Papers Diagnosi dell’Infezione da Helicobacter pylori · con metodo epsilometrico (e-test),...

GME - Volume 2 Numero 1 Gennaio 2017

26 Gastroenterology Made Easy 2017; 2: 26-37

Introduzione

Storicamente, si è sempre ritenuto che lo stomaco fosse essenzial-mente sterile grazie al suo ambiente acido. Tuttavia, dopo la scoperta dell’Helicobacter pylori (H. pylori), è divenuto chiaro che lo stomaco ospita una comunità batterica, costituita da centinaia di fila. Infatti, sebbene valori di pH<4 siano in grado di prevenire la sovracrescita batterica, l’ambiente acido non è sufficiente a sterilizzare lo stomaco, la cui densità microbica è compresa da 101 e 103 CFU/g [1].

L’H. pylori è un batterio Gram-negativo ubiquitario, che infetta cir-ca la metà della popolazione mondiale il cui principale serbatoio è lo stomaco umano. La colonizzazione dello stomaco da parte di H. pylori avviene generalmente nel corso della prima decade di vita e, in assenza di terapia antibiotica, l’infezione persiste per tutta la vita. Il microrganismo possiede delle caratteristiche microbiologiche uni-che che gli consentono di sopravvivere in condizioni estremamente avverse, come l’ambiente acido gastrico [2].

La trasmissione dell’infezione avviene principalmente per via oro-fe-cale, in particolare attraverso acque e alimenti contaminati. Infatti, i tassi di prevalenza di infezione sono molto più alti nei Paesi in via di sviluppo e con scarse condizioni socio-economiche. E’ inoltre pos-sibile la trasmissione oro-orale, come dimostrato dall’isolamento del batterio nella saliva e nella placca dentaria. Una volta penetrato nel-lo stomaco dell’ospite, l’H. pylori trasforma l’urea, presente nel succo gastrico, in NH3 e CO2 grazie alla sua attività enzimatica intrinseca (ureasi). La NH3 prodotta dall’idrolisi dell’urea viene pompata attiva-

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Indirizzo per la corrispondenza:

Prof. Dino VairaDipartimento di Scienze Mediche e Chirurgiche Università di Bologna, Policlinico Sant’Orsola-MalpighiVia Massarenti, 9 - 40138 Bologna Tel/Fax: +39 051 2144140 E-mail: [email protected]

Abbreviazioni: IPP: inibitori di pompa protonica; FANS: farmaci antinfiammatori non steroidei; PCR: polymerase chain reaction; 13C UBT: 13C urea breath test; HpSA: Helico-bacter pylori stool antigen test

Parole chiave: infezione da Helicobacter pylori - Urea breath test - Test fecale

Conflitti di interesse: nessuno

Diagnosi dell’ Infezione da Helicobacter pyloriGiulia Fiorini 1, Ilaria Maria Saracino 1, Carmelo Scarpignato 2, Dino Vaira 1

1 Dipartimento di Scienze Mediche e Chirurgiche, DIMEC, Policlinico S. Orsola-Malpighi Alma Mater Studiorum, Bologna2 Laboratorio di Farmacologia Clinica, Dipartimento di Medicina & Chirurgia, Università di Parma

RiassuntoL’infezione da Helicobacter pylori interes-sa più della metà della popolazione mon-diale ed è la principale causa di ulcera peptica, gastrite cronica e cancro gastrico. Test diagnostici accurati sono necessari per rilevare la presenza dell’infezione e determinare il corretto management pre- e post-eradicazione. Tutti i test utilizzati presentano differenti sensibilità e speci-ficità, per questo motivo le Linee Guida Europee raccomandano l’utilizzo di alme-no due test. Questi ultimi si dividono in invasivi (endoscopia con biopsia, relativo esame istologico, colturale e test rapido all’ureasi su campione bioptico) e non in-vasivi (urea breath test, test fecale e sie-rologia). L’utilizzo di metodiche invasive è limitato a pazienti selezionati, nei quali l’esame endoscopico si impone per la pre-senza di sintomi di allarme. Per diagnosti-care l’infezione in maniera non invasiva, le uniche due metodiche che consentono di avere dei valori di sensibilità e specificità > 90% sono rappresentate dal 13C-urea breath test e dalla ricerca dell’antigene fe-cale con anticorpi monoclonali. Nuovi test diagnostici (come il dosaggio degli anti-corpi urinari o la cosiddetta endoscopia chimica) potranno rappresentare promet-tenti metodiche alternative.


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mente nello spazio peri-plasmico del corpo batte-rico contribuendo alla creazione di un pH alcalino, che permette la sopravvivenza del batterio in un ambiente altamente ostile. Grazie ai flagelli polari (Figura 1), l’H. pylori si trasferisce nella sua nic-chia ecologica rappresentata dallo strato di muco (e bicarbonato), che ricopre l’epitelio di superficie a livello dell’antro gastrico. In tale sede si realizza-

no condizioni di micro-anaerobiosi favorevoli alla sopravvivenza del batterio che, in fasi successive, prende stretto contatto con le cellule ospiti, dalla quali trae le sostanze nutrienti necessarie alla sua sussistenza ed alla definitiva colonizzazione dello stomaco. Una volta colonizzato lo stomaco dell’o-spite, l’H. pylori contribuisce, anche attraverso l’in-duzione di una risposta infiammatoria, a profon-de modificazioni della omeostasi gastrica sia per quanto riguarda la regolazione della secrezione acida che per quanto concerne la regolazione del ciclo cellulare e della morte cellulare programmata (apoptosi) delle cellule epiteliali gastriche (Figura 2). Tali modificazioni, sono in parte responsabili della diversa evoluzione anatomo-clinica della in-fezione stessa [2].

Diagnosi dell’infezione da H. Pylori: Quali Test e Quando

Le infezioni da H. pylori e da Streptococco mutans, il principale agente cariogeno, sono probabilmente le più comuni e diffuse patologie croniche infettive dell’essere umano [3, 4]. Il riconoscimento di una così vasta diffusione e la comprensione del suo

Figura 1 - Helicobacter pylori: immagine al microscopio elettronico a scansione. Batterio con aspetto elicoidale, fornito di 2-7 flagelli terminanti a clava o a bulbo (con ele-vata mobilità), situati in sede mono-polare. In condizioni ostili, il microrganismo assume una forma coccoide, che gli conferisce proprietà di resistenza sia nello stomaco che nell’ambiente

Sedi dell’azione di vacA:• Membrana citoplasmatica• Endosomi tardivi• Mitocondri

Cellule target di vacA:• Cellule gastriche epiteliali• Linfociti T

VacA Adesine

CagA

CagA-P

EffettiCagA-indipendenti

Figura 2 - L’H. pylori penetra attraverso lo strato mucoso dello stomaco e aderisce (con il concorso di proteine della parete, chiamate adesine) alla superficie delle cellule epiteliali. Si instaura quindi l’infezione, i cui effetti deleteri (danno ed infiammazione) sulla mucosa vengono esercitati ad opera di fattori di virulenza batterici (come la citotossina vacuolizzante VacA e la citochina CagA). Altri fattori sono rappresentati dagli enzimi extracellulari che favoriscono la colonizzazione (proteasi e fosfolipasi) e dai prodotti del metabolismo batterico quali i lipopo-lisaccaridi, i prodotti di degradazione dell’ureasi (ammoniaca) e altre sostanze pro-infiammatorie, che possono essere coinvolte nel processo di induzione e mantenimento dell’infiammazione. L’H. pylori stimola i macrofagi a produrre TNF, IL-1, IL6, IFNg



ruolo patogenetico nella malattia peptica, nella gastrite cronica e la sua associazione significativa con le neoplasie gastriche, ne ha drammaticamen-te cambiato l’approccio e il management [4]. Negli ultimi anni, diverse sono state le metodiche messe a punto per porre la diagnosi di infezione. I test disponibili sono di due tipi:

● invasivi, ovvero test, che necessitano dell’e-same endoscopico per il prelievo di campioni bioptici o contenuto gastrico

● non invasivi, quali la sierologia, l’urea breath test, la ricerca dell’antigene di H. pylori nelle feci [5]

Le metodiche attualmente disponibili hanno dimo-strato di avere una buona affidabilità anche se è ormai divenuto chiaro che nessun singolo test è otti-male. Ciononostante, nella pratica clinica la diagnosi d’infezione è normalmente effettuata con l’utilizzo di un solo test [5]. La scelta dovrebbe essere guidata

dalla clinica, dal likelihood ratio (rapporto di verosi-miglianza) per un test positivo e negativo, dal rap-porto costo-efficacia del test e dalla disponibilità in situ delle diverse metodiche.

Metodiche Invasive

Istologia

L’esame istologico permette di raccogliere informa-zioni sia sulle caratteristiche istologiche del campio-ne bioptico che sulla presenza del batterio (Figura 3). Sebbene la sensibilità dell’istologia sia general-mente alta, essa può essere inficiata dal sito e dal numero e dimensioni delle biopsie [5, 6]. Vi sono spesso differenze nella densità di colonizzazione nel-le diverse regioni gastriche, che possono essere cau-sa di errori. Sebbene una singola biopsia prelevata dalla piccola curvatura (2-3 cm dal piloro, angulus) dia un risultato positivo in oltre il 90% dei pazienti,

Figura 3 - Esame istologico di biopsie gastriche. A: Presenza di numerosi batteri ricurvi (H. pylori) nel lume di una foveola gastrica (colorazione con ematossilina ed eosina). B: Identificazione di H. pylori aderente alle cellule epiteliali gastriche con immunoistochimica. Questo metodo è particolarmente utile nei pazienti trattati con terapia eradicante, nei quali la densità batterica è generalmente bassa, in pazienti con metaplasia intestinale e per identificare la forma coccoide. C: Biopsia antrale (colorazione con ematossilina ed eosina): gastrite cronica attiva, con infiltrati infiammatori diffusi ed aggregati linfoidi. D: Biopsia antrale: gastrite cronica lieve (inattiva), osservata dopo eradicazione dell’infe-zione da H. pylori

A

C

B

D



la sensibilità può essere migliorata esaminando ulte-riori campioni provenienti dall’antro e dal corpo (due campioni per ciascun sito). Le biopsie provenienti da quest’ultimo sito sono di particolare valore quan-do vi è una diffusa metaplasia intestinale nell’antro (poiché questo tipo di epitelio non è colonizzato dal batterio), o dopo terapia, quando spesso si ha una colonizzazione del corpo ma non dell’antro. Inoltre, piccoli campioni o un cattivo orientamento degli stessi possono contribuire a determinare falsi nega-tivi [6]. L’esame istologico è ampiamente disponibile negli ospedali ma relativamente lento, anche se più rapido rispetto all’esame colturale. È comunque un test costoso. Infatti tutti i test invasivi, che necessi-tano di esame endoscopico, diventano costosi. Un vantaggio offerto da questo esame è la possibilità di archiviare i preparati istologici, permettendo di ef-fettuare, a posteriori, rivalutazioni, anche da parte di esperti esterni alla struttura sanitaria. Poiché gli inibitori di pompa protonica (IPP) e gli H2-antagoni-sti possono determinare dei risultati falsamente ne-gativi, è consigliare la sospensione di ogni farmaco antisecretore almeno due settimane prima dell’ese-cuzione dell’esame endoscopico [5, 6].

Coltura

Le colture di H. pylori sono ottenute da biopsie gastriche, sono ureasi, ossidasi e catalasi positive, e quando esaminate al microscopio le colonie appaiono costituite da bacilli ricurvi Gram-negativi

(Figura 4). Il batterio perde rapidamente vitalità al di fuori dell’ambiente gastrico per cui la coltura deve essere effettuata il prima possibile. Le biopsie pos-sono comunque essere conservate in un medium di trasporto (Stuart’s trasport medium) per 24h a 4°C [7]. Sono stati proposti diversi terreni di coltura, generalmente basati su agar-sangue (Columbia o Brain Heart infusion). L’incubazione deve avvenire in ambiente microaerobico con il 5% di ossigeno e 5-10% di CO2. Le piastre vengono incubate a 37˚C per almeno cinque giorni, anche se alcune colonie possono essere visibili già dopo tre giorni [8]. Seb-bene specifica al 100%, la sensibilità di questo test può essere inficiata da problemi di campionamen-to, ritardo nel trasporto delle biopsie al laboratorio, esposizione di queste o delle colture all’aria, condi-zioni di laboratorio sub-ottimali, ed esperienza del microbiologo [5-7]. Anche in questo caso è neces-sario che il paziente non abbia assunto antibiotici o farmaci antisecretori (soprattutto IPP) nelle ultime due settimane [9]. L’importanza di questo test ri-siede nella possibilità di determinare la sensibilità del microrganismo agli antibiotici (Figura 4). Infatti, negli ultimi anni si è osservato un significativo au-mento dell’antibiotico-resistenza, che influisce in maniera determinante sul tasso di eradicazione delle varie terapie, attualmente in uso [10]. L’utilizzo nella pratica clinica dell’antibiogramma è tuttavia riservato a pazienti selezionati (dopo ripetuti tentativi di eradi-cazione) o a studi epidemiologici, e viene di norma eseguito solo in centri altamente specializzati.

Figura 4 - Coltura e antibiogramma di campioni bioptici. A: Colonie di H. pylori, isolate su terreno agar-brucella, ad-dizionato di sangue. B: Antibiogramma con metodo per diffusione in agar, secondo Kirby-Bauer. C: Antibiogramma con metodo epsilometrico (e-test), variante oggi molto usata del metodo per diffusione. Il test si allestisce inserendo nell’agar una o più strisce di carta bibula rettangolari, contenenti concentrazioni scalari dell’antibiotico di cui si vuole saggiare l’attività. Dopo l’incubazione, si viene ad evidenziare un alone di inibizione a goccia intorno alla parte superiore della striscetta; in particolare, la base della goccia sarà rivolta verso la parte superiore della striscia (quella con maggior concentrazione di antibiotico), mentre la punta della goccia sarà rivolta verso la parte inferiore della striscia (contenente una minor concentrazione di antibiotico). Il confronto dell’ampiezza delle gocce di inibizione tra striscette contenenti diversi antibiotici, associato alla valutazione dei valori standard, permette la rapida identificazione del farmaco più effi-cace verso il batterio

A B C



Test all’ureasi

Poiché l’H. pylori è in grado di produrre notevoli quantità di ureasi, si è cercato di utilizzare la pre-senza di questo enzima come indicatore dell’infe-zione. Il test rapido all’ureasi sfrutta infatti le ele-vate concentrazioni di ureasi presenti all’interno di una biopsia gastrica (colonizzata da H. pylori) per determinare un cambio nel pH di un medium con-tenente urea. L’incremento dell’alcalinità determi-nato dalla produzione di ioni ammonio è valutato attraverso il cambio di colore di un indicatore di pH [5, 6, 11] (Figura 5) (Figura 6). La sensibilità di questo test dipende dal numero di batteri pre-senti (è stato calcolato che almeno 105 organismi sono necessari per ottenere la positività del test) e dallo spessore dello strato di muco presente nella biopsia. Il sito da cui il campione bioptico viene ottenuto può essere influente: una delle zone più “calde” sembra essere la piccola curvatura a livello dell’angulus, nella regione pre-pilorica. La specifi-cità di questo test è normalmente buona. In gene-rale, la sensibilità è compresa fra il 85%-95% e la specificità tra il 95% e il 100% [6]. Il punto forza di questa metodica è rappresentato dalla rapidità della diagnosi d’infezione (poco tempo dopo l’ese-cuzione dell’endoscopia), che permette un altret-tanto rapido trattamento terapeutico [12]. Anche in questo caso è consigliabile la sospensione della

terapia antisecretoria almeno due settimane prima dell’esame.

Tecniche di Biologia Molecolare

Queste tecniche sono normalmente effettuate in centri specializzati e la loro principale applicazione avviene nell’ambito della ricerca. La presenza di H. pylori può essere dimostrata attraverso l’ibridizza-zione in situ, utilizzando dei probes biotinilati con una sensibilità e specificità, rispettivamente del 95% e del 100%. Questa tecnica tuttavia presen-ta diverse difficoltà [6, 7, 13]. L’utilizzo della PCR (polymerase chain reaction degli AA Anglosassoni) è invece più semplice (Figura 7). Questa metodi-ca è stata utilizzata per documentare la presen-za dell’H pylori nelle biopsie gastriche, nel succo gastrico, nella placca dentale e nelle feci [5]. A seconda del tipo di primer utilizzato, la metodica è in grado di rilevare la presenza di 10 - 100 micror-ganismi.

I metodi di amplificazione nucleica sono inoltre uti-lizzati nello studio delle resistenze del batterio ai farmaci [14]. La resistenza del microrganismo alla claritromicina, uno degli antimicrobici maggior-mente utilizzati nei regimi eradicanti, varia tra il 3-20%, a seconda delle zone geografiche conside-rate, sia a livello di nazionale che sovra-nazionale.

Test rapido all’ureasi

Test rapido all’ureasi positivo

(NH2)2 CO + H2OUrea

NH3 + CO2Ammoniaca

Ureasi

pH

Figura 5 - Il test rapido all’ureasi permette di verificare la presenza di Helicobacter pylori attraverso l’aggiunta di frammenti bioptici ad un terreno liquido o substrato solido, contenente urea ed un indicatore di pH. La presenza di attività ureasica nel campione - specifica dell’Helicobacter pylori - catalizza l’idrolisi dell’urea, con formazione di ammoniaca, che determina un aumento del pH e conseguente viraggio di colore dell’indicatore



La polymerase chain reaction (PCR) è una procedura per amplificare (cioé creare copie multiple) di DNA, utilizzando un enzima specifico, la polimerasi e una miscela di nucleotidi liberi. La PCR si svolge in tre fasi. Durante la prima, o denaturazione, la molecola di DNA viene riscaldata e scissa nei due filamenti complementari. Nella seconda fase, brevi sequenze di DNA dette promotori o primer, sintetizzati chimica-mente, vengono aggiunti nella provetta di reazione; ad una determinata temperatu-ra, i primer si legano in punti specifici di ciascun filamento di DNA. Nella terza fase, di polimerizzazone, la polimerasi catalizza il legame delle sequenze primer con nucleotidi liberi; ciò avvia la progressiva formazione di un nuovo filamento di DNA complementare a quello originario. Per ogni ciclo di PCR si ottengono due copie identiche del frammento iniziale di DNA. La velocità della reazione è tale che in poche ore vengono sintetizzate cento miliardi di molecole.

Nucleotide

DNA originaleda replicare

DNA primer

Legamed’idrogeno

DENATURAZIONE ANNEALING ESTENSIONE Amplificazioneesponenziale

3’

3’

5’3’

5’

5’ 3’

3’

5’

5’ 3’3’5’

3’5’

5’

3

3

2

1

21

1

3

5’

3’

5’

3’

2

Figura 7 - Polymerase Chain Reaction

Figura 6 – Risultati del test rapido all’ureasi. Dopo l’aggiunta di frammenti bioptici ad un substrato solido (CLO test, A) o liquido (UltraFast 300, B), si osserva - in presenza di H. pylori - il viraggio dell’indicatore al colore rosa (test positivo). Entrambi i test sono specifici (100%), ma la sensibilità dell’UFT300 a 60 min è nettamente superiore (94.3% versus 32.9%). Pertanto, sebbene il CLO test sia stato il primo e più utilizzato test rapido all’ureasi, sono oggi preferiti i sub-strati liquidi, molto più rapidi ed attendibili.

Introdurre 1 o piùbiopsie nella provetta

Aggiungere il reagentefino a coprire totalmente

le biopsie, chiuderela provetta e agitare

per 5 secondi

Leggere il risultato dopo 5 minuti

A B 1

2

3

Negativo Positivo

0 min.

5 min.



La resistenza è dovuta a una mutazione puntifor-me (transizioni più frequenti: A-G e A-C) in un’ansa conservata di 23S rRNA [14]. La sequenza mutante può essere rilevata sia con i metodi PCR standard (utilizzando specifici primer della sequenza mutan-te) che con diverse tecniche, che ricercano - dopo amplificazione - le sequenze mutate [15].

Test Non Invasivi

L’esame endoscopico del tratto gastro-intesti-nale superiore è divenuto facilmente accessibile nei grandi come nei piccoli centri. Pertanto, viene ampiamente utilizzato nella gestione del paziente dispeptico, con un notevole incremento dei costi e delle liste d’attesa [16]. Tuttavia, l’esame en-doscopico può comportare una serie di complica-zioni, infrequenti, ma ben descritte in letteratura (perforazioni, infezioni, sanguinamenti, problemi connessi all’utilizzo dei farmaci per sedare il pa-ziente) [17]. In considerazione della bassa inci-denza di patologia neoplastica nei pazienti con età inferiore ai 45 anni, diverse Linee Guida naziona-li ed internazionali consigliano - nei pazienti con sintomatologia dispeptica non investigata, di età inferiore ai 45 anni e senza sintomi di allarme - la ricerca dell’infezione da H. pylori con metodiche non invasive [18-22].

Sierologia

La colonizzazione della mucosa gastrica da parte del batterio determina una risposta immunitaria sistemica e locale. Gli anticorpi sistemici (IgG) sono diretti contro diverse proteine di membrana e lipopolisaccaridi. La risposta locale determina la formazione di specifici anticorpi (IgA e IgM) ri-trovati nei succhi gastrici di pazienti con gastrite associata ad H. pylori. Malgrado esistano diverse tecniche per la ricerca degli anticorpi, la bassa accuratezza diagnostica non ne giustifica l’utilizzo diagnostico ed il costo, pur contenuto [23]. Inol-tre, il riscontro di elevati livelli anticorpali non ri-flette necessariamente un’infezione attiva ma rap-presenta solo la prova di un avvenuto contatto fra il batterio e il sistema immunitario dell’ospite. Per il controllo dell’avvenuta eradicazione è necessario attendere almeno sei mesi dopo la fine del tratta-mento antimicrobico. Solo dopo questo intervallo di tempo, la riduzione del titolo anticorpale (me-diamente del 25%) è tale da avere una sensibilità e specificità, rispettivamente dell’86% e del 100%. Il dosaggio degli anticorpi sierici, prima fra le me-

todologie non invasive, rimane sicuramente inso-stituibile per l’esecuzione di studi epidemiologici e per la caratterizzazione fenotipica dei ceppi batte-rici (CagA e/o VacA positivi o negativi) utile negli studi di eziopatogenesi [23, 25].

Urea Breath Test (UBT)

Come per il test all’ureasi, questa metodica sfrutta, per la diagnosi, la produzione dell’enzima ureasi da parte del batterio. Il test utilizza urea marca-ta con isotopi radioattivi (14C) o stabili (13C), oggi maggiormente utilizzati, grazie alla mancanza di radiazioni ionizzanti. L’urea marcata con 13C può essere usata con sicurezza anche nei bambini e nelle donne gravide.

L’urea 13C viene somministrata per via orale, in for-ma solida o liquida, spesso associata ad acido citri-co allo scopo di ritardare lo svuotamento gastrico. Il contatto con la mucosa gastrica (colonizzata da H. pylori e quindi ricca di ureasi) catalizza l’idroli-si dell’urea in ioni ammonio e anidride carbonica marcata. Poiché questa reazione chimica avviene al di sotto dello strato di muco, la CO2 marcata che si forma ha difficoltà a diffondere nel lume gastri-co, ma diffonde nel sangue grazie al flusso muco-sale gastrico. Dal circolo sistemico, la CO2 marcata raggiunge gli alveoli polmonari ed è eliminata con il respiro, dove è possibile la sua quantificazione attraverso spettrometria di massa o spettroscopia ad infrarosso [5] (Figura 8).

Anche la validità di questo test viene inficiata dall’utilizzo degli IPP [22], e ne viene quindi consi-gliata una sospensione di almeno 14 giorni prima dell’esecuzione. Falsi negativi possono essere ri-scontrati anche in pazienti precedentemente sotto-posti a chirurgia gastrica resettiva [5, 6]. Un’analisi dei risultati riportati in letteratura mostra che la sensibilità e la specificità del test sono maggiori del 95% [5, 6] sia per la diagnosi che per il follow-up dell’infezione.

Ricerca dell’Antigene Fecale

Da diversi anni è disponibile un test immunoenzi-matico (utilizzabile per la diagnosi e il monitorag-gio dell’eradicazione), che permette di determina-re la presenza di materiale antigenico di H. pylori nelle feci. Il test utilizza anticorpi monoclonali anti-H. pylori adsorbiti su microcelle. Il campione di feci può essere conservato a 2-8 °C fino a tre giorni o indefinitamente a -20°. La stabilità degli



antigeni permette la raccolta per settimane o mesi di molti campioni (soprattutto nei piccoli ospedali con pochi pazienti), che possono essere analizzati in un’unica sessione (con notevole riduzione dei costi) e conservati per analisi future.

Si tratta di un metodo semplice da eseguire, rapido e molto preciso. Il test si basa sull’uso di anticorpi di cattura monoclonali adsorbiti su microcelle modu-lari. Una piccola quantità di materiale fecale viene diluita con una appropriata soluzione tampone a pH 7.2. Il campione diluito, i controlli (positivo e nega-tivo) ed un anticorpo monoclonale coniugato con perossidasi sono quindi aggiunti al micropozzetto e incubati per un’ora a temperatura ambiente. Al ter-mine dell’incubazione, le microcelle vengono lavate con una soluzione tampone fosfato a pH 6.8 per rimuovere il materiale non legato. Si aggiunge quin-di un substrato cromogeno e si incuba per altri 10 minuti a temperatura ambiente. In presenza di an-tigene di H. pylori legato, si ha lo sviluppo di colore giallo, la cui assorbenza viene quantificata con uno

spettrofotometro a 450 nm. Ogni intensità di colore uguale o superiore al controllo positivo viene consi-derata come risultato positivo. Un’analisi dei risultati riportati in letteratura mostra che la sensibilità e la specificità del test sono maggiori del 91% [25] sia per la diagnosi che per il monitoraggio dell’infezio-ne. La sensibilità e la specificità dei test diagnosti-ci invasivi e non invasivi è riassunta nella Tabella 1 [5, 6, 26-28]. Accanto ai test immunoenzimatici quantitativi, sono disponibili diversi test rapidi su im-munocard, di facile e rapida esecuzione (Figura 9).

Altri Test

La ricerca di anticorpi anti H. pylori nelle urine e nella saliva è stata proposta come metodica alterna-tiva. I risultati sulla saliva sono stati deludenti (sen-sibilità 81%, specificità 73%). Un solo studio [29], condotto su 132 pazienti, ha misurato gli anticorpi urinari ed ha evidenziato valori di sensibilità e speci-ficità accettabili (86% e 91% rispettivamente).

Figura 8 - Principio su cui si basa l’Urea breath test (UBT): l’urea (75 mg), marcata con un isotopo (stabile, 13C o radioattivo, 14C) del carbonio, disciolta in 200 ml di succo d’arancia o 200 ml di acqua, contenenti 1 g di acido citrico, viene somministrata per via orale. Nel lume gastrico, l’urea viene idrolizzata dall’ureasi batterica in am-moniaca e anidride carbonica, che diffonde nei vasi sanguigni. Dal sistema circolatorio raggiunge, sotto forma di bicarbonato, i polmoni e viene escreta come 13CO2 o 14CO2 nell’aria espirata, dove può essere quantificata o con la spettrometria di massa (13C) o mediante conteggio a scintillazione liquida (14C)



H. pylori H. pylori H. pylori H. pylori

Positivo Negativo Non valido

CT

CT

CT

CT

H. pylori

10 min.

CT

Figura 9 - Ricerca dell’antigene di H. pylori nelle feci. Accanto ai test immunoenzimatici quantitativi, che richiedo-no l’invio di un campione di feci al laboratorio, sono stati messi a punto diversi test rapidi immunocromatografici, eseguibili direttamente in ambulatorio. Il metodo - semplice da eseguire, rapido e molto affidabile - prevede l’u-tilizzo di un anticorpo monoclonale specifico per l’antigene di H. pylori, fissato ad una membrana cromatografica, e di un secondo anticorpo coniugato con particelle di oro colloidale marcato a un colorante. Se è presente nel campione di feci l’antigene di H. pylori, si forma un complesso con l’anticorpo marcato con il colorante. Quando il liquido attraversa la membrana il complesso sarà catturato dall’anticorpo fissato sulla membrana. La comparsa di una banda colorata nella zona T, indica che il risultato del test è positivo. Inoltre il test prevede una procedura di controllo interna rappresentata dalla comparsa di una banda nella zona di controllo C che si forma indipenden-temente dalla presenza dell’antigene di H. pylori. La formazione della banda nella zona di controllo C indica che il dosaggio è avvenuto in maniera corretta

Tabella 1 - Sensibilità e specificità dei test diagnostici, di uso consolidato, per la diagnosi dell’infezione da H. pylori (dati ricavati da Cutler et al. [26], el-Zimaity et al. [27], Ricci et al. [5], Ferwana et al. [28], Wang et al. [6])

Metodi Diagnostici Sensibilità Specificità

Invasivi

Istologia 53-90 % 53-90 %*

Coltura 85-95 % 100 %

Test Rapido all’Ureasi 85-95 % 95-100 %

Non-invasivi

Sierologia 90-97 % 50-96 %

Urea Breath Test 95-97 % 91-94 %

Antigene Fecale(Anticorpi monoclonali) 93-95 % 96-98 %

* La sensibilità e specificità dell’istologia dipendono dalla specifica condizione clinica, dalla densità batterica e dall’esperienza dell’anatomo-patologo. In genere, una diagnosi istologica dell’infezione è possibile nel 90% dei casi.



Uno studio recente [30] ha valutato la perfor-mance della ricerca del DNA batterico estratto dai campioni fecali (mediante TaqMan real-time PCR 1), come metodologia per valutare sia la pre-senza dell’H. pylori che eventuali mutazioni indi-cative di una resistenza alla claritromicina. Sono stati analizzati 294 campioni fecali, di cui 230 pro-venienti da pazienti con diagnosi di infezione da H. pylori accertata con almeno 3 test. La PCR ha identificato il DNA batterico in 214 campioni, ri-velando quindi una sensibilità del 93%. Nel 36% degli stessi campioni, nei quali è stata valutata la resistenza alla claritromicina, sono state iden-tificate mutazioni puntiformi nella regione codifi-cante il 23S rRNA (A2142C, A2142G, A2143G). La terapia eradicante (con regimi contenenti claritro-micina) è risultata efficace - nei campioni privi di

1 La PCR real-time, denominata anche PCR quantitativa o PCR quantitativa in tempo reale, è un metodo che simultaneamente amplifica (reazione a catena della polimerasi o PCR) e quanti-fica il DNA. TaqMan è il nome di una serie di sonde rivelatrici di fluorescenza utilizzate per aumentare la specificità della real time PCR.

mutazioni (wild type) nel 96% dei pazienti men-tre in quelli mutati il tasso di eradicazione è stato solo del 60%, con una correlazione tra genotipo ed esito terapeutico dell’88% [30]. Questi risultati promettenti fanno prevedere un futuro utilizzo di questa metodica.

Recentemente è stata descritta una nuova tecnica in grado di misurare in tempo reale, durante l’esa-me endoscopico, la quantità di ammonio presente nel succo gastrico e quindi porre rapidamente la diagnosi di infezione [31]. La misura della con-centrazione di ammonio con metodi chimici, en-zimatici o elettrochimici risale agli anni 90’ [32]. Tuttavia, solo recentemente è stata messa a di-sposizione dell’endoscopista una strumentazione dedicata (EndoFaster™, Figura 10), in grado di misurare in maniera automatizzata sia la concen-trazione dello ione ammonio che il valore del pH, entrambi tramite elettrodi iono-selettivi. L’analisi del succo gastrico fornisce al medico informazioni che completano l’esame endoscopico grazie all’in-tegrazione di dati morfologici e funzionali. In uno

Figura 10 - Strumentazione dedicata (EndoFaster™), per la misura automatizzata - mediante elettrodi iono-selet-tivi - della concentrazione dello ione ammonio e del pH del succo gastrico durante l’esofago-gastro-duodenosco-pia. Lo strumento è interposto tra l’endoscopio e il sistema di aspirazione. All’inizio dell’esame, il succo gastrico viene aspirato e convogliato all’EndoFaster™, dove viene immediatamente analizzato. I risultati appaiono diretta-mente sul display (nell’inserto) in tempo reale



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studio recente su 189 pazienti la sensibilità, spe-cificità, valore predittivo positivo e valore preditti-vo negativo del metodo - confrontato con l’esame istologico, considerato come gold standard - sono risultati rispettivamente del 90.3%, 85.5%, 80.2%, 93.1% [31]. Quando l’UBT è stata utilizzata come test di riferimento, i valori sono stati rispettivamente di 97.1%, 89.7%, 85.9% e 98.0%. Una valutazione farmaco-economica (HTA, Health Technology As-sessment degli AA Anglosassoni) ha concluso che il dispositivo soddisfa i tre criteri di selezione delle tecnologie potenzialmente cost-saving [33].

Conclusioni

Per diagnosticare l’infezione in maniera non inva-siva, le uniche due metodiche che consentono di avere dei valori di sensibilità e specificità >90% sono rappresentate dal 13C-urea breath test e dal-la ricerca dell’antigene fecale con anticorpi mono-clonali. Fra i metodi invasivi, il test rapido all’u-reasi e/o l’istologia rimangono le metodiche più diffuse e meno costose, se confrontante con altre tecniche quali la coltura o le tecniche di biologia molecolari.

Take Home Messages

● Le due metodiche non invasive da utilizzare per la diagnosi e la conferma dell’eradicazione dell’in-fezione da Helicobacter pylori sono il dosaggio dell’antigene fecale (HpSA) e l’urea breath test con substrato marcato

● L’utilizzo di metodiche invasive deve essere limitato a pazienti selezionati, nei quali l’esame endoscopi-co si impone per la presenza di sintomi di allarme

● Il dosaggio delle IgG non è più considerato un metodo attendibile per porre diagnosi di infezio-ne da Helicobacter pylori

● Nuovi test diagnostici (come il dosaggio degli anticorpi urinari o l’analisi del succo gastrico in tempo reale rappresentano promettenti metodi-che alternative



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