Pastoris micotox 27-03-13

Le micotossine nella filiera vitivinicola

Prof. Ornella Pastoris

Università degli Studi di Pavia

Centro RiccagioiaTorrazza Coste, 27 marzo 2013

Micotossine

I funghi filamentosi microscopici, comunemente noti come muffe, possono svilupparsi su una grande quantità di derrate alimentari ed in particolari condizioni ambientali e di conservazione

In particolari condizioni di squilibrio nutrizionale la muffa può attivare vie metaboliche secondarie che portano alla formazione di micotossine

Alimento con muffapotrebbe non contenere micotossineAlimento integro potrebbe contenere micotossine

Funghi patogeni nell’uva

Erysiphe necator

Plasmopara viticola

Alternaria spp

Aspergillus spp

Botrytis cinerea

Cladosporium spp

Penicillium spp

Rhizopus spp

A. flavus e A. parasiticus aflatossine

ritrovate nell’uva solo occasionalmente

Micotossine nell’uva

Ocratossina A

Fumonisine

Ocratossina A (OTA)

• Comunemente presente in cereali, uva, caffè, spezie, cacao

• Individuata nell’uva e nel vino per la prima volta nel 1996

• Prodotta da Aspergillus spp. e Penicillium spp.

• Nei cereali i principali produttori sono P. verrucosum e A. ochraceus

Ocratossina A (OTA)

• Nell’uva l’OTA viene prodotta principalmente da A. niger e da A. carbonarius

• 70-100% dei ceppi di A. carbonarius e 2-20% di A. niger che contaminano l’uva sono produttori di OTA

• Gli Aspergilli in vitro degradano l’OTA prodotta ricavando una serie di composti che probabilmente favoriscono la crescita del fungo

• OTA può essere presente anche se non si rileva la presenza di specie ocratossigene

• La presenza di muffe sull’acino non implica contaminazione da OTA

Ocratossina A (OTA)

Il problema della contaminazione del vino nasce nelle vigne

Durante la lavorazione l’alcol inibisce la formazione di micotossine

L’OTA è prodotta principalmente quando A. carbonarius infetta gli acini prima del raccolto

Effetti di OTA sulla salute

• Nefrotossica (danni dipendenti da dose ed esposizione)

• Immunotossica

• Teratogena

• Cancerogena (gruppo 2B, IARC 1993)

Lunga emivitaMaiale: 70-120 ore

Pollo: 4 ore

Uomo: 840 ore

Presente anche in prodotti di origine animale destinati

all’alimentazione umana

TWI120 ng/kg di peso corporeo

(Efsa, 2006)

Livelli di esposizione15-60 ng/kg di peso

corporeo alla settimana

OTA nell’uva e nel vino

• Clima (temperatura e umidità)

• Zona geografica (latitudine)

• Annata di produzione

• Fattori legati alla vinificazione

La presenza di OTA nell’uva e nel vino è influenzata da numerosi fattori:

Livelli massimi di OTA ammessi in succo d’uva, mosto e vino

2 µg/kg (Regolamento CE n. 123/2005)

Effetto del clima

Temperatura ed umidità sono fattori fondamentali che influenzano la crescita fungina e la produzione di micotossine:

la conoscenza di come tali fattori possono favorire la produzione di OTA è di grandissima importanza per poter prevedere e quindi prevenire eventuali contaminazioni

Condizioni ottimali di crescita fungina

Specie T aw

A. carbonarius 30°C 0.97

A. niger 35°C 0.98

Leong et al., Int J Food Microbiol. 2006; 110: 209-216

Effetto della temperatura

Leong et al., Int J Food Microbiol. 2006; 110: 209-216

La temperatura ottimale per la produzione di OTA è di 15-20°C

Effetto dell’umidità

Leong et al., Int J Food Microbiol 2006; 110: 209-216

I valori ottimali di aw per la produzione di OTA sono molto simili a quelli che favoriscono la crescita fungina

Effetto della latitudine

I vini dei Paesi più meridionali sono in genere più contaminati come conseguenza del clima più caldo e secco

Valero et al., Food Chemistry 2008; 108: 593–599

CII 15% > 2µg/l

CIII 27% > 2µg/l

Annata di produzione

L’annata – come conseguenza del clima e della presenza di fenomeni metereologici – può influenzare la presenza di OTA nelle uve

Lucchetta et al., Toxins 2010; 2: 840-855

Lopez De Cerain et al., Food Addit Contam 2002; 11:1058–1064

Fattori legati alla coltivazione

Varietà di uva, grado di maturazione, danni fisici agli acini possono favorirne il deterioramento e la crescita di funghi ocratossigeni

La presenza di danni sulla buccia dell’acino favorisce la penetrazione del fungo all’interno


La fase di maturazione e l’esposizione a raggi UV influenzano il grado di contaminazione dell’uva

Leong et al., Int J Food Microbiol 2006; 111: S83-S87


La presenza di danni alla buccia degli acini favorisce l’infezione da A. carbonarius

De Curtis et al., Int J Food Microbiol 2012; 159: 17-24

Fattori legati al tipo di vinificazione

Pur non essendoci differenze di contenuto di OTA tra uva bianca e nera, il contenuto di micotossina nei vini rossi è superiore rispetto agli altri vini

Brera et al., J Agric Food Chem 2008; 56: 10611–10618


• Il processo di vinificazione può svolgere un ruolo importante nel determinare il contenuto finale di OTA nel vino

• È fondamentale conoscere i passaggi critici che influenzano tale contaminazione allo scopo di poter tener sotto controllo i livelli di OTA durante tutto il processo di lavorazione

• La maggior parte dell’OTA originariamente presente nell’uva rimane legata alle fecce e con esse viene eliminata


Livelli di OTA nel vino

Livelli di OTA negli scarti di lavorazione

Fernandes et al., Am J Enol Vitic 2007; 58: 92-96

AF = Fermentazione alcolica

MLF = Fermentazione malolattica


• In seguito alla pigiatura, quando le bucce rimangono a contatto con il mosto, può esserci un aumento di OTA, che poi diminuisce nei passaggi successivi

• Durante la macerazione per la produzione dei vini rossi il contatto tra bucce e succo può determinare un aumento di OTA in quest’ultimo stimato intorno al 20%


Il processo di vinificazione porta ad una riduzione dei livelli di OTA nel vino. Una ulteriore riduzione (fino al 17%) si può avere anche durante l’invecchiamento

Grazioli et al., Int J Food Microbiol 2006; 111: S93-S96


I livelli di OTA variano anche in funzione della qualità del vino, sebbene non ci sia correlazione tra il prezzo ed il grado di contaminazione


L’importanza della campionatura

• È fondamentale conoscere le zone maggiormente soggette all’attacco dei funghi ocratossigeni allo scopo di effettuare una corretta campionatura per verificare una eventuale contaminazione prima della vendemmia

Raccogliere campioni a intervalli regolari lungo un percorso prestabilito

• Non c’è relazione tra il contenuto di OTA e la posizione di un grappolo sul ramo o la localizzazione della pianta nel vigneto

I risultati migliori si ottengono campionando, in una posizione predefinita, un grappolo per ogni pianta da almeno dieci piante

Aspergillus spp nelle uve italiane

Le uve del nord sono complessivamente più contaminate (~82%)

A. carbonarius è virtualmente assente nei campioni provenienti dal nord, mentre è presente (~10%) nelle uve del sud


OTA nelle uve italiane

Il 30.4% dei campioni risulta contaminato con una considerevole differenza legata all’area geografica di provenienza

Il 24% dei vini del sud Italia ha livelli di OTA>0.02 µg/l, mentre il 4.5% supera il limite imposto dalla CE di 2 µg/l


Contaminazione delle uve italiane

• Non c’è una correlazione significativa tra la presenza di Aspergilli totali e contaminazione da OTA

• Nelle regioni del nord e del centro la presenza di alti livelli di funghi non necessariamente implica la presenza anche di OTA

• Esiste una correlazione positiva tra presenza di A. carbonarius e contaminazione da OTA

OTA nei vini italiani

La regione di origine del vino, come conseguenza diretta del diverso clima, influenza il contenuto di OTA


OTA nei vini italiani

Piemonte3 ng/l

Lombardia15 ng/l

Triveneto43 ng/l

Romagna 115 ng/l

Marche 25 ng/l

Abruzzo 195 ng/l

Puglia 1302 ng/l

Sicilia 1366 ng/l

Toscana 498 ng/l

Emilia 17 ng/l

Considerando solo i vini rossi si crea un gradiente dei livelli di OTA da nord a sud lungo il versante adriatico

Pietri et al., Food Addit Contam 2001; 18: 647-654

Esposizione della popolazione italiana

Sebbene i cereali siano considerati la maggior fonte di esposizione ad OTA, recenti studi hanno sottolineato l’importante contributo apportato dal vino (in particolare dai vini rossi)

Miraglia e Brera, 2002

Esposizione della popolazione italiana

L’assunzione quotidiana di OTA con il vino varia considerevolmente a seconda del consumo, del tipo di vino e dell’area geografica

Brera et al., J Agric Food Chem 2008; 56: 10611–10618TDI = 17.1 ng/kg

Come minimizzare il rischio di contaminazione

Minimizzare il danno agli acini sulla vite è uno degli elementi chiave per ridurre il rischio di contaminazione da OTA

• tenere sotto controllo gli eventuali danni agli acini causati da funghi o da muffe patogene tramite l’utilizzo di fungicidi

• tenere sotto controllo i danni causati da insetti utilizzando insetticidi

• sfruttare pergolati e la potatura in modo che i grappoli abbiano una adeguata esposizione al sole, non rimangano impigliati nei fili dei tralicci ed abbiano spazio a disposizione

• controllare le tempistiche di irrigazione per ridurre il rischio di rottura degli acini in caso di pioggia prima del raccolto

Come minimizzare il rischio di contaminazione

• Strumenti che permettono di prevedere le regioni viticole a rischio di contaminazione da OTA e che sfruttano modelli che tengono conto delle temperature e delle precipitazioni stagionali

• Raccolta di campioni nei vigneti sa sottoporre ad analisi microbiologiche

• Applicazione dei metodi di controllo della contaminazione da Aspergillus spp

Controllo chimico (fungicidi)

Controllo biologico (lieviti, agenti di biocontrollo)

Controllo chimico della produzione di OTA

I fungicidi possono sia ridurre che favorire (a seconda anche della temperatura) l’infezione dell’uva da parte di A. carbonarius

Bellì et al., Food Addit Contam 2006; 23: 1021-1029

Controllo chimico della produzione di OTA

I fungicidi che inibiscono le infezioni degli acini riducono anche il contenuto di OTA nelle uve

Bellì et al., Food Addit Contam 2006; 23: 1021-1029

Trans-resveratrolo

• Il trans-resveratrolo (3,5,4-triidrostilbene) è un composto antiossidante naturale che si accumula nelle foglie e nella buccia degli acini in risposta a danni di varia natura (infezioni fungine, radiazioni UV, danni chimici…)

• Si può trovare anche nel vino in concentrazione variabile in funzione dei processi viticoli ed enologici

• Ha proprietà di pesticida naturale

Trans-resveratrolo

Nei vini rossi esiste una correlazione positiva tra contenuto di OTA, stilbeni totali e trans-resveratrolo, il che suggerisce che la produzione di OTA stimoli la sintesi sia di stilbeni che di trans-resveratrolo

Perrone et al., J Agric Food Chem 2007; 55: 6807-6812

Svantaggi dei fungicidi

• Residui nell’uva dopo la vendemmia e quindi possibile presenza nel vino

• Potenziali effetti nocivi per la salute

• L’uso persistente favorisce la selezione di ceppi resistenti

Necessità di sviluppare metodi di controllo alternativi

Controllo biologico della produzione di OTA

• Utilizza microrganismi (agenti di biocontrollo) antagonisti dei funghi patogeni e rappresenta una buona e promettente alternativa ai pesticidi

• Uno dei vantaggi è che gli agenti di biocontrollo possono essere impiegati insieme ai pesticidi, riducendo quindi i livelli di questi ultimi necessari per tenere sotto controllo la crescita fungina

I lieviti come agenti di biocontrollo

L’azione protettiva dei lieviti è influenzata da temperatura e umidità, ma alle condizioni ideali si osserva una riduzione significativa della crescita del fungo patogeno negli acini pretrattati



I livelli di OTA negli acini pretrattati con lieviti sono significativamente inferiori



L’azione degli agenti di biocontrollo è maggiore se impiegati nella fase di stoccaggio dei frutti, quando cioè le condizioni di temperatura ed umidità possono essere controllate in modo da garantire la massima azione protettrice

L’applicazione degli agenti di biocontrollo prima del raccolto comunque favorisce la colonizzazione della superficie del frutto e delle lacerazioni della buccia aumentando così l’efficacia durante lo stoccaggio

I lieviti epifiti

• Sono i principali costituenti della flora microbica che ricopre la superficie degli acini di uva

• Sono evolutivamente adattati a questa nicchia ecologica

• Possono essere validi agenti di biocontrollo per la loro capacità di colonizzare i grappoli di uva e competere (per spazio e nutrienti) con i funghi patogeni

• Possono sopravvivere e colonizzare gli acini nelle vigne mantenendo l’equilibrio dell’ambiente naturale

I lieviti epifiti

Portano ad una considerevole riduzione della crescita sia di A. carbonarius che di A. niger sugli acini di uva

Bleve et al., Int J Food Microbiol 2006; 108: 204-209

Vantaggi degli agenti di biocontrollo

• Non influenzano le caratteristiche organolettiche dell’uva

• Uno dei normali passaggi nella produzione del vino consiste nell’aggiunta di anidride solforosa (antiossidante, conservante e antisettico), che porta anche alla neutralizzazione dei lieviti per evitare che entrino in competizione con i lieviti che vengono aggiunti nei processi di fermentazione alcolica

• Con la svinatura si separa il vino dalle vinacce ed altri elementi solidi comprendenti anche i residui degli stessi lieviti

Interventi durante la vinificazione

I principali elementi che riducono i rischio di contaminazione durante e dopo la raccolta:

• selezione dell’uva e raccolta in modo da minimizzare i danni agli acini e ridurre la perdita di succhi durante il trasporto

• rapido trasporto alla cantina

• conservazione a bassa temperatura dell’uva raccolta

• corretta condotta igienica nella cantina


Durante la fermentazione alcolica l’OTA viene adsorbita da mannoproteine presenti sulla parete dei lieviti e quindi “sottratta” al vino

Selezionare ceppi di lievito la cui parete abbia una composizione proteica che garantisca elevata capacità di adsorbire l’OTA

Agenti raffinanti (es. carbone vegetale) rimuovono l’OTA dal vino, ma compromettono la qualità del prodotto finale

Agenti proteici (es. albumina) e la bentonite legano l’OTA, ma la loro efficacia può dipendere dalla presenza di altre proteina nell’uva


In base alle norme generali di salvaguardia della salute e alle direttive comunitarie, tutte le aziende del settore alimentare – e quindi anche le cantine che producono vino – devono mettere a

punto dei sistemi di autocontrollo basati sulle norme HACCP

Individuare i punti critici di controllo, ossia quei passaggi della lavorazione in cui il rischio di contaminazione è maggiore ed in cui

vanno quindi concentrate le analisi di controllo

Nei processi di vinificazione i punti critici di controllo per monitorare i livelli di OTA sono la pigiatura e la fermentazione alcolica. Al termine di questi passaggi è quindi buona norma

effettuare dei prelievi per opportune analisi

Fumonisine (FB)

• Micotossine cancerogene prodotte da Fusarium Verticillioides e da altre Fusarium spp

• FB1, FB2 e FB3 sono cancerogene. FB2 è la più citotossica

• FB2 è stata ritrovata in varie piante e prodotti di origine vegetale, soprattutto nel mais e derivati, nella birra e negli asparagi

• In Europa il limite massimo di FB totali ammesso nei prodotti a base di mais è di 0.2-2 µg/g

Fumonisina B2 (FB2)

È prodotta anche da A. niger: l’80% dei ceppi noti produce FB2; il 17% produce OTA; il 10% produce FB2+OTA

A. niger produce anche FB4 ed FB6, ma non FB1

Poiché A. niger infetta frequentemente l’uva, il rischio di contaminazione dei prodotti vitivinicoli con FB è elevato

Problema recenteRicerca PubMed“ochratoxin A + wine” 222 articoli dal 1996“fumonisin + wine” 16 articoli dal 2006

Frisvad et al., J Agric Food Chem 2007; 55: 9727-9732

FB2 nei vini italiani

In uno studio su 51 vini italiani è risultato che 9 (pari al 17.6%) contenevano FB2 (0.4-2.4 ng/ml)

200 ml

2.9 ng/kg

PMTDI = 2 µg/kg

Logrieco et al., Food Addit Contam 2010; 27: 1136-1141

Il vino, da solo, non rappresenta un rischio, ma insieme ad altre fonti può contribuire al raggiungimento della PMTDI

70 kg

FB2 nei vini rossi

I vini rossi sono più contaminati dei vini bianchi, mentre non c’è relazione tra contenuto di FB2 e la regione di provenienza o l’annata del vino

Mogensen et al., J Agric Food Chem 2010; 58: 4853-4857

Conclusioni I

• La contaminazione da micotossine nel vino rappresenta un rischio concreto

• L’OTA è presente maggiormente nei vini rossi delle aree geografiche più meridionali

• L’esposizione ad OTA dovuta al vino è molto inferiore alla TDI, ma può comunque contribuire al raggiungimento di tale limite se si assumono altri alimenti contaminati

Conclusioni II

• Esistono mezzi preventivi e di controllo per minimizzare il rischio di presenza di OTA nei vini

• Recentemente è emerso anche un ruolo delle FB2 nella contaminazione dei prodotti vitivinicoli

Pastoris micotox 27-03-13

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