

Prenat Diagn. 2007 May;27(5):404-8. Ramsden SC, Mann K, McConnell C, Hastings R.

National Genetics Reference Laboratory (Manchester),UK ,

External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn. 2007 May;27(5):404-8

•5 campioni inviati ai partecipanti per anno, costituiti da DNA estratto da amniociti non coltivati e da villo coriale

•I partecipanti devono genotipizzare i campioni con i metodi utilizzati di routine e inviare i risultati con i form di risposta utilizzaticon l’iterpretazione completa del risultato

•Tutti i report di risposta sono anonimi

•Nel 2004 è stata valutata l’accuratezza della genotipizzazione, nel 2005 e 2006 la valutazionedei risultati è stata fatta in base alla linee guida :

External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn. 2007 May;27(5):404-8

Fallimenti tecnici 4/265 (1.5%)

Errori di genotipizzazione 1/265 (0.4%) relativo al 2006 non è stato identificato il mosaicismo della trisomia 18

Risultati

Commenti •Aumento di partecipazione negli anni

•Basso il numero di fallimenti tecnici e il numero di errori di genotipizzazione

•Completa interpretazione del risultato da parte del laboratorista, in quanto il clinico di riferimento, vista la specificità del dato può non essere in grado di interpretare correttamente l’aspetto tecnico

•EQA valuta sia gli errori di genotipizzazione che la qualità d’interpretazione del dato clinico

External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn. 2007 May;27(5):404-8

External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular genetic techniques: 3 years experience.

Prenat Diagn. 2007 May;27(5):404-8. National Genetics Reference Laboratory (Manchester),UK ,

EQA (external quality assessment)

Monitorare la qualità del test eseguito

Migliorare la qualità del test eseguito

La partecipazione dei laboratori a EQA è essenziale per l’accreditamento dei laboratori in base ai criteri ISO15189

Schema pilota di EQA per la diagnosi rapida di aneuploidie, inizialmente per i laboratori del Regno Unito e successivamente esteso a tutta Europa