POSIZIONAMENTO DEI NUCLEOSOMI

A) Sequenze preferenziali per la formazione dei nucleosomi

B) Elementi di sequenza e strutturali che escludono i nucleosomi (es. elementi di confine).

Posizionamento dei Nucleosomi Rispetto ad una Sequenza

Il DNA nucleosomizzatoviene trattato con NucleasiMicrococcale

Estrazione del DNA monomerico E trattamento con R Elettroforesi

BlotIbridazione

Nucleosoma in faserispetto ad una sequenza

R taglia in un solo puntodella sequenza monomerica Nucleosoma non in fase

rispetto ad una sequenza

a)

b)

Posizionamento TraduzionalePosizionamento Traslazionale

Posizionamento rispetto ad unelemento di sequenza.La particolare sequenza può essere inclusa o esclusa dal nucleosoma

Posizionamento rispetto allafase dell’elica. La sequenza può trovarsi rivoltaverso l’interno o verso l‘esternosulla superficie del nucleosoma

Il Posizionamento dei nucleosomi presenta risvolti importanti per quantoriguarda la trascrizione genica

Paradosso del Numero di Legame

Ogni ottamero rilascia 1 giro di superelicaIl DNA si avvolge di 1.8 giri intornoall’ottamero Lk = Tw + WrLa variazione del passo dell’elica spiegaparzialmente il paradosso.

DNasi I

Il nucleosoma reagisce al taglio solo su determinati siti.

Periodicità di taglio = Periodicità strutturale (passodell’elica)

Accessibilità del DNA nucleosomale alla DNasi I

Il profilo di taglio identifica una serie definita di siti bersaglio che riflettono specificamente la geometria del nucleosoma, in particolare la disposizione del DNA sulla superficie.

DNasi I: analisi ad alta risoluzione

La stessa tecnica si può applicare a DNA marcato e ricostituito conparticelle core nucleosomali.

•Ogni sito di taglio non dà una banda netta ma una piccolafamiglia di bande.

•Il passo dell’elica del DNA cambia rispetto a quello che siha in soluzione

•In media la periodicità è minore e passa da 10.5bp/giro a 10.2-10.4bp/giro

In particolare:All’estremità del nucleosoma il passo dell’elica è minore(circa 10.0bp/giro) e aumenta verso il centro dellaparticella (circa 10.7bp/giro)

Questo spiega in parte il Paradosso del Numero di Legamein base all’equazione ΔL = ΔT + ΔW

~ 10.0bp

~ 10.7bp

~ 10.7bp

~ 10.0bp

H1 e la formazione di strutture di ordine superiore

Secondo Livello: Fibra da 30nm

COME SI PASSA DALLA FIBRA DA 10nm ALLA FIBRA DA 30nm?

Cromatina che fuoriesce da nuclei lisati: fibra da 30nm

Cromatina trattata con nucleasi micrococcale:fibra da 10nm

La Cromatina è composta di particelle discrete

Cromatosoma

5 mM

1 mM

Il complesso di un nucleosoma con l’istone H1è chiamato “cromatosoma” e contiene 168bpdi DNA + ottamero istonico + istone linker H1

L’istone linker verosimilmente dirige il posizionamento relativo di nucleosomi successivie il profilo dei contatti nucleosoma-nucleosoma

H3

H1N

H3

C

L’istone linker: H1

H1: FAMIGLIA ISTONICA

Nel Topo: H1° espresso nello sviluppo H1t specifico del testicolo H1b coinvolto nell’apoptosi indotta da raggi X

Le funzioni dell’istone H1:• Stabilizzare la fibra da 30nm (punto ancora controverso);• Minimizzare lo slittamento nucleosomale;• Cambia la ripetizione nucleosomale;• Effetti sull’attività trascrizionale.

Il legame di H1 al nucleosoma è altamente dinamico. Modello STOP-AND-GO: H1 viene continuamente scambiato.

Questo suggerisce che esso deve contribuire alla dinamica di folding-unfolding della fibra.

“Collana di perle” Nucleosomi aggregati

Modello folding-unfolding della cromatina e ruolo di H1

Non c’è formazione di fibre spesse organizzatebeneL’alta concentrazione salinaaiuta gli istoni del core nelleinterazioni nucleosoma--nucleosoma

20nm 30nm

Si formano strutture ordinate da 20nm e 30nm

H1 si dissocia

Hizume K. Et al. (2005) Biochemistry 44, 12978-12989

Analisi geometrica di immagini ottenute in AFM

Le fibre di cromatina mostrano diversi stati conformazionali che dipendonoda sottili cambiamenti nell’ambiente circostante

Emergono due possibili classi di modelli per la fibra da 30nm:

1) Elica solenoidale (tecnicamente definita one-start), in cui i nucleosomi sono avvolti in maniera lineare.

Evidenze a favore di questo modello:a) Diametro invariante rispetto alla lunghezza del DNA linkerb) Aumentato compattamento per fibre con 6 o più nucleosomic) Necessità di un DNA linker superavvolto (Robinson et al., 2006)

2) Nastro a zig-zag (definito two-start), in cui il nastro si piega e si superavvolge.

Evidenze a favore di questo modello:a) Variazione del diametro della fibra al variare del linkerb) Percorso a zig-zag dei nucleosomic) DNA linker non strettamente piegato(Schalch et al., 2005)

One-start: modello solenoidale della fibra da 30nm

Polinucleosomi ricostituiti con lunghezzevariabili del DNA linkerCondizioni saline fisiologichePresenza dell’istone H1Tecnica della microscopia elettronica

L’approccio non fornisce informazioni precisesul percorso del DNA linker ma la costanzadelle dimensioni suggerisce che esso sia ripiegato all’interno della fibra in manieracontinua e regolare.

La compattazione è migliore in presenza dell’istone linker

Tetranucleosoma ricostituito analizzato con la diffrazone alla risoluzione di 9Å

LS: linker drittoLB: linker piegato

La presenza di due differenti conformazionidel linker suggerisce che il dinucleosomapossa rappresentare meglio l’unitàripetitiva della struttura di ordine superiore

Le analisi su questa struttura favorisconoil modello a zig-zag per il DNA linker.

Non definisce chiaramente il ruolo dell’istone linker.

Two-start helix: modello a zig-zag della fibra da 30nm

In Xenopus laevis l’istone B4 è l’unico istone presente nell’uovo e viene Rimpiazzato da sottotipi somatici di H1 (H1A) in concomitanza con l’attivazione genica zigotica.L’effetto repressivo di B4 è più debole di quello di H1 somatico.B4 potrebbe contribuire direttamente alla dinamicità della cromatinanell’embriogenesi precoce.B4 differisce da altre varianti per la composizione del tratto C-terminale e la sua basicità è anche ridotta.

Questo aspetto viene studiato utilizzando un metodo di assemblaggio dellacromatina che fa uso di NAP-1 (nucleosome assembly factor-1), unaproteina chaperone per gli istoni H2A e H2B, ma che viene dimostratafunzionare anche come chaperone per B4 e H1A.

H1A protegge il DNA linker dalle nucleasial contrario di B4, quindi la struttura è più compatta.Entrambi, come atteso, legano il nucleosomaal livello dell’asse diadico.

Quindi B4 non riduce l’accessibilità del dinucleosomae permette quindi un più facile rimodellamento dellacromatina.

Accessibilità alla DNAsi del dinucleosoma ricostituito

NAP-1 funziona come chaperonee come scambiatore che facilita ilReclutamento di complessi di remodeling che modulano regionalmente l’istone linker nelnucleo

H1 ha un ruolo importante ma NON è il maggiore determinante della struttura della cromatina Le cellule compensano la perdita di H1 attraverso maniere alternativedi condensare il DNA, ad esempio:Tetrahymena senza H1 presenta nuclei allargati e cromatina meno condensata;Topo senza H1 presenta l’aumento del numero di ottameri istonici e la diminuzionedel DNA linker.

H1 mostra quindi una grande importanza nello stabilizzare piuttosto che nel formarela fibra da 30 nm. Perciò la condensazione potrebbe non richiedere l’associazione permanente di H1 con la cromatina.

Le interazioni elettrostatiche tra nucleosomi contribuiscono grandementealla compattazione della fibra cromatinica.

La coda N-terminale di H4 di un nucleosoma interagisce con gli istoni H2Adel nucleosoma successivo

I residui 14-19 sono fondamentali e in particolare la K16

K16 acetilata destabilizza i contatti nucleosoma-nucleosoma

H2A contiene un “acidic-patch” che è responsabile dell’interazioneQuesto può variare suggerendo un ruolo regolativo di H2A

Interazioni nucleosoma-nucleosoma

Nonostante la stabilità del nucleosoma e dell’alto grado di compattezza nel nucleola cromatina è sorprendentemente dinamica.

Esistono vari modi di modificare la cromatina e rispondere alle necessità dellacellula di regolare i processi biologici dall’espressione genica, alla riparazionedel DNA, alla replicazione e ricombinazione.

1)1) Uso di varianti istoniche, in particolare varianti di H2A e H3.Uso di varianti istoniche, in particolare varianti di H2A e H3.

2) Modificazioni epigenetiche degli istoni: acetilazione, metilazione ed altre.

3) Uso di sistemi di rimodellamento che cambiano la stabilità e/o la posizione del nucleosoma.

Dinamicità della cromatina

VARIANTI ISTONICHE

S viene fosforilata in seguito a danni al DNA

§: differenze in questo loop prevengono l’assemblaggio di un nuc.contenente H2A e H2A.Z

#: questo dominio contatta (H3-H4)2

e variazioni qui influenzano lastabilità del nucleosoma.

§ #

Le varianti istoniche sono coinvolte in vari processi, sia nella espressione genica, sia nella riparazione del DNA, sia nella definizione di strutture eterocromatiche.

H2A.ZIn lievito:a) è richiesto per l’espressione di circa 200 genib) limita l’espansione dell’eterocromatina costituita dal complesso SIR

In mammifero:promuove la formazione dell’eterocromatina (altera la superficie delnucleosoma per promuovere il folding mediato da HP1- Fan J.Y. 2004)

In Drosophila:H2Av = H2A.Z, si localizza sull’eterocromatina e promuove il silenziamentogenico

H2A.XQuesta variante è coinvolta nella riparazione del DNA. Appare nei nucleosomifiancheggianti le rotture a doppio filamento. Funziona come marker per lesionial DNA

H2ABbd (Barr body deficient)In questa variante la natura acidica è ridotta. È ampiamente assente daiCorpi di Barr. macroH2AArricchito nei corpi di Barr e coinvolto nell’inattivazione del cromosoma X

Gli istoni e le loro varianti possono essere scambiate in un processo mediatoda proteine.

Ad esempio lo scambio del dimero H2A-H2B avviene regolarmente con ilprocedere della trascrizione:

1) RNA polimerasi II può da sola spiazzare il dimero H2A-H2B2) FACT (Facilitates Chromatin Trx) spiazza H2A-H2B3) Spt6 aiuta il riposizionamento di dimeri H3-H4

Dati per lo scambio di H2A.Z nella trascrizione:• In lievito H2A.Z viene depositato preferenzialmente nei promotori, quindi avrebbe un ruolo positivo nella trx (Larochelle, 2003)• H2A.Z viene spiazzato nella regione interna trascritta (Farris2005)

SCAMBIO DELLE VARIANTI ISTONICHE NELLA CROMATINA

Chaperone istoniche mediano lo scambio tra istoni e varianti istoniche

NAP-1: 1) Facilita il legame di fattori di trx rimuovendo il dimero H2A-H2B2) Può rimuovere o rimpiazzare H2A da nucleosomi ricostituiti3) Aiuta lo sliding dei nucleosomi rimuovendo transientemente H2A-H2B4) Si trova spesso associato al dimero H2A-H2A.Z e scambia anche questo

HIRA: histone regulatory homolog A eASF-1a : anti silencing function 1a incorporano macroH2A nei foci di eterocromatina associati alla senescenza

HIRA incorpora anche H3.3

I RIMODELLATORI DELLA CROMATINA ATP-DIPENDENTI SONO IN GRADO DIMOBILITARE GLI ISTONI

Swi/SnfRscISWIb

Catalizzano lo scambio di H2A-H2B in maniera ATP-dipendente

SWR1Nuovo complesso SWR1 dedicato alla variante H2A.Z:Promuove esclusivamente lo scambio H2A.Z-H2B H2A-H2B

Contiene molte subunità presenti anche nel complesso NuA4(Act1, Arp4, Rvb1, Rvb2, God1, Vps72, Yaf9)

SWR1(lievito) Tip60(mosca) NuA4Swr1 Domino Tip60 HAT = Esa1

H2A.X

H2A.X è una variante che fosforilata interviene nella riparazione dei danni alDNA.Riconosciuta dal complesso INO80 di lievito che contiene un’ATPasi simile a Swr1.Anche NuA4 e Tip60 (in mammifero e Drosophila) hanno un ruolo nel riparodi DSB e nel riconoscimento e/o eliminazione di H2A.X

H2Av In Drosophlila, combina caratteristiche di H2A.Z e H2A.X nella regione C-terminale.Anche esso si trova nelle vicinanze dei siti DSBdTip60 acetila la forma H2Av (o nucleosomi che la contengono) e lo scambiacon H2Av non fosforilato.