PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

2

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO

Fasi richieste per ottenere piante transgeniche:

1.clonaggio del gene

2.incorporazione del gene in un vettore

3.incorporazione del gene nel DNA della specie ricevente e

selezione delle piante trasformate

4.verifica dell'incorporazione del gene e della capacità di

esprimere le sue funzioni nella specie ricevente.

PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM):METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

3



Incorporazione del gene in un vettore e tipi di vettori

Il vettore più utilizzato è il plasmide, molecola circolare di DNA capace di replicazione autonoma nella cellula batterica.

Si deve distinguere tra vettori utilizzati nella trasformazione con

•metodi fisici•Agrobatterio

Raramente, si utilizzano anche vettori virali.

Figura 19.26Confronto tra vettori virali e plasmidici riguardo alle loro modalità di espressione.

4



5

Figura 19.27Elementi costitutivi essenzialidi un genoma virale e vettore modelloper l’espressione transiente di un gene esogeno in pianta.



6


Uno dei plasmidi più utilizzati per clonare in E. coli è pbr322:dimensioni ridotte (4363 bp);due marcatori: resistenza all'ampicillina (apr) ed a tetraciclina (tcr);numerosi siti unici di restrizione;integra frammenti di DNA da clonare lunghi fino a ca 10 kb.


Esistono varie categorie di vettori:di clonaggio (pbr 322 di E. coli);di trasformazione (pbr 322 + gene marcatore selezionabile);di espressione (pbr 322 + gene marcatore selezionabile + sequenze per la corretta espressione del gene da trasferire).

7

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA VIRUS E AGROBATTERICaratteristiche di un vettore di espressione:dimensioni ridotte per facilitarne l'isolamento e la sopravvivenza nella cellula;presenza di vari siti di restrizione unici per inserire le sequenze da clonare;Capacità di integrarsi nel genoma dell'ospite;presenza di marcatori genici in grado di conferire un vantaggio selettivo alle cellule trasformate

presenza di promotori efficienti che garantiscano una attiva trascrizione del DNA inserito.


Come agisce Agrobacterum tumefaciens? Possiede un plasmide, chiamato plasmide Ti (Tumor Inducing) di circa 180 kb, che contiene un segmento di DNA, definito T-DNA, che penetra all'interno delle cellule vegetali integrandosi nel loro genoma e

ne provoca la crescita incontrollata.

8

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO AGROBATTERI

Chi è Agrobacterum tumefaciens?E’ un batterio gram negativo della famiglia delle Rhizobiacee di forma bastoncellare. È


capace di infettare principalmente piantecrescitadicotiledoni

paragonabile patologia nota colletto.

e causare unaa quella tumorale, unacon il nome di galla del

9



I plasmidi Ti sono costituiti da:

un frammento (T-DNA) che vieneintegrato nel genoma della piantaospite;la regione Vir che contieneotto operoni responsabilidella virulenza; i geni per

opine; sequenze

il catabolismo delle

chepermettono laconiugazione tra cellule

batteriche;un’origine di replicazioneche permette di mantenere ilplasmide nel corso dellaproliferazione delle cellulebatteriche.

10

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA AGROBATTERI

Regione del T-DNA – regione di ca. 50 kb che viene inserita nel DNAdella pianta ospite e delimitata da sequenze terminali denominate “RB -right border” e “LB - left border“.


Una volta inserita nell’ospite, la regione T provoca:

crescita tumorale, interferendo mediante ipropri produzione di auxine e citochinine della

pianta.

geni oncogeni con la

sintesi delle opine che fungono da substrato metabolico per gli Agrobatteri e stimolano anche la coniugazione del plasmide Ti .

11


Regione Vir

La regione (ca. 40 kb) contiene 8 operoni vir (A, B, C, D, E, F, G ed H), per lo piùpolicistronici (vari ORF), che regolano la sintesi delle proteine indispensabili per ilriconoscimento dell’ospite e il trasferimento del T-DNA alle sue cellule.

L’espressione dei geni vir avviene solo in presenza di cellule meccanicamentedanneggiate.

Il trasferimento del filamento -T è in parte analogo alla coniugazione batterica. Ledifferenze consistono nel superamento della parete e membrana cellulare e delcitoplasma dell'ospite e nell'integrazione nel DNA nucleare.



Un meccanismo complesso…

1.Attivazione mediante segnale della pianta (composti fenolici prodotti inseguito a ferita).

2.Induzione del complesso di virulenza(geni Vir)

3.Generazione del pilo per il trasferimento del T-DNA

4.Formazione del T-DNA transfer complex.

5.Trasporto all’interno della cellula vegetale

6.Integrazione nel genoma vegetale


13

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA AGROBATTERICome sfruttare Agrobacterum tumefaciens per la trasformazione genetica vegetale?

L'inattivazione dei geni oncogeni responsabili del tumore porta all'ottenimento diplasmidi "disarmati" che risultano funzionali per il trasferimento ma noncausano tumore (vengono mantenute le sequenze di bordo e un marcatore diselezione vegetale o un gene reporter).

La virulenza di un particolare ceppo di Agrobatterio dipende da eventualimutazioni nella regione vir, alcune delle quali hanno consentito di ottenereceppi ipervirulenti capaci di infettare anche cellule di Monocotiledoni.

Clonare all’interno del T-DNA disarmato la sequenza del gene di interesse cheverrà trasferito alla cellula vegetale. Si include un polylinker sintetico con vari sitiunici di restrizione in cui inserire uno o più geni da trasferire.


14



I plasmidi per clonare in E. coli non si replicanoin Agrobatterio e i plasmidi Ti non hannoregione di replicazione per E.coli.

PROBLEMA

SOLUZIONE

VETTORI COINTEGRATI VETTORI BINARIDue plasmidi separati:VETTORE BINARIO

Un unico plasmide contiene tutte le funzioni necessarie per:• Replicazione autonoma in E.coli e

Agrobacterium.• Clonaggio della sequenza del

gene di interesse.• Geni per il

trasferimentocellula vegetale.

nella

• Replicazione autonoma in E.coli eAgrobacteium.

• Clonaggio della sequenza delgene di interesse.PLASMIDE HELPER• Geni per il trasferimento nellacellula vegetale.

16

METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICAMETODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO AGROBATTERI

Vettori binari (2 plasmidi separati):

Un PLASMIDE BINARIO di dimensioni ridotte (ca. 10 kb) con un "mini" T-DNA cheporta il gene da trasferire e capace di replicazione autonoma in diverse speciebatteriche (es. E. coli e Agrobacterium).

19.6PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM):

Richiedono la presenza di un PLASMIDE HELPER,presente solo nell’Agrobatterio, contenentela regione vir; il plasmide helper deriva da unplasmide Ti "disarmato" e fornisce in trans lefunzioni di virulenza. Nell’ Agrobatterio siintroducono quindi due plasmidi, entrambicapaci di replicazione autonoma.

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO E AGROBATTERI

Si esaminano prima le problematiche relative all’utilizzazione dell’Agrobatterio. Numerosi fattori influiscono sull’efficienza globale di trasformazione:

La parte iniziale del processo (interazione Agrobatterio-pianta) è maggiormentecontrollata dal patrimonio genetico dell’Agrobatterio.La fase di integrazione della copia del T-DNA dipende dalle condizioni presenti nellecellule della pianta e dai fattori che regolano i processi di sintesi e di riparazione del DNA.Nella fase successiva è importante la proliferazione e la differenziazione delle cellulestabilmente trasformate. Necessità di sistemi in vitro caratterizzati da elevato tasso diproliferazione e capacità morfogenica elevata e prolungata nel tempo.

In passato, la maggiore limitazione all'uso di A. tumefaciens è statala specificità per le Dicotiledoni. A partire dal 1995, l’uso di ceppi ipervirulenti hapermesso di trasformare riso e mais utilizzando A. tumefaciens. Oggi quasi tutti icereali sono trasformabili con Agrobatterio.

18


19

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA AGROBATTERI

L’infezione può essere realizzata immergendo gli espianti in unasospensione di Agrobatterio oppure procurando lesioni all’espianto conuna lama previamente immersa nella sospensione batterica.

Nella fase di co-coltura, gli espianti vengono posti in substrato privo diantibiotico su cui vengono lasciati per pochi giorni. Terminata lafase di co-coltura si procede ad una decontaminazione degli espiantidall’Agrobatterio con antibiotici opportuni.

Nella fase selettiva vera e propria, volta all’isolamento delle cellule cheesprimono il gene marcatore, al fine di limitare gli “escape” ènecessario mantenere l'agente selettivo nelle successive subcolture.


20

METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICAMETODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA AGROBATTERI

19.6PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM):

21

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO CON METODI CHIMICO-FISICI

Come metodi alternativi all’ A. tumefaciens si sono sviluppati sistemi che non utilizzano un vettore biologico e che quindi prescindono dalle interazioni tipiche tra i componenti di un sistema biologico:

•Metodo biolistico

•Elettroporazione

•PEG/Lisosomi

•Microiniezione

•Trasformazione mediata dal cloroplasto

Ideati principalmente per specie recalcitranti alla trasformazione con Agrobacterium


22


METODI DI TRASFERIMENTO GENICO CON METODI CHIMICO-FISICI

Metodo biolistico:

Particelle ricopertevengono accelerate

con copie del genead alta velocità

perconsentire la loro penetrazione nelle cellule bersaglio.

ASPETTI TECNICI: microproiettili di tungsteno, oro,platino (1-4 µm di diametro) vengono accelerati a 400-550m/s mediante l’uso di polvere da sparo, ariacompressa, scariche elettriche o gas compressi. Peraccelerare maggiormente le microparticelle le si faaderire ad un “macrocarrier” poi intercettato prima diraggiungere il tessuto bersaglio.

TESSUTI BERSAGLIO: callo embriogenico edorganogenico, embrioni immaturi (cereali), polline,meristemi, foglie, endosperma, sospensioni cellulari.Il successo del metodo biolistico

dipende dalla capacità di penetrazionedelle microparticelle e procurato alle cellule.

dal danno

23

METODI CHIMICO-FISICI DI TRASFERIMENTO GENICO

Il metodo biolistico è particolarmente utile per determinare in tempi brevi (1-2giorni) l'espressione transiente di geni anche se non integrati nel DNA genomico.Il metodo biolistico permette quindi saggi di espressione transiente inmolti tipi di tessuto di specie diverse in tempi brevi.

Successivamente si verifica la stabilità dell’espressione a distanza di ca. 1-2 mesi dopo una fase selettiva: in questo caso, il livello di espressioneriscontrato, è maggiormente predittivo dell’integrazione stabile del DNA nelgenoma vegetale.


25

INTEGRAZIONE ED ESPRESSIONE DEI TRANSGENI

Selezione e rigenerazione delle colture transgeniche

Data la bassa frequenza di trasformazione, è necessario utilizzare geni marcatori selezionabili eucariotici per recuperare le cellule trasformate. A tal fine le caratteristiche ideali del gene marcatore sono:

la facile identificazione delle cellule che lo esprimonopoche possibilità di escape delle cellule non trasformate all'agente selettivo a cui il gene marcatore conferisce resistenzanessun effetto negativo sulla capacità rigenerativa dei tessuti e sulla fertilità delle piante rigenerate

i geni marcatori più utilizzati sono: epsp sintetatsi, fosfinotricina acetiltransferasi (PAT, BAR), acetolattato sintetasi, neomicina fosfotranferasi II (NPTII).


26


Verifica dell'incorporazione del gene e dell’espressione nella pianta e caratterizzazione delle progenie

Per essere utilizzabili in programmi di miglioramento genetico le piante transgeniche devono esprimere regolarmente il gene inserito e, qualora si tratti di specie a propagazione sessuata, mantenere inalterato il livello di espressione nelle generazioni successive.

L’avvenuta trasformazione e la corretta espressione del transgene si dimostrano a livello genetico, citogenetico, biochimico e fenotipico.

Segnali Southern in DNA non digerito ad alto peso molecolare, bande PCR, o segnali da una singola linea putativamente trasformata non sono criteri accettabili poichè è più difficile escludere la possibilità di artefatti in tali dati.


27

Figura 19.35Sezione di tessuto fogliare con cellule competenti, non competentie potenzialmente competenti alla rigenerazione e/oalla trasformazione.



28

INTEGRAZIONE ED ESPRESSIONE DEI TRANSGENILa sopravvivenza di linee cellulari su substrato selettivo non è sufficiente, poichè vi è la possibilità di escape, di protezione da parte di prodotti secreti da cellule microbiche contaminanti e/o la selezione di mutanti resistenti all'agente selettivo. Saggi enzimatici su estratti cellulari sono inadeguati per la possibile presenza di cellule microbiche contaminanti.L’analisi del fenotipo fornisce indicazioni spesso imprecise a seguito della tenue o mancata espressione e/o a seguito di silenziamento del gene inserito.

Dati fenotipici certi richiedono:risultati negativi da controlli non trasformati;un saggio che riveli il prodotto del transgene all'interno delle cellule vegetali distintamente da possibili cellule microbiche contaminanti;preferibilmente, il transgene non sarà espresso in cellule batteriche (GUS con un introne);Non si nota specificità di sequenza per i siti di inserimento nel genoma dellapianta.Rispetto al metodo con Agrobatterio, il metodo biolistico integra un maggior numero di copie nel genoma della pianta;


29


Importante verificare il destino del gene marcatore utilizzato per selezionare gli eventi transgenici e del gene per cui non si applica pressione selettiva; l’orientamento del gene marcatore e del gene da trasferire possono influire sul grado di riarrangiamento e di espressione.

La struttura dei transgeni integrati risulta più complessa in assenza di pressione selettiva.

La caratterizzazione dei materiali transgenici prevede la verifica di:organizzazione molecolare delle sequenze inserite nel genoma della pianta;

livello di espressione dei geni inseriti;

trasmissione dei geni inseriti ed analisi dei rapporti di segregazione.


30

Tabella 19.4 Elenco di sistemi di geni marcatori selezionabilie di geni reporter usati per la trasformazione geneticadelle piante.

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA VIRUS E AGROBATTERI


INTEGRAZIONE ED ESPRESSIONE DEI TRANSGENIPrincipali geni reporter utilizzati in Ingegneria Vegetale

Pianta di N. tabacum trasformata con il gene della Luciferasi


Pianta ditrasformataGUS

Arabidopsis con il gene

Pianta di Arabidopsis trasformata con il gene GFP

32

Figura 19.36Segregazione 3:1 di un ipotetico marcatore PCR-derivato osservata nella discendenza T1 ottenuta autofecondando una pianta T0

avente una singola copia del transgene.



34


Trasmissione del transgene e rapporti di segregazione

Verificare la trasmissibilità del transgene per via materna e per via paterna, poichè particolari riarrangiamenti cromosomici sono trasmessi in misura diversa per via femminile e per via maschile.

Verificare la trasmissibilità del transgene per autofecondazioni successive o attraverso incrocio.

Trasmissione del transgene alle progenie

In un caso si è rilevata instabilità alla terza generazione dopo autofecondazione.In alcuni casi si è riscontrata assenza di espressione per silenziamento del gene sia a seguito di autofecondazione che di incrocio.


APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHEApplicazioni dell'ingegneria geneticaObiettivi principali dell’ingegneria genetica applicata al miglioramento genetico dellepiante erbacee:generare piante utili non ottenibili con il miglioramento convenzionale;correggere difetti in cultivars in modo più efficiente rispetto al miglioramento convenzionale;

L'entità del successo dipende dall'efficienza della trasformazione e dall’effetto fenotipico e dalla stabilità di tale effetto in condizioni ambientali diverse e nelle successive generazioni

Distinguere tra interventi per aggiungere una nuova funzione (es: resistenza a insetti) da interventi per eliminare o ridurre una funzione indesiderata (es: inibizione della PG o della biosintesi dell’etilene per ritardare la maturazione del frutto).

Specie erbacee di elevato interesse agronomico fino ad ora trasformate con successo: mais, riso, frumento, orzo, cotone, soia, fagiolo, barbabietola, girasole, fagiolo, tabacco, petunia, patata, pomodoro, melanzana, cassava.



Diffusione delle piantetransgenichePrincipali Produttori:

•Stati Uniti d’America (69 millioni di ha)Mais, Soia, Cotone, Canola, Barbabietola, Erba medica

•Brasile (30.3 milioni di ha)Soia, Mais, Cotone

•Argenitina (23.7 milioni di ha)Soia, Mais, Cotone

•India (10.6 milioni di ha)Cotone

•Canada (10.4 milioni di ha)Canola, Mais

Crescita esponenziale dellacoltivata a colture transgeniche:

superficie

Dai 1.7 milioni di ha del 1996 ai 160 milioni di ha del 2011.


Diffusione delle piantetransgeniche

Negli ultimi anni l’incremento delle superfici adibite alla coltivazioni transgeniche è dovuto in particolare a Paesi in via di Sviluppo

Un record di 170.3 milioni di ettari è stato raggiunto nel 2012 con un incremento rispetto all’anno precedente del 6 %.

APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE

Considerazioni sull’utilizzazione dei prodotti vegetali transgenici

I rischi associati all’uso in campo ed al consumo di prodotti vegetali transgenici vanno rigorosamente valutati e saggiati con attenzione di caso in caso.Esistono Istituzioni e Commissioni di esperti in materia preposti alla definizione delle regole e dei protocolli da seguire e delle prove tossicologiche necessarie per determinare l’evetuale patogenicità di certi prodotti transgenici (es: allergenicità).I timori presenti al momento attuale nel pubblico sono del tutto ingiustificati sulla base dei risultati sino ad ora ottenuti. Questo non comporta l’abbandono di un atteggiamento di cautela.E’ preoccupante il ruolo preponderante che il settore privato ha assunto in questo settore, soprattutto per i grossi investimenti richiesti per la commercializzazione delle colture GM.Un problema normativo rilevante è costituito dalla brevettazione dei protocollisperimentali, dei geni clonati e delle piante transgeniche così ottenute.


Consensus Document (5/5/2004). Sicurezza alimentare e OGM.

http://www.siga.unina.it/circolari/Consensus_ITA.pdf

Consensus Document (15/3/2006). Cesistenza tra colture tradizionali, biologiche e geneticamente modificate

http://www.salmone.org/wp-content/uploads/2007/09/consensus-coes.pdf

Documenti siglati da tutte le maggiori Società scientifiche italiane

Altri link di interesse per colture transgeniche

http://www.salmone.org/

www.AgBioWorld.org

Vedi anche: http://www.youtube.com/watch?v=QoXU6f-Arbo

http://www.siga.unina.it/circolari/Consensus_ITA.pdf






http://www.salmone.org/

http://www.agbioworld.org/

http://www.youtube.com/watch?v=QoXU6f-Arbo


Le principali applicazioni delle piante transgeniche sono:

modificare il processo di maturazioneresistenza ad erbicidiresistenza a stress biotici (virus, batteri, funghi, nematodi, insetti)resistenza a stress abiotici (freddo, salinità, eccesso idrico, pH, siccità)modificare la composizione delle sostanze di riserva (carboidrati, lipidi, proteine)modificare la biosintesi di metaboliti secondari (es: antociani, carotenoidi, ecc.)modificare la fenologia (es: fitocromo, data di antesi)modificare la ripartizione di fotoassimilati (es: rapporti sink-source)produzione di anticorpi a fini terapeutici (es: immunoglobuline)produzione di vacciniproduzione di enzimi ad uso industriale (es: alfa-amilasi)



Resistenza ad erbicidiGeni per resistenza ad erbicidi ad ampio spettro di azione e caratterizzati da elevata attività specifica, bassa tossicità, rapida biodegradazione. Si sono perseguite due strategie:

Principali specie trasformate: mais, cotone, soia, canola

Trasferimento di geni in grado di inattivare l'erbicida:

Glufosinate (fosfinotricina e bialaphos). E’ il principio attivo dell’erbicida Basta; inibisce l’azione della GS (glutamina sintasi) e quindi altera tutto il metabolismo azotato della cellula. Il gene bar isolato da Streptomyces hygroscopicussintetizza la fosfinotricina acetiltransferasi (PAT) che detossifica il glufosinate.

Bromoxynil e’ il principio attivo dell’erbicida Brominalmais che viene utilizzato anche in miscela; inibisce il trasporto degli elettroni nella fotosintesi e la respirazione. Si è utilizzato il gene bxn da Klebsiella azaenae che produce un enzima in grado di catabolizzare il bromoxinil.



Trasferimento di geni insensibili all'erbicida:

Glifosate. E’il principio attivo dell’erbicida Roundup; inibendo l’azione della EPSP sintasi, blocca, nel cloroplasto, la biosintesi degli aminoacidi aromatici. Il gene EPSP sintasi insensibile al Glifosate è stato isolato in Salmonella typhimurium.

E’ anche possibile ottenere resistenza attraverso la sovraespressionedell’enzima della pianta mediante l’uso di promotori costitutivi forti.

Principali specie trasformate per resistenza ad erbicidi: mais, cotone, soia, canola

Più recentemente anche:

•Amaranthus palmeri trasformato con il gene della EPSP sintasi (Gaines et al., 2010)

•Patata dolce (Ipomoea batats) trasformata con gene bar per la resistenza a Glufosinate (Zang et al., 2009)


Tabella 19.7Alcuni esempi di erbicidi con diversa modalità di azionee di enzimi codificati da geni clonati per lo più nei procariotied impiegati per produrre piante transgeniche resistenti agli erbicidi.




Resistenza a stress biotici

Coat protein: Geni del capside virale che espressi nella pianta conferiscono resistenza a vari virus. Siritiene che la resistenza sia riconducibile ad un meccanismo di co-soppressione: lapianta, riconosciuta la CP come proteina estranea, attiverebbe la sintesi di una molecola specifica ingrado di bloccare od attenuare l’espressione del gene virale deputato alla sintesi della CP.Piante transgeniche che esprimono I geni CP di Tobacco Mosaic Virus (TMV) sono risultate resistenti aTMV (Powell-Abel et al., 1986). In Cina è stata commercializzata la prima varietà di Tabaccoresistente a virus e da allora anche zucchino e melone.

Un altro metodo si basa sulla manipolazione delle proteine che permettono il passaggio del virus tra iplasmodesmi che uniscono le cellule. Rispetto al precedente metodo, risulta a spettro d’azione piùampio ed è più difficilmente superabile da parte del virus.

Espressione in tabacco del gene di lievito L3Δche conferisce in frumento resistenza alla tossicità daDeossinvalenolo (DON) tossina del fungo Fusarium gramienarum (Di et al., 2010). La tossina DONinibisce la traduzione mediante legame con la proteina L3 ribosomiale. La proteina L3Δ di lievitorisulta invece insensibile alla tossina.


APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHEResistenza ad insetti

Uno dei più grandi successi della trasformazione genetica dei vegetali:

Il gene Bt di Bacillus thuringensisLa tossina Bt risulta efficace soprattutto contro Lepidotteri e in misura minore contro Ditteri e Coleotteri.

Innocua per Mammiferi

La proteina BT viene sintetizzata all’interno della pianta sotto forma di cristallo inattivo (cry-Bt). Se ingeritadall’insetto, la proteina viene resa attiva in seguito a digestione intestinale. La tossina attiva si lega arecettori delle cellule intestinali e determina la perdita incontrollata di ioni e morte cellulare perlisi osmotica.

Il Bacillus thuringiensis è anche utilizzato direttamente irrorando le colture; il trattamento risultaperò alquanto oneroso e di scarsa efficacia se non ripetuto periodicamente. A seconda della composizioneamminoacidica, le proteine BT risultano più efficaci nei confronti di particolari ordini di insetti.

Cotone e mais Bt sono le colture che hanno riscosso il maggior successo.


Figura 19.44 Batteri di Bacillus thuringiensis (A) ed esempi di piante transgenicheresistenti agli insetti: danni da piralide in spighe e culmi di mais (B, C): varietà di mais Bt (D); foglie di una varietà di soia Bt e di una normale (E,F); capsule di una varietà di cotone Bt e di una normale (G,H).



Mais BT resistente alla piralide e alla diabrotica

(geni CryA da Bacillus thuringiensis)

wild-type

Danni alla radicecausati dallaDiabroticaMais GM per il

gene cry3Bb1

• Le biotecnologie contribuiscono ad una produzione più sostenibile di prodotti vegetali tramite:

• Minor consumo di pesticidi

• Minor numero di lavorazioni del terreno

• Minore erosione del suolo

• Maggiore produttività

• Maggiore reddito per l’agricoltore

• Produzione più economica di biomasse

Benefici derivanti dalla Gene Revolution


APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHEResistenza ad insettiAltri esempiAlcune piante sono naturalmente equipaggiate con sistemi di difesa naturale.

Inibitori delle Proteasi: L’apparato digerente di molti insetti contiene tripsine e chimotripsine.L’inibizione di queste proteine causa gravi danni alla loro crescita e sviluppo. Esempio del Riso:trasformato con inibitori della proteasi della patata, di fagiolino, soia e orzo.

Inibitori della Alfa-amilasi: Inibiscono negli insetti il normale metabilismo dei carboidrati.L’espressione di alfa-amilasi di segale (Secale cereale) in tabacco ha consentito di sviluppare pianteresistenti a Anthonomus grandis (curculionide patogeno di molte specie vegetali).

Lectine: Sono proteine di origine vegetale in grado di legare specifici carboidrati. Lectine da Bucaneve(Galanthus nivalis) chiamate GNA sono state ampiamente utilizzate per introdurre resistenza a insetti inspecie coltivate (Riso e Patata). Determina 80% di mortalità senza alcun effetto sui mammiferi ed haeffetto principale su omotteri e afidi.

Figura 19.45 Mortalità delle larve del coleottero Callosobruchus maculatussulle piante di pisello transgenico in relazione alla quantitàdi inibitore dell’α-amilasi.





Resistenza a stress abiotici L’identificazione di geni responsabili della resistenza agli stress abiotici è molto complesso:

• Controllo genetico quantitativo.• Caratteri differenti sotto controllo degli stessi geni (effetti

pleiotropici).• Differenti forme di stress abiotico interagiscono tra loroattenuando o magnificando l’effetto dello stress.• Condizioni ambientali difficili da controllare e spesso più

tipologie di stress agiscono contemporaneamente

Difficile identificare geni veramente utili per trasformazione genetica

Possibili geni utilizzabili per introdurre resistenza a stressabiotici:

• Percezione/Trasmissione del segnale cellulare

• Controllo della trascrizione

• Meccanismo di risposta allo stress

Vinocur and Altman, Current opinion in plant biology 16: 123-132

APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHEResistenza a stress abiotici Alcuni esempiPercezione/Trasmissione del segnale cellulareEspressione costitutiva in Zea mays del gene di tabacco MAPKKK/NPK1 coinvolto nella trasmissione del segnale(via della MAP chinasi) attiva la cascata del segnale che determina maggiore tolleranza a stress da freddo, caldo e salinità(Shou et al., 2004).

Meccanismi di risposta allo stressHeat shock Protein

Sovra-espressione del gene HSP101 di Arabidopsis in Oryza sativa determina una migliore performance durante la fase direcupero dallo stress da caldo (Katyar-Agarwal et al., 2003). Sovra-espressione del gene HVA1 (proteina LEA isolata daHordeum vulgare) conferisce in piante di riso transgenico resistenza alla disidratazione cellulare (Chandra Babu et al., 2004).

Detossificazione da specie reattive dell’ossigeno

Sovra-espressione del gene dell’Aldeide deidrogenasi (AtALDH3) in Arabidopsis conferisce resistenza agli stress da siccitàe salinità (Sunkar et al., 2003). Le piante mostrano maggiore tolleranza alla disidratazione e ad altri fattori correlati(sale, metalli pesanti, perossido di idrogeno).

Osmoprotettori

Buoni risultati ottenuti mediante trasformazione di Oryza sativa con gene della Colina deidrogenasi (codA) diArthrobacter globiformis; Il gene codifica per una proteina che catalizza l’ossidazione della colina in glicina-betaina(noto osmoprotettore). Le piante transgeniche recuperano più facilmente in seguito a stress da eccesso di salinità eproducono maggiori quantità di seme rispetto al controllo (Mohanty et al., 2002).



Modificazione della biosintesi dei lipidi e del loro catabolismo

Si dovrà verificare quale sia il fattore limitante per la biosintesi. Gli acidi grassiinsaturi piùimportanti sono l'oleico (18:1), il linoleico (18:2) e il linolenico (18:3)ottenuti per successive desaturazioni dallo stearico (18:0). Le desaturasiresponsabili delle prime due desaturazioni sono state clonate.

Le lipossigenasi rivestono un ruolo importante nel settore alimentare(conservazione e proprietà organolettiche degli alimenti) e anche per la difesacontro patogeni. Le lipossigenasi catalizzano la idroperossidazione degli acidigrassi polinsaturi. I geni di varie lipossigenasi sono stati clonati.



Modificazione della biosintesi dei carboidratiUn gene mutato di E. coli che codifica per


una alterata ADP-glucosopirofosforilasi trasferito in patata ha aumentato il livellodell'amido, risultato importante da un punto di vista commerciale (il tubero haun contenuto basso di amido) e della qualità di certi prodotti (es: patate cheassorbono meno olio durante la frittura).

In riso e mais si puo’ manipolare la composizione in amido dell’endosperma. Inriso, si ha ca. il 15-30% di amilosio e il 70-85% di amilopectina. Da un mutanteincapace di produrre amilosio si è isolato il gene waxy.Manipolando opportunamente questo gene ed inserendolo in altri cerealisi puo’ quindi alterare il rapporto tra amilosio ed amilopectina.

Sono stati isolati geni batterici per la produzione di carboidrati chepermettono l’ottenimento di polimeri particolari che, pur presentandocaratteristiche simili alla plastica, risultano più facilmente biodegradabili.

APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHEModifica dei nutrientiIl golden RiceLa carenza di Vitamina A può causare gravi danni danno all’apparato visivo e causa elevato grado dimortalità infantile. A livello globale, ca. il 21 % dei bambini soffre di carenza da Vitamina A (Sommer, 2001).Ca. 800.000 decessi di bambini e donne in gravidanza sono causate da deficienza nella dieta di VitaminaA. Una possibilità è sovra esprimere I precursori della Vitamina in una coltura povera IL RISO.

L’endosperma del seme di riso manca di provitaminaA. E’ stato quindi prodotto riso transgenico contenete4 geni isolati da Narcissus e Erwinia. Sono state ottenute linee stabili di riso che contengono grandi quantità diVitamina A e conferiscono al seme una colorazione dorata.


Una varietà di Golden Mustardè stata recentementesviluppata e la tecnologiasembra promettente per moltealtre colture..

Figura 19.48Melanzana partenocarpica (foto: A. Spena).



Figura 19.50Fiore wild-type (A) e del mutante partenocarpico di pomodoropat-2 (B, notare l’accrescimento precoce dell’ovario),Bacche wild-type (C)e del mutante pat-2 (D, notare l’assenza di seme)(foto: P. Mosconi).



OGM di seconda e terza generazione

• OGM con maggiore contenuto in:• antiossidanti• aminoacidi essenziali• vitamine• ferro• omega-3• micronutrienti

• un diverso profilo di acidi grassi• anticorpi per uso diagnostico o terapeutico

(es. per antigeni tumorali)• antigeni (es. per la vaccinazione)• proteine ricombinanti di interesse terapeutico

(es. emoglobina, lattoferrina, insulina)

• OGM che producono:

High provitamin A corn; 100-200 g of grain provide full RDI of β -carotene (as a sole source of vitamin A)

Courtesy of Paul Christou

APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHEMolecular pharming

Produzione di Vaccini/Anticorpi:

ProblemaPer la produzione di Vaccini su larga scala spesso le cellule di mammifero sono difficili da gestire e siottengono basse quantità mentre le cellule batteriche spesso non sintetizzano la proteina nellasua corretta conformazione nativa.


Quindi ?In pianta è possibile produrre vaccini o anticorpi

nella forma nativa in grandi quantità. E’ anchepossibile alimentare direttamente animali e/o

uomo con la pianta modificata

PRODUZIONE DI ANTICORPI PRODUZIONE DI ANTIGENI

APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHEProduzione di Vaccini: Alcuni esempi di utilizzo del transgenico per la produzione di vaccini in pianta


Daniell et al., Trends Plant Sci. 2009 December; 14(12): 669–679.

Antigeni Batterici

Enterotoxigenic E. coli Heat-labile toxin B subunit (LTB) Carrots Immunogenic and protective against CT challenge

Soybean Immunogenic and partial protection against LT challenge in miceCholera toxin B subunit (CTB) Tomato Immunogenic by oral delivery to mice

Rice Immunogenic and protective against CT challenge to mice following oral administration

Antigeni ViraliHepatistis B virus surface antigen Potato Immunogenic response in humans following oral administration

Hepatitis B virus surface antigen fused with preS1 epitop Rice Immunogenic by intraperitoneal delivery to mice

Human group A rotavirus (VP6) protein Alflfa Immunogenic in mice and offspring developed less severe diarrhea after challenge with simian rotavirus SA-11, indicating that antibodies generated in the dams provided passive heterotypic protection to the pups

Rotavirus (VP7) Potato tubers Immunogenic in mice following oral delivery. Neutralization activity against rotavirus

Norwalk virus capsid protein Tomato Fruit and Potato

Elicit systemic and mucosal antibody responses in mice following oral administration

SARS-CoV S protein (S1) Tomato and tobacco leaf

Immunogenic to mice following oral administration

Smallpox recombinant vaccine virus B5 antigenic domain (pB5)

Tobacco and Collard leaf

Antibody response in mice immunized parenterally and protects against lethal dose of vaccinia virus

Japanese encephalitis virus (JEV) envelope protein (E) Rice JEV specific neutralizing antibody detected in mice following intraperitoneal or oral administration

APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHEProduzione di Vaccini: Alcuni esempi di utilizzo del transgenico per la produzione di vaccini in pianta


Daniell et al., Trends Plant Sci. 2009 December; 14(12): 669–679.

Antigeni BattericiPlasmodium yoelii merozoite surface protein (PyMSP4/5) Tobacco Induces antigen-specific antibodies in mice following parenteral

delivery

Human vaccines (Viral/Transient expression)

Bacterial antigens

Yersinia pestis F1 and LcrV antigens Tobacco leaf tissue Immunogenic and protective in monkeys against Y. pestis following subcutaneous injection

Yersinia pestis F1-V antigens Tobacco leaf Immunogenic and protection in vaccinated guinea pigs againstY. pestis aerosol challenge

Antigeni ViraliSmallpox recombinant vaccine virus B5 antigenic domain (pB5)

Tobacco leaf Antibody response in mice immunized perenterally and protective against lethal dose of vaccinia virus

Encoding domain III of the dengue 2 envelope protein(D2EIII)

Tobacco Retains antigenicity and immunogenicity as well as inducingneutralizing antibodies in vaccinated animals.

HIV entry inhibitors red algal protein griffithsin (GRFT) Tobacco (TMV) Active against HIV at picomolar concentrations, directly virucidal via binding to HIV envelope glycoproteins and capable of blocking cell-to-cell HIV transmission

Pathogenic avian influenza virus (H5N1 subtype) Tobacco Immunogenic in mice and ferret and also protects ferretsagainst challenge infection with virus

Produzione su larga scala di anticorpi per uso terapeutico e diagnostico.L’iniezione di anticorpi diretti ad antigeni di superficie è una dellepossibili strategie per la lotta alle cellule cancerogene; in questo caso sonorichieste quantità elevate di anticorpo.

La sintesi di anticorpi in organismi ricombinanti richiede la sintesi didue proteine e quindi l’espressione di due geni. Il metodo risulta efficacesolo per proteine di peso molecolare inferiore a 20.000 e che possonouscire dalla parete cellulare. Per le sue rilevanti dimensioni, l’anticorpo nonpuo’ uscire dalla cellula.

APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHEProduzione di Anticorpi


Ko et al.,Virus research. 2005 111: 93-100.

Differenti tipologie di proteine anticorpali prodotte in pianta

Pianta Tipologia di Ab (target) Obiettivo Referenza

Tobacco IgG (nematode) Plant pathogen resistance Baum et al. (1996)

Tobacco sIgA/G (Streptococcus mutans) Therapeutic (topical) Ma et al. (1998)

Soybean, rice IgG (herpes simplex virus) Therapeutic (topical) Zeitlin et al. (1998)

Tobacco IgG (colon cancer) Therapeutic (systemic injection) Verch et al. (1998)

Alfalfa IgG (human IgG) Diagnostic Khoudi et al. (1999)

Tobacco IgG (rabies virus) Therapeutic: first IgG expressed in plant showing therapeutic activity (systemic injection)

Ko et al. (2003)

Tobacco IgG (hepatitis B virus) Immunopurification of hepatitis B surface antigen

Valdes et al. (2003)

Tobacco IgG (hepatitis B virus) Therapeutic Yano et al. (2004)

Figura 19.53Costi per grammodi immunoglobulina A prodotta con diversi sistemi di espressione.

PRODUZIONE DI ANTICORPI (IMMUNOGLOBULINE) NELLE PIANTE

PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E VACCINIMEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE

64


RNA InterferenceMediante questa tecnica si cerca di ridurre notevolmente l’espressione di ungene la cui normale espressione risulta negativa ai fini produttivi e/o diconservazione del prodotto.

Effetto scoperto per la prima volta in petunia


Formazione di una molecola a doppio filamento tra sequenze complementari diRNA "antisenso" e di mRNA "senso" del gene di cui si vuole sopprimere l'azione.

Si può inserire una sola porzione del gene da silenziare o il gene per intero.

L'RNA antisenso può interferire con la trascrizione, lo splicing, la traduzione delmRNA senso o rendendo quest'ultimo, a seguito della loro unione, più sensibile alladegradazione; quest’ultima sembra essere l'ipotesi più probabile.

65


Ha avuto nella storia differenti nomi (Co-soppressione; RNA interference; RNA antisenso; Post-trascriptional-gene-silencing) ma il meccanismo di base è simile:

La riduzione del trascritto originale sembra avvenire a

diversi livelli

Modificazione della cromatina a livello istonico e inibizione della trascrizione

Legame con mRNA e creazionedi un complesso non accessibileper la traduzione.

Legame con mRNA e degradazione a carico della Dicer protein.



siRNA Small interfering RNA (21-24 nt). Originano da acidi nucleici aberrantio patogeni e agiscono in cis inattivando la stessa molecola da cui sonostati prodotti (meccanismo di difesa della pianta).

Virus-Induced-Gene-SilencingVIGS

La tecnologia sfrutta il sistema di difesa RNA-mediato che la pianta attiva contro virus patogeni.

Vettori virali trasformati con geni dell’ospite quando inseriti in quest’ultimo determinano una riduzione transiente dell’espressione dei geni stessi.

Esempio in H. vulgare (BSMV mediated silencing):•Genoma tripartitico (α,β,γ). Il genoma β è disarmato per impedire la formazione del capside e nel genoma γ è inserito il gene da silenziare (GOI)•I tre genomi vengono mescolati in rapporto (1:1:1)•Inoculati direttamente in foglia o all’apice della pianta fino alla formazione dei sintomi del mosaico•Verifica del silenziamento genico dopo poche settimane.

Int J Plant Genomics. 2009. Published online 2009 June 15

VANTAGGI:Semplice, economico, rapido e in grado di superare ridondanza funzionale.SVANTAGGI:Il gene non è mai completamente silenziato, alterazioni fenotipiche dovute al genoma ospite, off-targets, espressione transiente

Figura 19.46(A)Strategia antisenso: la trasformazione di piante con geni aventi un orientamento inverso rispetto alle regioni di regolazione determina il blocco della espressione del corrispondente gene endogeno.(B)Pomodori transgenici e prodotto commerciale americano a base di pomodori transgenici.


B


TRASFORMAZIONE GENETICA COME STRUMENTOPER LO STUDIO DELLA FUNZIONE GENICA

miRNAMicro RNA (21-22 nt). Originano da geni regolatori endogeni e agiscono in

trans silenziando geni specifici con sequenze omologhe (sistemadi regolazione della pianta).

artificial micro RNA: amiRNA

Trasformazione con miRNA artificiale progettati apartire da un pre-miRNA endogeno in cui laregione che determina la specificità vienesostituita con un porzione del gene target.

Il gene viene trascritto da RNA pol II, tagliatodall’enzima Dicer-like1 e indirizzato mediante ilcomplesso AGO/RISC al gene target per ilsilenziamento in maniera altamente specifica

VANTAGGI:Alta specificità e assenza di off-targets, espressione più stabile rispetto a VIGS,possibilità di progettare costrutti con diversi target, non genera effetti secondari dovuti algenoma virale.

SVANTAGGI:Il gene non è mai completamente silenziato, più complesso e laborioso rispetto a VIGS.

69


Un settore di elevato interesse è la regolazione della maturazione dei frutti in cui si abbia degradazione enzimatica delle pareti cellulari a seguito dell'azione della poligalatturonidasi (gene pg). La pg è sintetizzata durante la maturazione.In pomodoro, un frammento 5' di 730 bp del clone pg cDNA è stato clonato in senso inverso sotto controllo di CaMV35S. In una pianta così trasformata, il livello di pg risultava ridotto al 6%. L'espressione del gene antisenso non ha influenzato l'espressione di altri geni coinvolti nel processo di maturazione.

La tecnica dell'antisenso ha permesso di:saggiare la funzione di specifici geni

identificare geni a funzione sconosciuta

ottenere piante con nuove caratteristiche


• ridotta espressione della subunità piccola della rubisco• ridotta espressione di una proteina a 10 kda coinvolta nel fotosistema ii• modifica del colore in fiori di petunia e gerbera• modifica del processo di maturazione in pomodoro e melone.

PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM):GENE TARGETING

In seguito al taglio il gene danneggiato viene sostituitocon un gene di nostra progettazione: possiamointrodurre qualunque tipo di modifica.

N.B. dobbiamo fornire mediantetrasformazione genetica il gene da noi progettato(Repair Target) per la sostituzione mediante HR

In seguito al taglio le due estremità vengono ricongiuntee si creano mutazioni di frameshift quindi solo mutazioniknock-out.

• Non-Homologous-End-Joining (NHEJ):Le due estremità del genedanneggiato vengono semplicemente unitecon perdita o inserimento di alcune coppie dibasi.

Tecnologie che consentono di introdurre alterazioni mirate a specifiche sequenzeall’interno del genoma ospite senza alterarne il background genetico

Sfruttano i normali meccanismi di riparazione dellecellule eucariote dei tagli a doppio filamento nel DNA:

•Homologous Recombination (HR): Il gene compromesso viene sostituito per ricombinazionecon una sequenza omologa non-danneggiata.

NHEJ

HR HR + NHEJ

Problemi irrisolti• Scarsi gli investimenti a livello nazionale • Predominio del settore privato• Scarsa accettazione dei prodotti GM• Disinformazione su effettivi rischi e

benefici dei prodotti GM• Eccesso di regolamentazione (OGM)• Carenza di una comunicazione appropriata

Conclusioni

• La genomica e l’ingegneria genetica offrono molteplici opportunità per migliorare la resa e sostenibilità della produzione agricola e migliorare il profilo nutrizionale e la salubrità degli alimenti.

• Per gli OGM, solo una corretta informazione ed una politica meno restrittiva potranno incentivare adeguatamente la ricerca e le sue applicazioni; l’accettazione pubblica svolgerà un ruolo fondamentale.

• Il persistere di una ingiustificata penalizzazione verso le colture GM e le limitazioni alla ricerca contribuiscono ad aumentare ulteriormente il divario tecnologico dell’Italia nei confronti di molte altre nazioni.

• Le biotecnologie delle piante agrarie avranno un ruolo di crescente rilevanza per la competitività e la sostenibilità della filiera agro-alimentare, per la produzione di biomasse e la salubrità delle derrate alimentari.

PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA · METODI DI TRASFORMAZIONE...

Documents

Transcript of PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA · METODI DI TRASFORMAZIONE...