L’impacchettamento del templato in nucleosomi influisce su tutti gli stadi della trascrizione:• legame con gli attivatori• formazione del PIC• allungamento

I fattori di trascrizione sfruttano diverse strategie per ottenere un legame efficiente

TATA

Permanently repressed.

Repressed, but inducible.

TATA

Active, can be modulated.

TATA

factor binding domains

Struttura della Cromatina ed Espressione Genica

Represso ma inducibile

Attivo. Può essere modulato

Permanentemente represso

Legame di fattori trascrizionali

I meccanismi della trascrizione su DNA nudo sono similiin tutti gli organismi nonostante l’aumento di complessitànel macchinario di trascrizione stesso

1°: Legame di attivatori a monte del promotore

2°: Reclutamento di complessi adattatori tipo SAGA, o Mediator

3°: Facilitazione del legame dei fattori di trascrizione generale

4°: Posizionamento di Pol II da parte di TFIID, TFIIA TFIIB Formazione del complesso di preinizio

5°: Fusione di 11-15bp da parte di TFIIH

6°: Fosforilazione del CTD di Pol II durante la sintesi delle prime 30bp

7°: Rilascio dei GTFs e inizio dell’allungamento

I siti DHS sono generati e mantenuti da diversi elementi:

•Attivatori della trascrizione (ad es. Pho4)•Acetilazione (NuA4)•Complessi di rimodellamento•La combinazione dei tre elementi

•Legame di fattori di boundary (Rap1) e/o di elementi di sequenza che escludono i nucleosomi (dAdT)

Studi genomici hanno dimostrato che la densità nucleosomaleè minore sui promotori che sulle regioni codificanti

• Microarrays ad alta risoluzione hanno mostrato che esistonoregioni NUCLEOSOME-FREE di circa 200bp sulla maggioranzadei promotori

• Questi spesso corrispondono a siti DHS

• Di solito sono fiancheggiati da nucleosomi posizionati

Un esempio di gene costitutivamente attivo in lievito: CYC 1

TATA

Dominio stabile

Dominio di Attivazione

UAS 2 UAS 1

Le 60 bp tra i due fattori escludono i nucleosomi poiché i fattori hanno altaaffinità per i siti. Il legame alle UAS è più dinamico, ma la perdita di un fattore non implica la riformazione del nucleosoma.

Non sempre la presenza del nucleosoma esclude la possibilità di trascrivere un gene

E’ possibile in certi casi che i siti per l’interazione con i fattori di trascrizione sitrovino adiacenti sulla superficie del nucleosoma e che questo, di fatto, favoriscal’assemblaggio del macchinario di trascrizione

F E D C B A

-32-210-430-600-810

-200NF1

HRE Otf 1

• Questi fattori sono capaci di legare il DNA nudo, ma non tutti insieme.• NF1 e Otf1 non possono legare da soli i nucleosomi fasati.• Due siti HRE vengono occupati sulla superficie del nucleosoma.• Ciò espone i successivi siti HRE ed avviene il legame.• Questo permette il legame di ENTRAMBI NF1 e Otf1.

MMTV è come un gene inducibile nei mammiferi(MMTV: mouse mammary tumor virus)

I Fattori non possono legarsi tutticontemporaneamente sulDNA substrato

I Fattori possono tutti legareil DNA substrato quando questo è in una conformazione nucleosomale.

Il Legame dipende dalla natura del promotore dell’ MMTV

GENI INDUCIBILILA CROMATINA VIENE SOTTOPOSTA A RIMODELLAMENTO

IN MODO CHE LE REGIONI REGOLATRICI DEI GENI POSSANO DIVENTARE ACCESSIBILI AL MACCHINARIO

DELLA TRASCRIZIONE

TA TA PHO5

-1-2-3-4-5

Attivazione del gene PHO 5 in bassi livelli di fosfato

A TT A PHO5

Siti Pho4 Sito Pho2

Pho4 viene defosforilatoper potersi legare al suo sito

La cromatina viene rimodellatain modo da lasciare scoperti i sitiper l’attivazione della trascrizione

Nonostante la stabilità del nucleosoma e dell’alto grado di compattezza nel nucleola cromatina è sorprendentemente dinamica.

Esistono vari modi di modificare la cromatina e rispondere alle necessità dellacellula di regolare i processi biologici dall’espressione genica, alla riparazionedel DNA, alla replicazione e ricombinazione.

1)1) Uso di varianti istoniche, in particolare varianti di H2A e H3.Uso di varianti istoniche, in particolare varianti di H2A e H3.

2) Modificazioni epigenetiche degli istoni: acetilazione, metilazione ed altre.

3) Uso di sistemi di rimodellamento che cambiano la stabilità e/o la posizione del nucleosoma.

Dinamicità della cromatina

Il legame dei fattori e la perdita degli istonipossono anche essere consequenziali.

Questo di solito coinvolgela partecipazione diFATTORI DI RIMODELLAMENTO

Questo enzima non taglia sul nucleosoma ma solotra particelle adiacenti. Si possono ottenere digesti parziali

Dopo la digestione gli istoni vengono rimossi

Le variazioni di struttura della cromatina si possono studiare usando la MNasi

R

R

Taglio con R, elettroforesi e blot.Sonda

MN U

-2

-1

+1

+2

+3

+4

+1 +2 +3 +4-1

RISTATA

+1 +2 +3 +4-1

Rep

Ind

nessuna media altabassa

Modificazioni Nucleosomali

MN U

RepressoIndotto

ATTIVAZIONE DEL GENE ADH2 IN ETANOLO

TATA

RIS

RIMOZIONE DEGLI ISTONI

La rimozione degli istoni da una regione di DNA può avvenire tramite:

Slittamento dei nucleosomi lungo una sequenza

Disassemblaggio del nucleosoma tramite rimozione sequenziale degli istoni

Trasferimento degli istoni su un’altra regione del DNA

Rimodellamento è ancheCAMBIAMENTO CONFORMAZIONALE SUL NUCLEOSOMACON ESPOSIZIONE DI PORZIONI DI DNA

L’accessibilità dei fattori di trascrizione al promotore e/o laliberazione di questo dai nucleosomi si ottiene con la partecipazione di:

SISTEMI DI RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINA

Di questi sistemi ne sono stati trovati finora due classi:

• Complessi di rimodellamento della cromatina ATP-dipendenti

• Complessi di rimodellamento che contengono Acetiltrasferasi o Deacetilasi Istoniche

ACETILTRASFERASI NUCLEARI (HAT)

• Le HAT nucleari sono contenute in complessi multisubunità di massa molecolare molto alta.

In lievito i principali sono: SAGA = 1.8MDa NuA4 = 1.4MDa NuA3 = 0.5MDa ADA = 0.8MDa

Deacetilasi e Acetiltrasferasi in lievito

Funzionano tutte attraverso il legame di altri fattori che le portanosul templato

Rpd3 (correlata ad HDAC1,2,3)lega Sin3 è portata sul promotore da Ume6

Hda1 (correlata ad HDAC 4, 5, 6)lega Tup1

Gcn5 (subunità di SAGA con molti omologhi)lega Gcn4

Altre deacetilasi di lievito:Hos1 e Hos3 lavorano principalmente sui geni ribosomaliHos2 deacetila le regioni codificanti

Esa1 (subunità di NuA4 con molti omologhi)lega Gcn4

Specificità di azione degli enzimi HAT e HDAC in lievito

Geni regolati da Ume6Es: INO1

Geni regolati da Gcn4Es: HIS3

Membri di tre differenti famiglie HAT

Il dominio Acetiltrasferasicoè conservato nelle famiglie e comune a tutte.

Complessi di Rimodellamento ATP-dipendenti

• CLASSE SWI/SNF: SWI/SNF = 2Md (ATPasi Snf2) RSC = 1Md (ATPasi Sfh2)

• CLASSE ISWI: Tutti complessi di circa 400-500Kd ATPasi comune ISWI NURF CHRAC ACF

• CLASSE Mi2: ATPasi Mi2-CHD3/4

Il rimodellamento della cromatinapuò essere un meccanismo checoinvolge anche diversi passaggi.

Complessi di rimodellamentodi tipo diverso possono cooperareper aprire la cromatina.

Cascata di eventi nell’iniziodella trascrizione del gene per IFN-β

In seguito a infezione virale:

•il promotore diventa progressivamentepiù acetilato da parte di GCN5 umano su Lys8H4 e Lys9,14H3

•AcLys8H4 recluta SWI/SNF attraversoil BROMODOMINIO della subunità BRG1

•segue il reclutamento di TFIID attraversoil BROMODOMINIO di TAFII250 che lega AcLys9,14H3

I complessi di rimodellamento ATP-dipendenti hanno moltepliciattività biochimiche studiate in vitro

a) Alterazione deiprofili di tagliodella DNasiI

b) Formazione dinucleosomi rimodellati

d) Trasferimentodell’ottameroistonico

e) Alterazione delleposizioni traslazionalidegli ottameri

f) Assemblaggio espaziatura dei nucleosomi

g) estrusione distruture cruciformi

IN TUTTI I CASIIL PROFILODNasiI è ALTERATO

g) Accesso alterato aglienzimi di restrizione

h) Rimodellamento topologicoin molecole circolari chiusenucleosomizzate

IL NUMERO DI SUPERAVVOLGIMENTIPUO’ ESSERE RIDOTTO SENZA LA PERDITA DI OTTAMERI ISTONICI

Modelli per la regolazione della cromatina durante l’inizio della trascrizione

Le proteine regolatrici e i complessi di rimodellamento possono agire in combinazione e in ordine differente, e alla fine comportano sempre lo stesso risultato: un substrato pronto per la trascrizione.