DOTTORATO DI RICERCA INEPATOLOGIA SPERIMENTALE E CLINICA - XXV CICLO

Coordinatore Prof. Eugenio Gaudio

DIPARTIMENTO DI SCIENZE ANATOMICHE, ISTOLOGICHE, MEDICO-LEGALI E DELL'APPARATO LOCOMOTORE

SEZIONE DI ANATOMIA UMANA“SAPIENZA”

UNIVERSITÀ DI ROMA

RUOLO DELLA MELATONINA E DEL PATHWAY SU CUI ESSA AGISCE NELLA REGOLAZIONE DELLA CRESCITA

DELL’EPITELIO BILIARE SIA IN CONDIZIONI SPERIMENTALI CHE NELLE COLANGIOPATIE UMANE E NEL

COLANGIOCARCINOMA.

Dott.ssa Anastasia Renzi

Tutor: Prof. Antonio Franchitto

Anno Accademico 2012-2013

1

ABSTRACT

I colangiociti sono cellule epiteliali che rivestono l’albero biliare e che

in condizioni normali sono quiescenti. In condizioni sperimentali

invece, come in seguito a legatura del dotto biliare (BDL) o in alcune

colangiopatie umane (es. cirrosi biliare primitiva-PBC) i colangiociti

vanno incontro ad una marcata proliferazione. Molti fattori, come per

esempio il fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) e l'ormone

follicolo stimolante (FSH) regolano la crescita dell’albero biliare. La

melatonina è un ormone secreto dalla ghiandola pineale e da altri

tessuti dove agisce da regolatore locale della crescita, come nel tratto

gastroenterico. La melatonina esercita i suoi effetti attraverso due

recettori di membrana (MT1 e MT2) ed è sintetizzata a partire dal

triptofano ad opera di quattro enzimi: triptofano idrossilasi (TPH),

aromatico aminoacido decarbossilasi (AADC), serotonina N-

acetiltransferasi (AANAT) e acetilserotonina O-metiltransferasi

(ASMT). La melatonina agisce modulando l’espressione dei Clock

genes nella ghiandola pineale. Nel fegato la melatonina riduce il

danno ossidativo. Scarse sono le informazioni circa gli effetti della

melatonina sull’epitelio biliare. Lo scopo del presente studio è stato

quello di valutare il ruolo della melatonina nella regolazione della

proliferazione dell’epitelio biliare. A tal fine abbiamo utilizzato ratti

normali e BDL trattati o meno con: i) melatonina, ii) Arilalkilamina-N-

acetiltransferasi (AANAT) mistatch, iii) AANAT Vivo Morpholino per 7

giorni e iiii) nude mice iniettati con la linea cellulare di

colangiocarcinoma (Mz-Cha-1) trattati o meno con melatonina. Sui

campioni epatici dei modelli sperimentali abbiamo valutato: i)

l’espressione della melatonina, dei recettori della melatonina (MT1 e

MT2) e dei Clock genes, la proliferazione e l’apoptosi colangiocitaria,

2

ii) i livelli di adenosina monofosfato ciclico (cAMP) basali e dopo

secretina e iii) la fosforilazione della protein-chinasi-A. In aggiunta,

abbiamo studiato l’espressione dei recettori della melatonina e di

AANAT in frammenti di fegato umano sia normale che affetto da PBC

e da colangiocarcinoma. In vitro, linee cellulari di grandi colangiociti di

topo (LMC), di colangiociti normali umani (H69) e di

colangiocarcinoma (Mz-Cha-1) sono state stimolate con melatonina

per 48h alla concentrazione di 10-11 M, più o meno Luzindolo (MT1

antagonista) o cis-4-Fenil-2-propionamidotetralina (4P-PDOT) (MT1 e

MT2 antagonista). Infine, abbiamo valutato l'effetto

dell’overespressione di AANAT in LMC e in Mz-Cha-1 su

proliferazione, apoptosi e livelli intracellulari di cAMP. I risultati

ottenuti hanno dimostrato che: i colangiociti esprimono gli enzimi

implicati nella sintesi della melatonina, i recettori MT1 e MT2 e i Clock

genes. Il trattamento in vivo con melatonina determina una parziale

inibizione nella proliferazione dell’epitelio biliare in particolare dopo

BDL; la ridotta espressione di AANAT indotta dal Morpholino in ratti

normali e BDL induce un parziale aumento della proliferazione. La

stimolazione in vitro dei colangiociti di topo riduce la crescita

colangiocitaria, diminuzione che è prevenuta dal Luzindolo ma non

dal 4P-PDOT. Anche l’overespressione in vitro di AANAT in LMC

determina la diminuzione della crescita colangiocitaria e dei livelli

intracellulari di cAMP. L’espressione di AANAT e della melatonina è

ridotta nel colangiocarcinoma, mentre aumenta l’espressione dei

recettori MT1 e MT2. Nei nude mice iniettati con linee cellulari di

colangiocarcinoma si assiste alla diminuzione della massa tumorale

in seguito al trattamento con melatonina. L’overespressione di

AANAT nelle cellule Mz-Cha-1 determina la riduzione della

proliferazione e l’aumento dell’apoptosi. Nella PBC si ha l'aumento

3

dell'espressione di AANAT, della melatonina e dei suoi recettori MT1

e MT2 rispetto al fegato umano normale.

Sulla base dei risultati ottenuti, è possibile affermare quindi che la

melatonina svolge un ruolo importante nella regolazione della

proliferazione colangiocitaria in corso di patologie epatiche

colestatiche e nel colangiocarcinoma.

4

ABSTRACT (english)

Cholangiocytes are ephitilial cells which line the biliary tree and that in

normal condition are mitotically quiescient. Under experimental

conditions, such as bile duct ligation (BDL) or in some human

cholangiopathies (eg, primary biliary cirrhosis-PBC) cholangiocytes

undergo a marked proliferation. A number of factors including

Vascular endothelial growth factor (VEGF) and Follicle-stimulating

hormone (FSH) regulate biliary tree growth. Melatonin is secreted by

the pineal gland and other tissues where it acts as a local regulator of

growth, as in the gastrointestinal tract. Melatonin exerts its effects

through two membrane receptors (MT1 and MT2) and is synthesized

from tryptophan by four enzymes: tryptophan-hydroxylase (TPH),

aromatic-amino acid decarboxylase (AADC), serotonin N-

acetyltransferase (AANAT) and acetilserotonin- O-methyltransferase

(ASMT). Melatonin acts by modulating the expression of Clock genes

in the pineal gland. In the liver melatonin reduces oxidative damage.

Little information exists about the effects of melatonin on biliary

epithelium, therefore the aim of this study was to evaluate the role of

melatonin in the regulation of proliferation of biliary epithelium. To this

end, we used normal and BDL rats treated or not with: i) melatonin, ii)

Arilalkilamina-N-acetyltransferase (AANAT) mistatch and iii) AANAT

Vivo Morpholino for 7days and iiii) nude mice injected with the

cholangiocarcinoma cell line (Mz-Cha-1) treated or not with

melatonin. On liver samples of the experimental models we

evaluated: i) the expression of melatonin, the melatonin receptors

(MT1 and MT2) and Clock genes, cholangiocytes proliferation and

apoptosis, ii) basal and secretin Cyclic adenosine monophosphate

(cAMP) levels and Protein Chinase A (PKA) phosphorylation. In

5

addition, we evaluated the expression of melatonin, its receptors and

AANAT also in fragments of normal human liver, cholangiocarcioma

and PBC. In vitro, large mouse cholangiocytes (LMC), normal human

cholangiocytes (H69) and cholangiocarcinoma cell line (Mz-Cha-1)

were treated with melatonin 10-11 M for 48h, plus or minus Luzindole

(MT1 antagonist) or cis-4-Phenyl-2-propionamidotetralin(4P-PDOT)

(MT1 and MT2 antagonist); Finally, we evaluated the effects of

AANAT overexpression in LMC and in Mz-Cha-1 on proliferation,

apoptosis and cAMP pathway. The results obtained showed that:

cholangiocytes expess AANAT, melatonin and its receptors MT1 and

MT2 and Clock genes. Chronic administration of melatonin in vivo

decreased cholangiocytes proliferation after BDL, and the down-

regulation of AANAT in Normal and BDL AANAT Morpholino treated

rats increased proliferation. In vitro, melatonin decreased LMC

proliferation, decreased which is blocked by Luzindole but not by (4P-

PDOT). Overexpression of AANAT in LMC decreased cholangiocytes

proliferation, and the intracellular cAMP levels. The expression of

AANAT and melatonin decreased in cholangiocarcinoma, instead

increased is the expression of MT1 and MT2. In nude mice injected

with CCA cell lines the tumor decreased after treatment with

melatonin. Overexpression of AANAT in Mz-Cha-1 decreased

proliferation and increased apoptosis. In PBC the expression of

AANAT, melatonin and its receptors increased if compared to normal.

Based on the results obtained, we can say that melatonin plays an

important role in the regulation of cholangiocytes proliferation during

cholestatic liver diseases and cholangiocarcinoma.

6

INTRODUZIONE

Vie biliariLe vie biliari originano a livello del polo biliare degli epatociti

responsabili della produzione della bile. Una volta prodotta, la bile è

secreta nel lume dei canalicoli biliari. I canalicoli biliari sono piccoli

spazi di 0.5–2 µm delimitati da semplici introflessioni della membrana

plasmatica dei poli biliari di epatociti adiacenti. Il polo biliare

dell’epatocita che delimita il canalicolo biliare è fornito di numerosi e

brevi microvilli sporgenti nel lume ed è isolato dal polo vascolare ad

opera di complessi giunzionali (zone occludenti)1.

In prossimità del polo biliare, il citoscheletro dell’epatocita presenta

numerosi microfilamenti prevalentemente costituiti da proteine

contrattili che, posti in prossimità del canalicolo, favoriscono il

decorso della bile lungo i canalicoli stessi. I canalicoli biliari dalla

regione centrolobulare si portano in prossimità degli spazi portobiliari

e raggiungono i canali di Hering1-5.

Il punto in cui i canalicoli biliari si continuano con i canali di Hering

viene definito giunzione duttulo-canalicolare. A livello di tale

giunzione, la parete delle vie biliari è in parte formata da

colangiocitied in parte da epatociti. In questa sede, sono state inoltre

identificate cellule parzialmente indifferenziate, le cellule progenitrici

epatiche. Esse vanno a costituire un compartimento staminale

residente nel fegato in grado di differenziarsi sia verso la linea

colangiocitaria che verso la linea epatocitaria4.

I canali di Hering costituiscono quindi i punti di raccordo anatomico e

fisiologico tra canalicoli biliari e dotti biliari interlobulari dello spazio

portale. La parete di tali canali è costituita da poche (3 o 4) cellule

epiteliali cubiche, o colangiociti, che poggiano su una sottile lamina

7

propria6.

Ai canali di Hering fanno seguito i dotti interlobulari, la cui parete è

costituita da uno strato continuo di colangiociti di forma cilindrica1. I

dotti interlobulari hanno un diametro compreso tra 15 e 100 µm e si

affiancano, all’interno degli spazi portobiliari, alle ramificazioni

dell’arteria epatica, della vena porta, dei nervi e dei vasi linfatici. Tali

dotti si portano in condotti di calibro progressivamente maggiore fino

a formare due voluminosi condotti intraepatici (dotto epatico destro e

sinistro) che drenano rispettivamente il lobo epatico destro e sinistro

del fegato e che, a livello dell’ilo, danno origine alle vie biliari

extraepatiche7,8,9.

I dotti biliari intraepatici si possono classificare nell’uomo in base al

diametro: grandi dotti (>800 µ), e progressivamente dotti segmentali,

zonali, settali, interlobulari(15-100 µ) e duttuli (<15 µ). Alle vie biliari

intraepatiche fanno seguito le vie biliari extraepatiche, esse hanno

un’organizzazione ed una struttura del tutto caratteristiche1.

Infatti, nell’uomo sono costituite dai dotti epatici destro e sinistro.

Questi a livello dell’ilo epatico, si uniscono andando a formare il dotto

epatico comune che, a sua volta si unisce al dotto cistico proveniente

dalla cistifellea o colecisti1.

Da questa confluenza ha origine il dotto coledoco che, percorrendo il

legamento epato-duodenale, passa posteriormente alla prima

porzione del duodeno e alla testa del pancreas e penetra nella

seconda porzione duodenale per sboccare nell’ampolla duodenale

maggiore insieme al dotto pancreatico principale1.

Dotto epatico destro e sinistro, dotto epatico comune costituiscono la

via biliare principale, mentre la cistifellea e il dotto cistico

rappresentano la via biliare accessoria1.

Studi morfologici condotti su sezioni di fegato di ratto hanno

8

dimostrato che le vie biliari intraepatiche si dividono in: piccoli dotti

(<15 µm di diametro) delimitati da piccoli colangiociti; e grandi dotti

(>15 µm di diametro) delimitati da grandi colangiociti7,8,10.

In particolare si è visto che le vie biliari intraepatiche nel ratto sono

costituite da dotti di differenti dimensioni da 5 a 200 µm di diametro

delimitati da colangiociti eterogenei per dimensioni da 8 a 15 µm2.

Nel ratto, la via biliare extraepatica è caratterizzata dall’assenza della

cistifellea: infatti, i dotti provenienti dai lobi epatici si uniscono tra di

loro a formare il dotto biliare o coledoco che sbocca direttamente nel

primo tratto dell’intestino tenue9.

Le vie biliari sono irrorate da rami terminali dell’arteria epatica, che

costituiscono un complesso sistema vascolare denominato Plesso

Peribiliare (PPB). Il Plesso Peribiliare, si estende fino ai dotti

interlobulari e termina nei sinusoidi epatici, sia direttamente attraverso

rami lobulari, che indirettamente attraverso rami della vena porta o

rami prelobulari9,11,12.

Le modalità di terminazione dell’arteria epatica e la dimostrazione

dell’esistenza di un Plesso Peribiliare prima dello sbocco dell’arteria

nella rete sinusoidale è stata resa possibile attraverso l’osservazione

di calchi microvascolari con il Microscopio Elettronico a

Scansione10,11.

Inoltre numerosi studi effettuati sul ratto hanno dimostrato che i piccoli

ed i grandi dotti biliari presentano una differente vascolarizzazione.

Infatti, il Plesso Peribiliare è maggiormente esteso a livello dei grandi

dotti biliari. La conseguente differenza di apporto ematico influenza

fortemente le capacità metaboliche e le funzioni dei dotti biliari di

calibro diverso e dei colangiociti che ne costituiscono le pareti12,13.

Infine, da un punto di vista fisiologico, il Plesso Peribiliare è

fondamentale nel permettere l’attivo riassorbimento e quindi la

9

modificazione della bile da parte dei colangiociti. In particolare, esso

consente di riassorbire sostanze presenti nella bile e di ricondurle,

attraverso il letto sinusoidale, in prossimità del polo vascolare degli

epatociti12.

Nell’uomo le vie biliari intra- ed extraepatiche sono innervate da nervi

del sistema nervoso autonomo che originano dal plesso celiaco (fibre

simpatiche) e dal nervo vago (fibre parasimpatiche). Accanto ai

classici neurotrasmettitori (adrenalina, noradrenalina ed acetilcolina),

le fibre neurovegetative rilasciano nel fegato numerosi altri

neuropeptidi come il Neuropeptide Y (NPY), il Calcitonin Gene-

Related Peptide (CGRP), la somatostatina, il Vasoactive Intestinal

Polipeptide (VIP), l’encefalina e la bombesina. Molti di questi

neuropeptidi si sono dimostrati capaci di influire in senso stimolatorio

od inibitorio l’attività funzionale dei colangiociti14-18.

Colangiociti: funzioni e loro regolazioneI colangiociti sono le cellule epiteliali che costituiscono la parete delle

vie biliari. Sia nel ratto che nell’uomo si presentano come cellule

eterogenee per quanto concerne la loro dimensione che può variare

da 3 a 15 µm2 in relazione al diametro dei dotti in cui si trovano7,8,10.

Tale eterogeneità di dimensioni corrisponde ad ulteriori differenze

morfologiche, ultrastrutturali, antigeniche, funzionali e proliferative7,8,10.

Infatti, morfologicamente, i piccoli colangiociti possiedono forma

cuboidale e sono caratterizzati dal possedere un grande nucleo e

scarso citoplasma. Tale aspetto è tipico di cellule poco differenziate. I

grandi colangiociti invece hanno forma cubica-colonnare, presentano

un nucleo piccolo ed abbondante citoplasma7,8,10. Entrambi esprimono

la citocheratina 7 e 19, la fosfatasi alcalina e soltanto i grandi

colangiociti il recettore per la secretina.

10

I colangiociti rappresentano le cellule target di un gruppo di patologie

croniche colestatiche del fegato che prendono il nome, nel

complesso, di colangiopatie. Le colangiopatie sono caratterizzate

dalla progressiva scomparsa dei dotti biliari intraepatici che conduce

ad una severa duttopenia negli stadi terminali. Negli stadi precoci di

tali malattie, la scomparsa dei dotti biliari viene compensata dalla

proliferazione dei dotti sopravvissuti. La progressione del quadro

patologico è legata al bilancio tra i fenomeni di morte e di

proliferazione cellulare; pertanto, gli stadi terminali sono

contraddistinti dall’incapacità dei fenomeni proliferativi di far fronte

alla continua perdita dei colangiociti19,20. Per tali ragioni un numero

sempre crescente di studi ha posto l’attenzione sui meccanismi di

proliferazione dei colangiociti nel tentativo di individuare possibili

strategie terapeutiche per sostenere e supportare un’efficace

proliferazione dei dotti biliari intraepatici e ritardare l’evoluzione del

quadro patologico. Dal punto di vista sperimentale, un utile modello

animale per lo studio della proliferazione delle vie biliari intraepatiche

è rappresentato dalla legatura delle vie biliari (bile duct ligation: BDL)

nel ratto che determina una selettiva proliferazione dei dotti biliari

intraepatici. Tale proliferazione è responsabile dell’incremento della

massa dei dotti biliari intraepatici e dei colangiociti che arrivano a

rappresentare fino al 30% delle cellule parenchimali del fegato

(normalmente ne rappresentano il 2%)21,22. La proliferazione dei

colangiociti fa parte della cosiddetta “ductular reaction”, termine che

indica la proliferazione di una popolazione di cellule epiteliali

all’interfaccia tra epatociti e spazio portale costituita da colangiociti,

cellule progenitrici epatiche ed epatociti4,18,23. Diversi studi

sperimentali hanno definito quattro tipi di proliferazione

colangiocitaria18.

11

1. Proliferazione di tipo I o tipica: rappresenta una reazione

iperplastica che comporta un aumento, confinato nello spazio

portale, del numero dei dotti biliari intraepatici. I colangiociti

proliferanti formano strutture tubulari ben differenziate che

presentano un lume ben definito4,24. Nel ratto una proliferazione

“tipica” viene osservata in diverse condizioni sperimentali quali, ad

esempio, la legatura delle vie biliari (BDL)25, l’epatectomia

parziale24 ed il trattamento cronico con L-prolina26. Inoltre, la

proliferazione “tipica” può essere ottenuta anche con la

somministrazione in acuto di alte dosi di CCL4 e con la

somministrazione cronica di α-naphthyl isothiocyanato (ANIT) o di

sali biliari. Nell’uomo, una proliferazione colangiocitaria tipica può

essere osservata in corso di una colestasi ostruttiva acuta di grado

severo e nelle prime fasi delle patologie colestatiche croniche.

Questo tipo di proliferazione sembra essere dovuta

all’allungamento dei dotti biliari preesistenti localizzati negli spazi

portali e ciò è confermato da diverse evidenze sperimentali nel

ratto e nell’uomo18,27.

2. Proliferazione di tipo II o atipica: nel ratto si presenta in seguito a

somministrazione di tetracloruro di carbonio28; nell’uomo è

presente dopo necrosi epatica massiva, epatopatia alcolica,

iperplasia nodulare focale e nelle patologie colestatiche croniche

quali cirrosi biliare primitiva e colangite sclerosante primitiva18,29; è

caratterizzata da una proliferazione irregolare dei dotti biliari

intraepatici non confinata nello spazio portale ma estesa nella

zona periportale e nel parenchima epatico adiacente e capace di

costituire occasionalmente cordoni cellulari con gli epatociti.

Questo tipo di proliferazione determina la formazione di strutture

duttulari irregolari e tortuose che non possiedono un lume ben

12

definito e sono associate ad infiammazione e ad infiltrazione di

polimorfonucleati neutrofili; inoltre tali dotti neoformati non sono

funzionalmente efficienti. A differenza della proliferazione “tipica”,

nella proliferazione di tipo II è stata descritta la presenza di cellule

di transizione con caratteristiche fenotipiche sia di colangiociti sia

di epatociti. Tale riscontro è a favore dell’ipotesi che la

proliferazione atipica sia un fenomeno di metaplasia e che possa

quindi originare dal compartimento delle cellule progenitrici

epatiche piuttosto che rappresentare una replicazione dei dotti

preesistenti18,29.

3. Proliferazione di tipo III: è una proliferazione massiva ad origine

dal compartimento delle cellule progenitrici epatiche in seguito a

necrosi epatica submassiva18.

4. Proliferazione di tipo IV (“oval cell” proliferation): è caratteristica

degli stadi precoci della carcinogenesi nel fegato di ratto ed è

causata da numerosi composti chimici. È caratterizzata dalla

formazione di strutture tubulari irregolari e disorganizzate, con un

lume non ben definito, che si aggettano all’interno del lobulo

epatico con alterazione dell’architettura dell’intero parenchima18.

Tale classificazione della proliferazione colangiocitaria é basata

soprattutto su studi sperimentali; nella patologia umana la distinzione

tra proliferazione “tipica” e “atipica” non é di facile applicazione.

Numerosi fattori di crescita, ormoni e neuropeptidi sono coinvolti nella

regolazione della proliferazione dei colangiociti (Tabella 1). Lo stimolo

proliferativo sembra essere legato sia all’aumento della pressione

all’interno del lume dei dotti biliari intraepatici sia a numerosi fattori

bioumorali che sembrano giocare un ruolo importante30.

13

Fattori di Crescita e Citochine

E’ stato dimostrato che l’epidermal growth factor (EGF), l’hepatocyte

growth factor (HGF), l’Insulin-like Growth Factor 1 (IGF1),

l’interlukina-6 (IL-6), l’interlukina-1α, il tumor necrosis factor α (TNF-α)

e il Vascular Endothelial Gowth Factor (VEGF) sono capaci di

stimolare in vitro ed in vivo la proliferazione dei colangiociti (Tabella

1)18,31,32.

Estrogeni e asse GH – IGF1.

È noto che gli ormoni steroidei sessuali sono in grado di influenzare lo

sviluppo e il decorso di patologie epatiche33. È stato dimostrato come

i colangiociti siano cellule estrogeno-sensibili in grado di esprimere

entrambe i recettori per gli estrogeni (ER-α ed ER-β) a differenza

degli epatociti che esprimono solo il recettore ER-α22 (Tabella 1).

Anche l’IGF1 è in grado di regolare la proliferazione colangiocitaria.

Infatti, l’IGF1 è un peptide circolante (di cui il fegato rappresenta la

fonte produttiva principale) che agisce localmente come fattore di

crescita dalle molteplici funzioni endocrine, paracrine ed autocrine34,35

(Tabella 1).

L’IGF1 è sintetizzato dal fegato sotto il controllo ipofisario del GH

(Growth Hormone) che, dopo essersi legato a recettori specifici (GH-

R), induce la sintesi e il rilascio in circolo di IGF1 in grado di giocare

un ruolo chiave nell’accrescimento postnatale di numerosi organi.

Pertanto, nei colangiociti si assiste ad una complessa interazione tra

estrogeni ed IGF1 che assieme intervengono nella modulazione dei

processi di proliferazione, apoptosi e differenziazione cellulare

favorendo i processi di riparazione tissutale34,36 (Tabella 1).

Neuropeptidi

14

L’attività e la proliferazione dei colangiociti sono regolate dal sistema

nervoso vegetativo, parasimpatico ed ortosimpatico, in modo

coordinato. Tali cellule, infatti, esprimono il recettore per l’acetilcolina

che è responsabile del controllo dei processi di secrezione. Il sistema

nervoso parasimpatico svolge inoltre un importante ruolo nel regolare

la proliferazione cellulare come mostrato nel ratto BDL dopo

vagotomia. Questo modello è caratterizzato dalla riduzione delle

cellule in proliferazione e dall’aumento di quelle in apoptosi; tale

effetto sembra essere legato alla regolazione dell’attività

dell’adenilatociclasi e conseguentemente dei livelli intracellulari di

cAMP che ha un ruolo fondamentale nel sostenere la proliferazione e

prevenire l’apoptosi37. I livelli intracellulari di cAMP sono inoltre sotto il

controllo dalla somatostatina, i cui recettori SSTR2 sono presenti nei

colangiociti murini ed umani; nel ratto BDL, la somatostatina agisce

come inibitore della proliferazione colangiocitaria mediante l’inibizione

dell’adenilatociclasi38. Nel ratto sottoposto ad epatectomia parziale, la

conservazione dell’innervazione simpatica è un requisito

fondamentale per la rigenerazione epatocitaria e colangiocitaria; i

colangiociti del ratto esprimono sia recettori adrenergici sia

dopaminergici e ciò sottolinea il ruolo anche del sistema ortosimpatico

nel regolare le funzioni e la proliferazione delle cellule dei dotti

biliari39.

La gastrina è un ormone polipeptidico prodotto dalle cellule G dello

stomaco con funzione principale di regolare la secrezione gastrica.

Tale ormone diminuisce la secrezione di bile e i livelli di cAMP indotti

da secretina mediante l’interazione con i suoi recettori CCK-A e CCK-

B presenti sulla membrana basolaterale dei colangiociti40.

Sali Biliari

15

Infine, anche i sali biliari sono in grado di influenzare la proliferazione

dei dotti biliari. Infatti, nel ratto BDL i colangiociti risultano molto

sensibili alle variazioni della composizione del pool dei sali biliari. E’

stato infatti dimostrato che mentre il Litocolato, il Taurocolato ed il

Taurolitocolato favoriscono la proliferazione dei colangiociti,

l’Ursodesossicolato ed il Tauroursodesossicolatone ne inibiscono la

proliferazione (Tabella 1)41.

Tabella 1. Principali fattori che regolano la proliferazione dei

colangiociti.

Fattori di crescita ecitochine

IGF-1

EGF

HGF

TGF-α

TNF-α

VEGFs

TGF-β

OrmoniE neuropeptidi

Estrogeni

Secretina

Acetilcolina

Gastrina

Somatostatina

Sali BiliariLitocolato

Taurocolato

Taurolitocolato

Ursodesossicolato

Tauroursodesossicolato

Apoptosi e colangiociti

Nelle vie biliari intraepatiche normali umane, i colangiociti in apoptosi

variano per numero e distribuzione oltre che per l’espressione delle

16

diverse proteine del pathway mitocondriale dell’apoptosi: infatti,

maggiore è il diametro del dotto biliare intraepatico e, maggiore è il

numero di cellule in apoptosi; ciò enfatizza la differente attività

cellulare dei colangiociti che varia a seconda della posizione

anatomica da essi occupata all’interno delle vie biliari. Nel fegato

umano normale, infatti, è stato visto che l’espressione delle proteine

del pathway mitocondriale dell’apoptosi varia nelle diverse porzioni

dell’albero biliare, in particolare le cellule dei piccoli dotti interlobulari

esprimono diffusamente le proteine anti-apoptotiche Bcl2, Bcl-Xl e

mcl-1 che, di contro, sono poco espresse nelle cellule dei grandi dotti

biliari e dei dotti biliari settali; la proteina pro-apoptotica Bax risulta

invece espressa diffusamente lungo tutto l’albero biliare. Il balance tra

l’espressione di Bax e di Bcl2 è diverso nei grandi dotti biliari se

paragonato ai piccoli dotti interlobulari; infatti nei grandi dotti biliari il

balance tra proteine anti-(Bcl2) e pro-(Bax) apoptotiche è a favore di

quest’ultime, contrariamente a quanto avviene nei piccoli dotti biliari.

Ciò potrebbe spiegare la differente distribuzione del numero dei

colangiociti in apoptosi lungo le vie biliari e la loro prevalenza nei dotti

di diametro maggiore42. L’apoptosi può essere determinata da

numerosi fattori quali la deprivazione di fattori di crescita, processi

immuno-mediati, agenti infettivi e sostanze tossiche30. Il ruolo

dell’apoptosi nei colangiociti e nella patofisiologia di queste cellule è

ad oggi di grande interesse scientifico. Nella patologia umana è molto

importate il ruolo della morte programmata nella patogenesi e nella

progressione delle colangiopatie ed in particolare nella cirrosi biliare

primitiva in cui l’evoluzione verso la fase duttopenica è legata al

balance tra fenomeni proliferativi e fenomeni apoptotici con la

prevalenza di questi ultimi43,44.

17

ColangiopatieI colangiociti hanno fisiologicamente bassa attività replicativa ma, in

alcune condizioni patologiche, come nelle cosiddette colangiopatie

anche note come “Vanishing Bile Duct Syndromes”, essi diventano le

cellule target andando incontro a processi proliferativi seguiti poi da

aumentata apoptosi. Le “Vanishing Bile Duct Syndromes”, sono infatti

caratterizzate dalla progressiva scomparsa dei dotti biliari seguita da

grave grado di duttopenia e quindi gravissime conseguenze per la

funzionalità epatica. E’ stato visto che le colangiopatie sono

responsabili di oltre il 20% dei trapianti di fegato negli adulti e

dell’80% delle indicazioni di trapianto di fegato in età pediatrica.

Esempi di colangiopatie sono la Cirrosi Biliare Primitiva (PBC)43 e la

Colangite Sclerosante Primitiva (PSC)40.

La Cirrosi Biliare Primitiva (CBP)

La cirrosi biliare primitiva è una malattia del fegato di tipo

autoimmune, di cui non si conosce ancora la precisa eziopatogenesi,

che colpisce maggiormente le donne tra i 35 a 60 anni45. Dal punto di

vista istologico, è caratterizzata da infiammazione portale con

progressiva distruzione dei dotti biliari intraepatici e successiva

fibrosi, cirrosi e fallimento epatico46. Tali alterazioni si presentano con

un grado di severità e con una velocità di progressione differente da

paziente a paziente. L’evoluzione della patologia comporta la

progressiva perdita dei dotti biliari intraepatici con la successiva

riduzione della secrezione biliare e la mancata eliminazione di

sostanze tossiche dal fegato responsabili di un ulteriore danno

epatico. La cronicità del processo patologico determina

progressivamente fibrosi e conseguente cirrosi epatica con

l’evoluzione finale verso l’insufficienza epatica46.

18

La cirrosi biliare primitiva può essere suddivisa in quattro stadi non

sempre nettamente distinguibili e, possono essere

contemporaneamente presenti quadri istologici imputabili a tutti gli

stadi46,47.

Nel I stadio (stadio colangitico), le alterazioni interessano soprattutto i

dotti biliari interlobulari e l’epitelio biliare si presenta danneggiato. Gli

spazi portali coinvolti sono allargati e infiltrati da cellule infiammatorie.

Gli epatociti risultano scarsamente interessati dal processo in atto e

mancano i segni di colestasi21,48.

Nel II stadio (stadio della proliferazione duttulare), ha inizio la sclerosi

delle pareti dei dotti biliari interlobulari; caratterizzata dalla inefficace,

proliferazione dei dotti biliari; in questo stadio sono inoltre evidenti i

segni di colestasi intralobulare18,48.

Il III stadio (stadio della fibrosi o precirrotico) è caratterizzato dalla

riduzione della flogosi periportale e periduttale e dalla progressiva

comparsa di fibrosi inter- e perilobulare con l’iniziale formazione di

setti senza rigenerazione nodulare; la progressiva distruzione ed

ostruzione dei dotti interlobulari è responsabile della gravità della

colestasi.

Il IV stadio (stadio cirrotico) è il solo stadio in cui il termine cirrosi

biliare è appropriato ed è istologicamente caratterizzato dalla

progressione ed all’aggravarsi della fibrosi con la comparsa di

fenomeni rigenerativi epatocellulari sotto forma di noduli; noduli che

conferiscono all’organo un aspetto simil cirrotico o francamente

cirrotico. Inoltre, caratteristica fondamentale di questo stadio è la

duttopenia che si presenta particolarmente marcata con una drastica

riduzione dei dotti biliari interlobulari19,20,29,43; Nella maggior parte dei

casi, la PBC progredisce lentamente, anche se l’età avanzata, gli

elevati livelli sierici di bilirubina, la diminuzione di quelli dell’albumina

19

insieme allo sviluppo di cirrosi, possono contribuire ad accorciare la

sopravvivenza del paziente. Farmaci immunosoppressivi e anti-

infiammatori vengono utilizzati per il trattamento di questa

colangiopatia, basandosi sulla sua patogenesi autoimmune, ma una

cura soddisfacente per la completa risoluzione della malattia ancora

non è disponibile. Ad oggi, solo l’acido ursodeossicolico contribuisce

a prevenire o ritardare la necessità di un trapianto di fegato49.

Il Colangiocarcinoma

Il colangiocarcinoma o carcinoma colangiocellulare (CCA) è un

tumore altamente maligno che si sviluppa dalla trasformazione

maligna di colangiociti intra o extraepatici con prognosi devastante.

Tenendo conto della sede da cui origina, il colangiocarcinoma può

essere classificato in extraepatico ed intraepatico. La forma

extraepatica interessa il coledoco o i dotti epatici. La forma

intraepatica origina dai dotti biliari intraepatici e si presenta

generalmente come lesione epatica occupante spazio. E’ una delle

neoplasie a prognosi più infausta; infatti, la sopravvivenza media è

del 7-8% a 5 anni dalla diagnosi50.

Il colangiocarcinoma, inoltre, è una neoplasia per la quale in tutto il

mondo è segnalato un progressivo incremento di incidenza e

prevalenza51. La forma extraepatica è la più comune con una

frequenza che va dall’80% al 90%. Nella maggior parte dei casi, il

colangiocarcinoma si presenta senza evidenti fattori causali. Tuttavia,

in una minoranza di casi, sono noti fattori di rischio quali precedenti

condizioni predisponenti, abitudini e stili di vita oppure esposizioni a

fattori ambientali che aumentano la probabilità di sviluppare il

tumore51,52. In particolare, tutti i principali fattori di rischio identificati

hanno in comune un processo di infiammazione cronica delle vie

20

biliari e tra questi abbiamo:

colangite sclerosante primitiva : una malattia nella quale i dotti biliari

intraepatici ed extraepatici si presentano “stenotici” in seguito ad un

quadro infiammatorio cronico che provoca la formazione di tessuto

cicatriziale; tale restringimento ostacola il deflusso della bile che si

accumula nel fegato, danneggiando ulteriormente le sue cellule25,28;

malformazioni cistiche delle vie biliari (malattia di Caroli e cisti

coledociche): determinano un reflusso e una stasi delle secrezioni

biliari e pancreatiche con la conseguente formazione di calcoli e

possibile superinfezione batterica25,28.

infestazioni parassitarie : frequente nei Paesi Orientali, di solito

determinata dal parassita Fascicola Epatica che è collegata al

consumo di pesce crudo o poco cotto ed è responsabile della

cosiddetta colangioepatite d’Oriente28,53.

cirrosi epatica : caratterizzata da degenerazione e rigenerazione

nodulare del fegato; è più frequentemente dovuta ad abuso di alcol

oppure all’infezione cronica da virus dell'epatite B (HBV) o C (HCV)

oppure ad alcune rare malattie ereditarie del metabolismo, come

l'emocromatosi, la tirosinemia, il deficit di alfa-1 tripsina,

l'ipercitrullinemia, la glicogenosi e il morbo di Wilson28,53.

litiasi biliare: caratterizzata dalla formazione di calcoli di dimensioni

variabili da pochi millimetri a qualche centimetro all’interno della

colecisti. E’ una patologia a maggiore diffusione nel sesso

femminile in associazione spesso a gravidanze multiple, obesità o

drastici cali ponderali54,55.

esposizione ad agenti fisici e chimici : in particolare radon, asbesto,

thorotrast, nitrosammine e diossina28,53;

obesità: è considerata fattore di rischio per lo sviluppo del

colangiocarcinoma extraepatico28,53;

21

fumo di tabacco: non può essere considerato un fattore di rischio

per la popolazione generale, ma è associato allo sviluppo di

colangiocarcinoma in pazienti con PSC28,53.

A tutt’oggi, scarse sono le conoscenze sulla biologia del

colangiocarcinoma, in particolare delle alterazioni genetiche che

potrebbero essere alla base del colangiocarcinoma. L'identificazione

di difetti genetici associati allo sviluppo di tumore potrebbe permettere

di identificare individui ad alto rischio (ad esempio pazienti con CSP a

rischio di sviluppare colangiocarcinoma) o di fare uno screening sui

familiari di pazienti con tumore. Questo potrebbe aggiungere

informazioni prognostiche ai metodi tradizionali per la stadiazione dei

pazienti e per migliorare la predittività dell'andamento clinico della

malattia28,53.

Il colangiocarcinoma è un adenocarcinoma che come già detto ha

origine dall’epitelio delle vie biliari e nelle forme ben differenziate

ricorda assai da vicino i dotti biliari28,53. E’ possibile trovare muco nei

citoplasmi delle cellule tumorali e nei lumi simil-ghiandolari; talvolta la

diagnosi differenziale rispetto a metastasi epatiche da

adenocarcinomi dell’intestino può essere assai ardua. Una

caratteristica importante dal punto di vista differenziale è

rappresentata dalla ricchezza di connettivo fibroso, questo può talora

conferire al tumore un aspetto scirroso, ed è responsabile della

notevole consistenza della massa neoplastica. Più del 90% dei

colangiocarcinomi sono ben differenziati e sono classificati come

adenocarcinomi mucino-secernenti56.

Macroscopicamente il colangiocarcinoma può presentarsi come

tumore sclerosante, nodulare, misto o come tumore papillare. Il

colangiocarcinoma papillare è associato ad una prognosi migliore. La

sopravvivenza è in relazione al grado di differenziazione tumorale,

22

certamente un colangiocarcinoma ben differenziato ha una

sopravvivenza maggiore (più di 10 mesi), di un colangiocarcinoma

anaplastico che ha una sopravvivenza inferiore a 2 mesi. Studi

recenti hanno dimostrato una peggiore prognosi nei giovani con età

inferiore ai 40 anni che non nei pazienti anziani, dopo la resezione di

un colangiocarcinoma intraepatico57,58. Il colangiocarcinoma ha un’alta

frequenza di metastasi a distanza. Queste si hanno prevalentemente

per via linfatica, con diffusione ai linfonodi dell’ilo epatico e di altre

stazioni addominali e toraciche.

I segni e i sintomi clinici di presentazione del colangiocarcinoma

dipendono dalla sede del tumore. L’ittero è frequentemente un segno

iniziale dei tumori delle vie biliari extraepatiche mentre è meno

frequente nei pazienti con colangiocarcinoma intraepatico. Altre

presentazioni cliniche comuni in caso di ostruzione biliare sono: le

feci poco colorate e cretacee, le urine di colore scuro, il prurito;

inoltre, segni clinici tipici sono l’aumento del volume del fegato, anche

sotto forma di massa nella regione addominale superiore destra

talora associata a dolore, la perdita di peso e la febbre58. La diagnosi

di colangiocarcinoma non risulta sempre semplice, specie quando

vengono a mancare le manifestazioni tipiche (ittero, dolore,

alterazione di feci e urine ipercromiche) che allarmano il paziente e lo

inducono a rivolgersi al medico e a sottoporsi agli accertamenti del

caso. Nel sospetto di presenza di una neoplasia delle vie biliari

occorre effettuare una serie di esami clinici, ematici e strumentali che

consentano di giungere a una rapida e corretta diagnosi di conferma

o di esclusione della malattia oncologica. Tra gli esami di laboratorio

risulta utile il dosaggio della bilirubina, della fosfatasi alcalina, della

glutamiltrasferasi, nonché dei marcatori tumorali CEA e soprattutto

CA 19.9, i cui valori sembrano importanti anche per escludere residui

23

di tessuto tumorale dopo l’exeresi chirurgica, per documentare

un’iniziale recidiva della malattia o per valutare gli effetti delle terapie

mediche, in particolar modo della chemioterapia58.

Scarse sono le conoscenze sulla biologia del colangiocarcinoma il

quale è caratterizzato da una notevole resistenza ai comuni

chemioterapici tanto che allo stato attuale sembrano scarsi i

trattamenti in grado di migliorare la prognosi di questa neoplasia.

Anche a causa della mancanza di sufficiente conoscenza dei

meccanismi intracellulari che regolano la crescita del

colangiocarcinoma, non sembrano esistere ancora per questa

neoplasia trattamenti efficaci59. Alla base dello sviluppo e della

crescita del colangiocarcinoma c'è molto probabilmente uno squilibrio

tra i meccanismi che regolano la proliferazione dei colangiociti e quelli

che ne regolano l'apoptosi60,61, squilibrio che porta ad una crescita

non controllata delle cellule neoplastiche. Come già descritto, la

proliferazione dei colangiociti è regolata da numerosi fattori tra cui

ormoni (secretina, gastrina), neuropeptidi (somatostatina, dopamina,

acetilcolina), fattori di crescita e sali biliari60.

Tuttavia, il ruolo di queste sostanze nella patogenesi e nella

modulazione della proliferazione del colangiocarcinoma e delle

colangiopatie in genere è poco nota. Alcuni studi sembrano suggerire

che neuropeptidi ed ormoni possano svolgere un ruolo importante

nella biologia del colangiocarcinoma e delle colangiopatie62,63.

Grande risalto è stato dato al ruolo degli ormoni sessuali nella

regolazione della proliferazione maligna e non dei colangiociti64,65. In

particolare, è noto che gli estrogeni svolgano un ruolo importante nel

favorire la proliferazione delle cellule neoplastiche che ne esprimono i

recettori.

Gli estrogeni potrebbero agire sulla proliferazione delle cellule

24

neoplastiche anche potenziando l'effetto di ulteriori fattori di crescita64.

Tra i fattori di crescita, l'IGF1 ha un ruolo chiave nella patogenesi

neoplastica come dimostrato dalla stretta correlazione tra i suoi livelli

nel sangue e la rapidità di crescita di numerosi tumori65,66. Infine,

recentemente grande risalto è stato dato al ruolo della melatonina

nella patogenesi tumorale e delle colangiopatie63,67.

MelatoninaLa melatonina è un ormone secreto prevalentemente dalla ghiandola

pineale9 e da altri tessuti come ad esempio quelli del tratto

gastrointestinale dove agisce da regolatore locale della crescita63. La

melatonina è sintetizzata a partire dal triptofano da quattro enzimi:

triptofano idrossilasi (TPH), aromatico aminoacido decarbossilasi

(AADC), serotonina N-acetiltransferasi (AANAT) e acetilserotonina O-

metiltransferasi (ASMT)63,68. Essa esercita i suoi effetti interagendo

con due recettori di membrana legati a proteina G, il recettore 1A e

1B della melatonina (MT1 e MT2) modulando secondi messaggeri

intracellulari come il cAMP, molecola chiave nella regolazione delle

funzioni dei grandi colangiociti, e il Ca2+, un importante molecola di

segnale in grado di regolare le funzioni dei piccoli colangiociti16. Infatti

è stato visto che l’interazione della melatonina con il proprio recettore

inibisce i livelli di cAMP in svariati tipi di cellule incluse le cellule

pancreatiche di ratto55. I recettori della melatonina sono presenti a

livello del sistema nervoso centrale69 così come in alcuni tessuti

periferici compreso il piccolo intestino e gli epatociti70,71. Nel fegato la

melatonina riduce il danno ossidativo, attenua la proliferazione e

stimola l’apoptosi degli epatociti in ratti sottoposti ad epatectomia

parziale72. La melatonina migliora la fibrosi epatica e lo stress-

ossidativo sistemico in ratti BDL colestatici52,73. Scarse sono le

25

informazioni riguardo il ruolo ed i meccanismi d’azione tramite cui la

melatonina modula l’iperplasia biliare nei ratti colestatici. La

melatonina regola inoltre la mitosi cellulare modulando il ritmo

circadiano che a sua volta è regolato da un set di Clock genes: Period

1, 2, e 3 (PER1–3); Cryptochrome 1 e 2 (CRY1 e CRY2); CLOCK;

BMAL1 e BMAL274. Per esempio è stato visto che la melatonina ha

azione antiproliferativa nel tumore della mammella in quanto è in

grado di risincronizzare i Clock genes65. Diversi studi hanno

dimostrato che la secrezione di melatonina è compromessa in

pazienti affetti da tumore della mammella, tumore dell’endometrio e

tumore del colon retto67,75,76, suggerendo che ridotti livelli di

melatonina sono legati all’aumentata incidenza di diversi tipi di

tumore. Tuttavia non esistono dati riguardo il ruolo della melatonina

come regolatore autocrino della crescita del colangiocarcinoma. E’

stato inoltre dimostrato che la melatonina svolge azione

chemoprotettiva nel CCA indotto dall’infezione da O. viverrini,

riducendo i danni ossidativi del DNA77. Tuttavia, è ancora sconosciuto

l’esatto ruolo della melatonina nella fisiologia delle vie biliari e nella

patogenesi del colangiocarcinoma e delle colangiopatie umane come

la Cirrosi Biliare Primitiva.

SCOPI DEL PROGETTO DI RICERCAGli scopi del presente progetto di ricerca sono stati:

26

valutare l’espressione ed il ruolo della melatonina, dei suoi

recettori e dei Clock genes (CLOCK, BMAL1, PER1 e CRY1) nel

fegato normale ed in corso di colestasi nel ratto;

valutare l’espressione ed il ruolo di AANAT, l’enzima chiave della

sintesi della melatonina, e gli effetti della sua modulazione in vivo

ed in vitro sulla proliferazione colangiocitaria nel fegato normale ed

in corso di colestasi nel ratto;

valutare il ruolo della melatonina nella regolazione della crescita

colangiocitaria.

valutare l’espressione della melatonina e dei suoi recettori nei

colangiociti di fegato umano normale ed in corso di cirrosi biliare

primitiva;

valutare il ruolo della melatonina nella evoluzione del

colangiocarcinoma

MATERIALI E METODIModello sperimentaleIn questo progetto sono stati utilizzati frammenti epatici provenienti da

ratti Wistar di sesso maschile suddivisi in:

ratti normali: n=8;

ratti BDL (legatura delle vie biliari per 1 settimana): n=8;

ratti normali e BDL trattati con melatonina (2 mg/g di peso

corporeo per 1 settimana): n=8;

ratti Normali e BDL trattati con AANAT mismatch e AANAT Vivo

Morpholino per una settimana: n=8;

Topi Balb nude (nu/nu) di sei settimane.

I ratti normali e BDL,di ceppo Fischer (peso compreso tra150 e 175

gr) maschi sono stati acquistati dalla Charles River (Wilmington, MA)

27

e sono stati mantenuti in un ambiente a temperatura costante di 22°C

con un ciclo luce-buio di 12 ore ed alimentati ad libitum con cibo

standard per ratti e con libero accesso all’acqua o ad acqua

contenente melatonina (20 mg/l corrispondente ad un introito di

melatonina di 2 mg/g di peso corporeo al giorno) per una settimana.

Allo stesso tempo, ratti normali e BDL, sono stati trattati con

sequenze di AANAT Vivo-Morpholino (5’-

GTTCCCCAGCTTTGGAAGTGGTCCC, per ridurre l’espressione

epatica di AANAT) o mismatched Morpholino (5’-

GTTCCCGACCTTTGCAACTCGTCCC) (Gene Tools LCC,

Philomath, OR) per 1 settimana attraverso un catetere impiantato

nella vena porta. La procedura chirurgica per l’impianto del catetere in

vena porta (tramite cui AANAT Vivo-Morpholino o Morpholino

mismatched sono stati somministrati) è stata effettuata da Charles

River. La procedura per l’impianto del catetere è descritta in dettaglio

al link della Charles River,

http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rmssrportalveincath.p

df.

Prima di ogni procedura sperimentale, gli animali sono stati

anestetizzati con sodio pentobarbital (50 mg/kg di peso, IP) secondo

le locali regolamentazioni. Da tutti gli animali trattati sono stati

collezionati frammenti epatici e i colangiociti purificati attraverso la

tecnica di separazione per immunoaffinità usando un anticorpo

monoclonale di topo gentilmente concesso dal Dr. R. Faris della

Brown University, Providence, RI che riconosce un antigene di

membrana non identificato, espresso da tutti i colangiociti

intraepatici42. La sopravvivenza cellulare e la conta è stata eseguita

usando Tripan blue.

Sono stati inoltre utilizzati topi maschi di 8 settimane BALB/c nudi

28

(nu/nu), forniti dalla Taconic Farms (German town, NY) stabulati a

una temperatura costante di 20-22 °C e sottoposti a cicli luce/buio di

12 ore con libero accesso ad acqua e cibo. Le cellule della linea

cellulare Mz-ChA-1 di colangiocarcinoma sono state poste in

sospensione in 0,5 ml di extracellular matrix gel (Sigma-Aldrich) ed

iniettate nel tessuto sottocutaneo dei suddetti topi. Dopo due

settimane dall’impianto delle cellule tumorali i topi sono stati divisi in

due gruppi:

Gruppo 1 (n=6): topi trattati con una soluzione di NaCl allo 0,9%

iniettata nella massa tumorale per 43 giorni;

Gruppo 2 (n=6): topi trattati con melatonina (4 mg/kg di peso

corporeo) iniettata nella massa tumorale per 43 giorni.

Le dimensioni del tumore sono state misurate immediatamente prima

del trattamento con un compasso elettronico e sono state espresse in

mm3. Dopo 43 giorni i topi sono stati anestetizzati con pentothal e

sacrificati in accordo con le linee guida.

Inoltre, sono stati ottenuti frammenti epatici dai topi BALB/c nudi

(nu/nu) trattati con NaCl allo 0,9% o con melatonina (4 mg/kg di peso

corporeo) per 43 giorni al fine di controllare gli effetti della melatonina

sul fegato normale.

Biopsie umaneSono stati inclusi in questo lavoro frammenti epatici umani suddivisi

nei seguenti gruppi:

Frammenti di fegato umano normale (n = 6) provenienti da donatori

per il trapianto epatico;

Frammenti di massa tumorale proveniente da pazienti con lesioni

adenocarcinomatose a livello delle vie biliari e con la diagnosi

finale di colangiocarcinoma (n=12);

29

6 biopsie provenienti da pazienti di sesso femminile con cirrosi

biliare primitiva in stadio IV sono state ottenute dal fegato

espiantato in seguito a trapianto epatico.

Espressione di MT1, MT2, CLOCK, BMAL1, CRY1, PER1 e AANAT

in sezioni di fegato, colangiociti isolati e colangiocarcinoma.

La presenza di MT1, MT2, CLOCK, BMAL1, CRY1, PER1 e AANAT è

stata valutata tramite: (i) immunoistochimica su sezioni di fegato

proveniente dai gruppi di animali trattati in vivo e, (ii) real-time PCR

sull’RNA totale proveniente dai colangiociti purificati da tutti i gruppi

sperimentali. L’espressione della melatonina e dei suoi recettori è

stata valutata tramite immunoistochimica anche sulle biopsie umane

di CCA. I frammenti di parenchima epatico, immediatamente dopo il

prelievo, sono stati fissati per immersione in formalina tamponata al

10% per 24 ore a temperatura ambiente.

Successivamente sono stati sottoposti alle procedure di inclusione in

paraffina che prevedono disidratazione del frammento in etanolo a

concentrazioni crescenti, diafanizzazione in xilolo e conseguente

inclusione in paraffina a basso punto di fusione (56°C). Sono, quindi,

state effettuate sezioni dello spessore di 3-4 μm, poste su vetrini

precedentemente trattati con L-polilisina allo 0,1% e, dopo

sparaffinatura in xilolo e idratazione in alcool a concentrazioni

decrescenti sono state trattate con perossido d’idrogeno al 2,5% in

metanolo per 30 minuti al fine di bloccare l’attività della perossidasi

endogena. Dopo lavaggio in tampone fosfato salino (PBS) a pH 7.4, i

preparati sono stati incubati overnight a 4°C con anticorpi primari

specifici per: MT1 (Santa Cruz, sc-13179, 1:50), MT2 (Santa Cruz,

sc-13177, 1:50), AANAT (Santa Cruz, sc-68346, 1:100), CLOCK

(Santa Cruz, sc-25361, 1:50), BMAL1(Santa Cruz, sc-8550, 1:50),

30

CRY1 e PER1 rispettivamente ((Santa Cruz, sc-5953, e sc-7724

1:50). Successivamente le sezioni sono state incubate con

l’appropriato anticorpo secondario biotinilato e con il complesso

streptavidina-HRP. L’avvenuta reazione è stata infine sviluppata

mediante l’utilizzo di 3,3’-diaminobenzidina (DAB).I controlli negativi

sono stati ottenuti omettendo l’Ab primario. Le osservazioni sono

state effettuate con un microscopio ottico BX-51 (Olympus, Tokyo,

Japan) dotato di videocamera (Spot Insight; Diagnostic Instrument,

Inc., Sterling Heights, MI) e processate con un programma di analisi

delle immagini (IAS. Delta Sistemi, Rome, Italy). In aggiunta, abbiamo

valutato l’espressione del messaggio di MT1, MT2, CLOCK, BMAL1,

CRY1, PER1 e AANAT nei colangiociti purificati usando RT2 Real-

Time assay da SuperArray (Frederick, MD)16. L’RNA totale è stato

estratto dai colangiociti (1x105) con RNeasy Mini kit (Qiagen Inc.,

Valencia, CA) e reverso con Reaction Ready TM First Strand cDNA

synthesis kit (SuperArray, Frederick, MD). Ad 1 μl del template sono

stati aggiunti 12,5 μl di SYBR Green PCR master mix, 10,5 μl di

acqua distillata e 1 μl di RT2 PCR primer (Superarray, Frederick, MD)

specificamente designato per l’mRNA di MT1, MT2, CLOCK, BMAL1,

CRY1, PER1 e AANAT e del gene di controllo (GAPDH). Il plate è

stato posto nel realtime thermal cycler (MX30005P, Strata gene) e

fatto correre a 95°C per 10 minuti e poi per40 cicli a 95°C per 15

secondi e a 60°C per 1 minuto. I dati sono stati espressi come livelli di

mRNA relativo ± SEM di ciascuno dei fattori analizzati su GAPDH. In

aggiunta a questi dati, sono stati eseguiti anche immunoblots sugli

stessi colangiociti per verificare l’espressione dei recettori MT1 e MT2

ed AANAT. Le cellule sono state solubilizzate in lysis buffer

contenente: 15 mM Tris HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, Ig

epal 1%, 2 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluorite), 2

31

mMbenzamidina e 1% aprotina in ghiaccio per 30 minuti. Dopo una

breve sonicazione i campioni sono stati centrifugati a 10.000 g per 20

secondi a 4ºC; del supernatante è stata determinata la

concentrazione delle proteine mediante BIORAD Protein Assay-Dye

Reagent (BIO-RAD Laboratories GmbH). Così 10 μg di lisato totale di

colangiociti puri sono stati diluiti in 6x LSB (Laemly sample buffer)

contenente 0.3M 2-mercaptoethanolo e blu di bromofenolo e

sottoposti a SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) in

gel al 4-12%. Successivamente è stato effettuato il trasferimento su

nitrocellulosa e le proteine di interesse visualizzate utilizzando

anticorpi primari specifici. Infine gli immunoblots sono stati

normalizzati confrontando gli immunoblots della β-actina (house

keeping protein)78. L’intensità delle bande è stata determinata con un

densitometro a scansione video (Storm 860, GE Healthcare,

Piscataway, NJ) ed analizzata con un software ImageQuant TL

versione 2003.02 (GE, Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire,

England).

Effetto della melatonina e della down-regolazione di AANAT sulla

proliferazione e sull’apoptosi colangiocitaria

Per valutare la massa biliare è stato effettuato uno studio

immunoistochimico in tutti i gruppi sperimentali per la citocheratina 19

(CK-19), un marker specifico dell’epitelio biliare. La colorazione è

stata eseguita come precedentemente indicato, utilizzando come

anticorpo primario l’anti-CK-19 (Santa Cruz biotechnologies, Inc; sc-

33120; 1:50).Parallelamente alla crescita colangiocitaria abbiamo,

anche valutato l’apoptosi delle stesse cellule dopo i diversi trattamenti

in vivo. Per far ciò è stato utilizzato il metodo Tunel (terminal deoxy

nucleotidyl transferase-mediated triphosphate end-labeling) (ApoTag

32

kit),secondo le indicazioni suggerite dal produttore. I controlli negativi

sono stati eseguiti tramite incubazione con un adeguato siero non

immune al posto dell’anticorpo primario ed hanno mostrato

un’assenza dell’immunoreazione. Le immagini sono state acquisite

con microscopio ottico (precedentemente descritto), per poi essere

analizzate con il sistema di elaborazione d’immagine IAS 2000 (Delta

Sistemi, Roma) al fine di quantificare la massa biliare e l’apoptosi.

Pathway intracellulare su cui agisce la melatonina

In accordo con altri studi44,79 abbiamo misurato i livelli intracellulari di

cAMP basali e indotti dalla stimolazione per 5 minuti con secretina.

Poiché l’aumento dei livelli di cAMP dopo secretina sono stati

dimostrati essere associati a cambiamenti nella proliferazione e

secrezione di un gran numero di epiteli, incluso quello biliare40,68.

Così, dopo l’isolamento, i colangiociti sono stati incubati per 1 ora a

37°C per permettere la rigenerazione delle proteine di membrana

danneggiate dagli enzimi proteolitici delle tecniche di isolamento delle

cellule45. Di seguito, le cellule (1x105) sono state stimolate a

temperatura ambiente per 5 minuti con 0,2% di BSA (basale) o con

secretina (100 nmol/L). In ciascun trattamento è stato aggiunto 3-

isobutilmetilxantine, un inibitore della fosfodiesterasi per prevenire la

degradazione del cAMP. Infine, i livelli di cAMP (espressi in mol per

105 cellule) sono stati misurati attraverso un kit commercialmente

disponibile (cAMP [125I] Biotrak Assay System, RPA509). In aggiunta

a questi dati, sono stati eseguiti anche immunoblots come

precedentemente descritto sugli stessi colangiociti per verificare la

fosforilazione di alcune proteine che appartengono al pathway del

cAMP, come PKA.

33

Valutazione dei livelli sierici di melatonina, transaminasi e bilirubina

totale

I livelli sierici di transaminasi e di bilirubina totale sono stati valutati

usando un sistema bidimensionale RxLMax Integrated Chemistry

system (Dade Behring, Deerfield, IL) dal Chemistry Department, Scott

& White. I livelli sierici di melatonina sono stati misurati tramite ELISA

kits (Genway, San Diego, CA).

Espressione di melatonina, MT1, MT2 e AANAT nelle biopsie umane

In questo caso, i frammenti di tessuto epatico umano sono stati fissati

in formalina e trattati come precedentemente descritto. La valutazione

dell’espressione di melatonina, MT1, MT2 e AANAT è stata effettuata

tramite immunoistochimica utilizzando la metodica e gli anticorpi

precedentemente descritti.

Studio in vitro:

Linee cellulari

La prima linea cellulare che abbiamo preso in considerazione è stata

quella dei grandi colangiociti di topo (LMC). Tali cellule sono state

sviluppate e caratterizzate come precedentemente descritto80 e

mantenute in coltura a 37°C e CO2 al 5% in 0,1 mM di soluzione

MEM di aminoacidi non essenziali con aggiunta di L-glutammina (20

nM), 100 U/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina e siero fetale

bovino al 5%. Le altre due linee cellulari che abbiamo usato sono di

origine umana: la H69 di colangiociti non maligni gentilmente

concesseci dal Dr. GJ Gores della Mayo Clinic, Rochester MN46.

Queste cellule sono state mantenute a 37°C con CO2 al 5% nel

Dulbecco’s modified Eagle’s medium Ham’s F-12 nutrientmixture

(CambrexBio Science, Walkersville, MD), con aggiunta di adenina

34

(1,8x10-4 mol/L), insulina (5 μg/ml), transferrina (5 μg/ml),

triiodiotironina (2x10-9 mol/L), idrocortisone (1,1x10-6 mol/L), EGF

(1,64x10-6 mol/L), epinefrina (5,5x10-6 mol/L), siero fetale bovino al

10%, 100 U/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina. L’altra linea

immortalizzata umana che abbiamo usato è stata la linea cellulare di

colangiocarcinoma Mz-ChA-1 (da colecisti umana)47 gentilmente

concessa dal Dr. G. Fitz (University of Texas Southwestern Medical

Center, Dallas, TX). Queste cellule sono state mantenute a 37°C con

CO2 al 5% nel CMRL 1066 al 10%, con aggiunta di siero fetale

bovino al 10%, 100 U/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina e

L-glutammina (20 nM).

Melatonina e proliferazione delle linee cellulari

Innanzitutto abbiamo testato in tutte e tre le linee cellulari la presenza

della melatonina e dei suoi recettori attraverso real-time PCR e

immunofluorescenza. In aggiunta a questo, abbiamo anche valutato

la diversa presenza del messaggio dei recettori MT1 e MT2 tramite

real-time PCR come precedentemente visto. Le diverse cellule sono

state seminate su un vetrino coprioggetto in un 6-well plate (500.000

cellule per well) e fatte aderire per tutta la notte. Successivamente, i

vetrini coprioggetto sono stati trasferiti in un nuovo 6-well plate

contenente PBS freddo. Trascorsi 5 minuti sono stati lavati per 3 volte

con PBST (PBS con 0,2% di Triton X) e incubati per 1 ora in BSA al

4% in PBS. Quando la soluzione bloccante è stata rimossa, i vetrini

coprioggetto sono stati incubati a 4°C con l’anticorpo primario anti-

MT1 e MT2 (gli stessi usati per l’immunoistochimica) diluito in BSA

1%. Il giorno successivo le cellule sono state lavate 3 volte con PBST

prima di essere incubate con l’appropriato anticorpo secondario

legato a Cy3 (Jackson Immunochemicals, West Grove, PA; 1:50) per

35

2 ore in camera oscura. Dopo di che, i vetrini sono stati lavati con

PBST, per poi essere montati su regolari vetrini con 4,6-diamino-2-

phenilindole (DAPI) come contrastante nucleare (Molecular Probes,

Eugene, OR). Le immagini sono state acquisite usando un

microscopio confocale Olympus IX-71. La proliferazione dopo

stimolazione con melatonina 10-11 M è stata valutata tramite un kit

colorimetrico che evidenzia il numero di cellule biologicamente attive

(MTS assay, Cell Titer 96AQueous; Promega Corp., Madison, WI) e il

numero di cellule è stato valutato mediante assorbanza a 490 nm. Di

seguito alla tripsinizzazione, le cellule sono state seminate in un 96-

well plate (10.000 per well) per un volume finale di 200 μl di medium e

fatte aderire overnight. Successivamente all’adesione, è stato

cambiato il medium con uno privo di siero al fine di “affamare” le

cellule, dopo 24 ore i plates sono stati stimolati con siero bovino

(BSA) al 0,2% o melatonina con concentrazione di 10-11 M a 37°C per

48 ore, prima di valutare la crescita cellulare tramite 3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4sulfophenyl)-

2H-tetrazolium, inner salt (MTS) saggio di proliferazione. In

esperimenti separati, le stesse cellule sono state incubate con BSA

0,2% o melatonina 10-11 M per 48 ore in assenza o presenza di una

preincubazione di 1 ora con 4-P-PDOT (MT2 antagonista) o

luzindolo(10 μM)81,82, prima di verificare la proliferazione tramite

immunoblots per valutare l’espressione del PCNA, uno dei marker di

proliferazione cellulare più utilizzati.

Overespressione di AANAT nei grandi colangiociti di topo e nella

linea cellulare di colangiocarcinoma

36

Il ruolo di AANAT nella proliferazione delle LMC e di Mz-ChA-1 è

stato dimostrato tramite subcloni in cui abbiamo aumentato

l’espressione di questo enzima. Tali nuove linee cellulari sono state

stabilite usando AANAT cDNA clone vector da OriGene

Technologies, Inc. (Rockville, MD) per l’AANAT che conferiscono

anche la resistenza alla geneticina, per la selezione di cellule

stabilmente trasfettate. Il clone selezionato con il piu’ alto grado di

espressione di AANAT (chiamato LMC-AANAT) e (AANAT

overexpression nel caso della linea di CCA) è stato fatto proliferare

insieme al controllo non trasfettato con plasmidi (chiamato MCL-puro

o control vector) per poter eseguire immunoblots per PCNA ed MTS

come precedentemente descritto.

Analisi statistica

I dati sono stati espressi come media ± standard error (ES). L’analisi

statistica è stata effettuata mediante il t-test quando sono stati

analizzati due gruppi, e l’ANOVA quando sono stati analizzati più di

due gruppi. Un p-value< 0.05 è stato considerato statisticamente

significativo.

37

RISULTATII colangiociti esprimono i recettori MT1 e MT2 della melatonina,

CLOCK, BMAL1, CRY1, PER1 e AANAT

Lo studio immunoistochimico sulle sezioni di fegato ha messo in

evidenza che i dotti biliari di ratto normale sono debolmente positivi

per MT1 (ma non per MT2), invece una forte positività per entrambe i

recettori MT1 e MT2 è stata osservata in seguito a BDL (Figura 1 A ).

CLOCK e BMAL1 non sembrano espressi nei dotti biliari di ratti

normali, tuttavia, la loro espressione è stata rilevata nei dotti biliari in

seguito a legatura dei dotti biliari (Figura 1B). I colangiociti di ratto

normale esprimono PER1 e CRY1, la cui espressione aumenta

debolmente nei dotti biliari di ratto BDL (immagini non mostrate).

L’analisi effettuata tramite real-time PCR conferma l’aumento

dell’espressione di PER1, BMAL1, CRY1, e CLOCK nel BDL rispetto

al normale ma mostra anche la diminuzione dell’espressione di questi

mRNA in colangiociti di ratti normali e BDL trattati in vivo con la

melatonina rispetto ai colangiociti di controllo93. L'espressione del

mRNA di MT1 e MT2 risulta aumentata nel BDL rispetto ai

colangiociti normali e diminuita nei colangiociti di ratti BDL trattati in

vivo con la melatonina rispetto ai colangiociti di controllo93. Lo studio

immunoistochimico sulle sezioni di fegato ha mostrato che AANAT è

espresso dai colangiociti sia nel ratto normale che nel BDL (Figura 2

e Figura 3). L’espressione di AANAT aumenta nei dotti biliari dei ratti

BDL se paragonata ai ratti normali, e nei ratti BDL trattati con

melatonina se paragonati ai ratti BDL (Figura 2). Gli epatociti di ratto

normale sono negativi per AANAT, invece nel ratto BDL alcuni

epatociti mostrano una lieve positività per AANAT (Figura 2 e Figura

3). L’espressione di AANAT diminuisce nel fegato di ratto normale e

BDL trattati con AANAT Vivo-Morpholino se paragonata ai controlli

38

(Figura 3). Anche l’espressione della CK-19 aumenta nel normale e

nel BDL in seguito al trattamento con AANAT Vivo-Morpholino se

paragonata ai controlli (immagini non mostrate).Inoltre, tramite

l’immunoistochimica abbiamo dimostrato l’aumento dell’espressione

di AANAT e della melatonina e la diminuzione dell’espressione dei

recettori MT1 e MT2 nei CCA provenienti dai nude mice trattati con

melatonina se paragonati al gruppo controllo94.

Effetti della melatonina e della down-regolazione di AANAT sulla

proliferazione e sulla apoptosi colangiocitaria

La somministrazione di melatonina determina la diminuzione della

massa biliare (IBDM) nei ratti BDL (Figura 4 e Tabella 2) e della

percentuale di colangiociti PCNA positivi se paragonata ai ratti

controllo (Tabella 2). L’inibizione dell’iperplasia colangiocitaria

determinata dalla melatonina nei ratti BDL è stata associata

all’aumento della apoptosi; la melatonina non ha effetti sul fegato di

ratto normale (Tabella 2).

Nelle sezioni di fegato di ratto normale e BDL trattati con AANAT

Vivo-Morpholino si assiste all’aumento della percentuale di

colangiociti PCNA positivi e all’aumento della massa biliare se

paragonata ai ratti di controllo (Figura 5 A-B). Non sono stati osservati

cambiamenti nell’apoptosi biliare tra ratti normali e BDL trattati con

AANAT Vivo-Morpholino e ratti normali trattati con mismatch

Morpholino. Un simile grado di infiammazione portale è stato

osservato in ratti normali e BDL trattati con AANAT Vivo-Morpholino e

ratti controllo.

Inoltre per quanto riguarda il CCA, in seguito a trattamento con

melatonina si assiste ad una significativa diminuzione delle

dimensioni del tumore indotto nei nude mice se paragonati al gruppo

39

di controllo94.

L’esame istologico delle sezioni di tumore, mostra l’aumento della

necrosi nelle sezioni provenienti dai tumori di topi trattati con

melatonina se paragonate con le sezioni provenienti dal gruppo di

controllo94. Abbiamo inoltre dimostrato la diminuzione della

proliferazione del CCA tramite PCNA, e l’aumento della apoptosi

tramite Tunel nelle sezioni di tumore provenienti dai topi trattati con

melatonina se paragonate ai topo controllo94.

Tabella 2. Studio morfometrico di colangiociti positivi per PCNA,

CK19 e TUNEL.

GruppiColangiociti

PCNA-positivi(%)

IBDM(%)

Colangiociti positivi al TUNEL

(%)

Ratti normali 8.161 ± 0,766 0.26 ± 0.06 VN

Ratti normali +melatonina 6.120 ± 0,280 0.23 ± 0.01 VN

Ratti BDL 48.537 ± 1.626 3.957 ± 0.411 5.813 ± 0.201

Ratti BDL + melatonina 40.954 ± 0.733& 1.998 ± 0.161& 7.334 ± 0.196&

I dati sono espressi come media ± ES. VN= virtualmente negativo.& = p<0.01 vs il corrispondente BDL

40

Effetto della melatonina sui livelli intracitoplasmatici di cAMP.

Nei ratti BDL trattati con melatonina, i livelli basali di cAMP sono

ridotti rispetto ai corrispondenti valori dei ratti BDL di controllo93.

Come atteso la secretina aumenta i livelli di cAMP nei grandi

colangiociti di ratti BDL, ma non aumenta i livelli di cAMP nei grandi

colangiociti di ratti BDL trattati con melatonina per una settimana93.

Inoltre nei grandi colangiociti di ratti BDL trattati con melatonina si ha

la ridotta fosforilazione di PKA paragonata al gruppo di controllo93.

Valutazione dei livelli sierici di melatonina, transaminasi e bilirubina

totale

I nostri studi hanno dimostrato che i livelli sierici di melatonina

aumentano in seguito a BDL e dopo la somministrazione di

melatonina sia nei ratti normali che BDL83. I livelli sierici di melatonina

inoltre aumentano nei ratti normali e BDL trattati con AANAT Vivo-

Morpholino rispetto al gruppo di controllo trattato con mismatch

Morpholino (Tabella 3)93.

Sebbene l’espressione colangiocitaria di AANAT diminuisca nei ratti

trattati con AANAT Vivo-Morpholino (Figura 3), l’aumento dei valori

sierici di melatonina è probabilmente dovuto all’aumentata

espressione di AANAT (e susseguente aumento della secrezione di

melatonina) nella ghiandola pineale e nel piccolo intestino nei quali

anche è espresso AANAT84,85.

I livelli sierici di transaminasi aumentano nei ratti BDL e diminuiscono

sia nel normale che nel BDL in seguito a trattamento con melatonina

(Tabella 3). Anche nei ratti BDL trattati con AANAT Vivo-Morpholino

si assiste alla diminuzione dei valori sierici di transaminasi e di

bilirubina totale, confermando il miglioramento della colestasi in

seguito alla down-regolazione di AANAT, probabilmente dovuto

41

all’aumento dei valori sierici di melatonina. Suggerendo quindi

l’esistenza di un pathway paracrino.

Tabella 3. Livelli sierici di melatonina, delle transaminasi e della

bilirubina totale.

ParametriRatti normali +

mismatch Morpholino

Ratti normali + AANAT Vivo-Morpholino

Ratti BDL + mismatch

Morpholino

Ratti BDL + AANAT Vivo-Morpholino

Livelli sierici di melatonina

(pg/ml)70.9 ± 1.1

(n = 5)77.6 ± 2.9a

(n = 5)97.5 ± 2.8b

(n = 5)174.1 ± 11.7c

(n = 5)

SGPT(Units/L)

62.6 ± 7.7(n = 6)

70 ± 1.25(n = 6)

194.4 ± 17(n = 6)

121.2 ± 19*

(n = 6)SGOT

(Units/L)129 ± 7(n = 6)

148 ± 5.1(n = 6)

614.5 ± 68.3(n = 6)

312 ± 52*

(n = 6)ALP

(Units/L)203 ± 6.6

(n = 6)202.8 ± 8

(n = 6)395 ± 9.8

(n = 6)343.2 ± 18.7*

(n = 6)Bilirubina totale

(mg/L)< 0.1

(n = 6)< 0.1

(n = 6)8.7 ± 0.5(n = 6)

7.5 ± 0.6*

(n = 6)

I dati sono espressi come media ± ES.ap<0.05 vs. il corrispondente valore del normale trattato con mismatch Morpholino. bp<0.05 vs. il corrispondente valore del normale trattato con mismatch Morpholino.cp<0.05 vs. tutti gli altri gruppi. *p<0.05 vs. il corrispondente valore del BDL trattato con mismatch Morpholino.

Espressione di melatonina, MT1, MT2 e AANAT nelle biopsie umane

Nella PBC si assiste all’aumento dell’espressione da parte dei

colangiociti sia di AANAT che della melatonina, cosi come

l’espressione dei recettori MT1 e MT2 risulta essere aumentata nella

PBC se paragonata al fegato umano normale (Figura 6).

L’espressione immunoistochimica di AANAT e della melatonina

diminuisce significativamente nelle biopsie di CCA se paragonata ai

controlli (Figura 7). L’espressione dei recettori MT1 e MT2 è

significativamente maggiore nelle biopsie di pazienti con CCA se

paragonata al fegato umano normale (Figura 7).

42

Studio in vitro:

Le linee cellulari esaminate esprimono i recettori MT1 e MT2 della

melatonina e AANAT

Tutte e tre le linee cellulari analizzate e studiate: LMC,H69 e Mz-ChA-

1 esprimono i recettori MT1 e MT2 e l’enzima AANAT93,94.

Effetto della melatonina sulla proliferazione dei grandi colangiociti

Il trattamento con melatonina determina la diminuzione dei valori

intracitoplasmatici di cAMP, diminuzione che è prevenuta dal

Luzindolo (antagonista di entrambe i recettori MT1 e MT2), ma non

dal 4-P-PDOT (specifico antagonista del recettore MT2)93

dimostrando che gli effetti inibitori della melatonina sulla

proliferazione colangiocitaria sono mediati dal recettore MT1. La

melatonina diminuisce inoltre l’espressione del gene e quindi di

conseguenza della proteina del PCNA e la fosforilazione di PKA,

diminuzione che ancora una volta è prevenuta dal Luzindolo ma non

dal 4-P-PDOT93.

Effetto della overespressione di AANAT nei grandi colangiociti di topo

e nella linea cellulare di colangiocarcinoma

Nelle cellule LMC-AANAT si assiste all’aumento dell’espressione di

AANAT e all’aumento della secrezione di melatonina (immagini non

mostrate). Nei colangiociti che overesprimono AANAT, vi è ridotta

proliferazione biliare come mostrato dagli immunoblots per PCNA e

dal test MTS (immagini non mostrate). Anche nelle cellule Mz-ChA-1

che overesprimono AANAT si assiste alla riduzione della

proliferazione94, e alla riduzione dell’espressione di MT1 e MT2 se

paragonate al gruppo di controllo94.

DISCUSSIONE

43

I principali risultati di questo studio, volto a chiarire il ruolo della

melatonina nella proliferazione e sopravvivenza dei dotti biliari in

corso di colestasi sperimentale e umana, hanno messo in evidenza

che: i colangiociti esprimono gli enzimi implicati nella sintesi della

melatonina, i recettori MT1 e MT2 e i Clock genes; il trattamento in

vivo con melatonina determina una parziale inibizione nella

proliferazione dell’epitelio biliare in particolare dopo BDL, inoltre la

ridotta espressione di AANAT tramite il Morpholino in ratti normali e

BDL induce un parziale aumento della proliferazione e

dell’espressione di PCNA. La stimolazione in vitro dei colangiociti di

topo riduce la crescita colangiocitaria, diminuzione che è prevenuta

dal Luzindolo ma non da 4P-PDOT. Anche l’overespressione in vitro

di AANAT determina la diminuzione della crescita colangiocitaria e

dei livelli intracellulari di cAMP dovuti alla maggiore produzione da

parte dei colangiociti di melatonina e quindi molto probabilmente

all’azione autocrina di questa sui colangiociti. Nei nude mice iniettati

con linee cellulari di colangiocarcinoma si assiste alla diminuzione

della massa tumorale in seguito al trattamento con melatonina.

L’overespressione di AANAT nelle cellule Mz-Cha-1 determina la

riduzione della proliferazione. Nella PBC si assiste all’aumento

dell’espressione da parte dei colangiociti sia di AANAT che della

melatonina se paragonato al normale. Cosi come l’espressione del

recettore MT1 e MT2 risulta essere aumentata nella PBC se

paragonata al normale. L’espressione di AANAT e della melatonina è

ridotta nel colangiocarcinoma, mentre aumentata è l’espressione dei

recettori MT1 e MT2. Dal momento che il modello di ratto BDL mima

le tipiche caratteristiche delle colangiopatie umane86, esso è

comunemente utilizzato per la valutazione dei meccanismi che

44

regolano la crescita e il danno colangiocitario21,25,48. Le colangiopatie

condividono alcune caratteristiche come il danno ai colangiociti e la

proliferazione dei dotti residui (meccanismo compensatorio di

riparazione per garantire l’omeostasi dell’albero biliare)18, ma esse

evolvono comunque verso la duttopenia che rappresenta lo stadio

finale di questo tipo di patologie18. Nel nostro studio abbiamo

evidenziato per la prima volta la presenza dei recettori della

melatonina nell’epitelio dell’albero biliare. Uno studio recente ha

dimostrato che la melatonina attenua il danno causato da agenti

scolicidi sui dotti biliari alludendo alla presenza dei recettori della

melatonina nei colangiociti.

La ragione per cui i recettori della melatonina sono up-regolati nei

colangiociti proliferanti di ratto BDL può essere dovuta a meccanismi

compensatori. La riduzione dell’espressione dei due recettori MT1 e

MT2 in seguito al trattamento con melatonina è invece probabilmente

dovuto alla desensibilizzazione di questi recettori come suggerito da

altri studi87. La validità del nostro modello è supportata dal fatto che,

in seguito a somministrazione cronica di melatonina, i livelli sierici di

questo ormone aumentano se paragonati ai livelli sierici dei ratti BDL

di controllo.

I livelli sierici di melatonina nei ratti normali sono simili a quelli

identificati in altri studi88 e, in accordo con precedenti scoperte (es.

nella cirrosi epatica)89 aumenta in seguito a BDL. La scoperta che la

somministrazione di melatonina a ratti normali e BDL aumenti i suoi

livelli circolanti è supportata da studi compiuti sia su ratti che

sull’uomo49,90. Diversi studi supportano l’effetto inibitorio della

melatonina sulla mitosi cellulare. Per esempio è stato visto che la

melatonina inibisce la crescita iperplastica della mucosa gastrica nei

ratti50. Il fatto che la somministrazione in vivo di melatonina riduca i

45

livelli sierici di transaminasi e di bilirubina (osservati nei ratti BDL) è

supportata da precedenti studi51.

Questi risultati suggeriscono il ruolo protettivo della melatonina

sull’epitelio biliare come dimostrato dal fatto che la melatonina

migliora lo stress ossidativo nei ratti colestatici52. Abbiamo dimostrato

che l’inibizione della iperplasia biliare da parte della melatonina è

associata alla riduzione dei livelli basali e secretina-stimolati del

cAMP, della secrezione biliare e della fosforilazione di PKA, regolatori

della proliferazione dei grandi colangiociti25,28,53.

Abbiamo effettuato esperimenti in vitro nei grandi colangiociti per

dimostrare che la melatonina svolge i suoi effetti attraverso la diretta

interazione con lo specifico recettore MT1 down-regolando i livelli

intracitoplasmatici di cAMP e l’espressione dei Clock genes. Il

concetto che MT1 sia il recettore predominante nel modulare gli effetti

inibitori della melatonina sull’iperplasia biliare è supportato da studi

condotti su altre cellule54,55. Questi risultati introducono un importante

concetto secondo cui i farmaci diretti verso MT1 potrebbero essere

importanti nel trattamento delle colangiopatie. Recenti studi hanno

inoltre dimostrato il ruolo del ritmo circadiano57 e dell’ormone

circadiano chiave, la melatonina, nella carcinogenesi58,59.

Diversi lavori hanno dimostrato l’importanza della melatonina nella

patogenesi delle malattie epatiche e nel danno epatico, infatti, diverse

sono le patologie epatiche in cui la sintesi della melatonina, il suo

rilascio e quindi il ritmo circadiano risultano alterati.

Un anormale ritmo circadiano è stato riscontrato in pazienti con cirrosi

epatica e correlato con la severità dell’insufficienza epatica60.

L’aritmia del rilascio di melatonina scompare in seguito a trapianto di

fegato61. Inoltre è stato visto che la melatonina ha azione protettiva

attenuando lo stress ossidativo e l’apoptosi in modelli animali di

46

cirrosi e fibrosi epatica61-63.

La melatonina regola l’espressione dei Clock genes. I Clock genes

influenzano la down-regolazione della proliferazione cellulare e la

disregolazione del ciclo cellulare durante la carcinogenesi64. Infatti

topi che mancano del gene per PER1 e PER2 e CRY1 e CRY2 sono

deficienti nella regolazione del ciclo cellulare, e i topi mutanti per

PER2 sviluppano più facilmente il cancro64. Diversi studi hanno

dimostrato che i Clock genes regolano la mitosi cellulare e che la

melatonina regola la proliferazione cellulare tramite cambiamenti

nell’espressione dei Clock genes65. Supportando questi studi,

abbiamo dimostrato che l’inibizione della melatonina sull’iperplasia

biliare è associata con la down-regolazione di PER1, CLOCK, BMAL1

e CRY1. I nostri studi suggeriscono quindi che i Clock genes

svolgono un ruolo importante nei meccanismi che regolano la

proliferazione cellulare e la patogenesi delle malattie epatiche. Sono

comunque necessari ulteriori approfondimenti per delucidare il ruolo

svolto da ciascuno dei Clock gene nella regolazione della

proliferazione colangiocitaria.

Come detto, diversi studi hanno dimostrato che ridotti livelli di

melatonina determinano una più alta incidenza di sviluppare tumori

della mammella, della prostata, dell’endometrio e del colon retto66,67,

mostrando una relazione inversa tra la secrezione della melatonina e

il tasso di crescita tumorale91.

Pertanto, l’aumento dell’espressione di MT1 e MT2 osservato nel

CCA è probabilmente dovuto ad un meccanismo di compensazione

attuato per ritardare la progressione della crescita cellulare in

presenza della ridotta espressione di AANAT e della secrezione di

melatonina. Questo concetto è supportato da diversi studi51,92.

In accordo con i nostri risultati, un recente studio ha dimostrato che il

47

recettore MT1 e up-regolato nel tumore della mammella; e che

l’azione inibente della melatonina sulla crescita tumorale è associata

con la riduzione dell’espressione di MT192, probabilmente dovuta alla

desensibilizzazione di quest’ultimo, come suggerito da precedenti

studi63. Alla luce di ciò, è possibile proporre che il loop autocrino

(AANAT→ melatonina→ MT1) svolga un ruolo importante nella

progressione del CCA.

In conclusione, sulla base dei risultati ottenuti si dimostra che, in

condizioni sperimentali e nell’uomo, la melatonina agendo sul

pathway del cAMP, svolge un ruolo importante nella regolazione della

proliferazione dell’epitelio biliare del fegato in corso di Cirrosi Biliare

Primitiva e di colangiocarcinoma.

48

ICONOGRAFIA

49

Figura 1.A Immunoistochimica per MT1 e MT2 in fegato di ratto normale e BDL. I colangiociti risultano essere maggiormente positivi per MT1 e MT2 in seguito a BDL. O.M 20x. B: Immunoistochimica per CLOCK e BMAL1 in sezioni di fegato di ratto normale e BDL. L’immunoreattività per i Clock genes risulta maggiore in seguito a BDL. O.M 20X.

Normal

MT1 MT2

BDL

CLOCK BMAL1

Normal

BDL

A

B

50

Figura 2. Immunoistochimica per AANAT in fegato di ratto. I colangiociti esprimono AANAT, e la sua espressione aumenta in seguito a BDL e a trattamento con melatonina. O.M 40X.

Figura 3. Immunoistochimica per AANAT in fegato di ratto. I colangiociti esprimono AANAT. L’espressione di AANAT diminuisce nel fegato di ratto normale e BDL trattato con AANAT Vivo-Morpholino. O.M 20X.

Normal BDL BDL+melatonin

Normal

Mismatch Morpholino

BDL

AANATVivo- Morpholino

51

Figura 4. Immunoistochimica per CK19. Nei ratti BDL la massa biliare diminuisce in seguito a trattamento con melatonina se paragonata ai ratti trattati con veicolo. O.M 20x.

Normal

BDL

NaCl Melatonin

52

Figura 5. Immunoistochimica per PCNA (A) e (CK19) (B) nelle sezioni di fegato dei gruppi di animali selezionati. Nei ratti trattati con AANAT Vivo Morpholino si ha l'aumento della percentuale di colangiociti PCNA positivi e della massa biliare se paragonata ai controlli. O.M. 20X.

Normal

BDL

Mismatch Morpholino

AANATVivo- Morpholino

Normal

BDL

Mismatch Morpholino

AANATVivo- Morpholino

A

B

53

Figura 6. Immunoistochimica per AANAT, Melatonina, MT1 e MT2 su frammenti di fegato umano normale e di PBC. Nella PBC si assiste all’aumento dell’espressione da parte dei colangiociti sia di AANAT che della melatonina. L’espressione dei recettori MT1 e MT2 risulta essere aumentata nella PBC se paragonata al normale.O.M 20X.

Normal PBC

Melatonina

MT1

MT2

AANAT

54

Melatonina

MT1

CCANormal

MT2

AANAT

Figura 7. Immunoistochimica per AANAT, Melatonina, MT1 e MT2 su frammenti di fegato umano normale e di CCA. L'espressione di AANAT e della melatonina appare ridotta nel CCA se paragonata al normale. L'espressione dei recettori MT1 e MT2 è significativamente maggiore nei campioni di CCA se paragonata al fegato umano normale. O.M. 40X.

Figura 15. Colture cellulari (LMC, H69, Mz-ChA-1).

55

BIBLIOGRAFIA

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