This article was downloaded by: [Carnegie Mellon University]On: 09 November 2014, At: 00:27Publisher: Taylor & FrancisInforma Ltd Registered in England and Wales Registered Number: 1072954Registered office: Mortimer House, 37-41 Mortimer Street, London W1T 3JH,UK

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Osservazioni Citometrichee Citochimiche sulComportamento dei NucleoliNellovogenesi di PatellaCoerulea L.Fulvio RanzoliPublished online: 31 Jan 2014.

To cite this article: Fulvio Ranzoli (1953) Osservazioni Citometriche e Citochimichesul Comportamento dei Nucleoli Nellovogenesi di Patella Coerulea L., Caryologia:International Journal of Cytology, Cytosystematics and Cytogenetics, 5:2, 137-158,DOI: 10.1080/00087114.1953.10797435

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FULVIO RANZOLI

OSSERVAZIONI CITOMETRICHE E CITOCHIMICHE

SUL COMPORTAMENTO DEI NUCLEOLI NELL'OVOOENESI

01 PATELLA COERULEA L.

(con Tavole XII e XIII e 6 figure nel testo) (")

In reda:ione: il l/5 febbraio 19511.

INTRODUZIONE

Lo studio della parte ohe i nucleoli esplicano nel corso dell' ovogenesi, durante i processi di accrescimento, di elaborazione e di accumulo delle so­stanze di riserva, ha assunto, da qualche tempo, un nuovo indirizzo, grazie soprattutto ai progressi compiuti dai moderni metodi di indagine citochimica, che hanno condotto a nuove interpretazioni dei fenomeni di anabolismo cel­lulare.

Attualmente si ritiene che i nucleoli, formatisi ad opera di una parte della croma.tina cromosomica, siano costituiti principalmente da pmteine basiche ricche in diaminoacidi e da acidi ribonucleici (RNA), in quan­tita variabile a seconda della a~tivita celluaare piu o meno intensa (CASPERS­

SON 1950). HYDEN ( 1943, 1947) ha descritto le modalita della partecipazione

del nudeolo alia funzionalita della oellula nervosa, con produzione di so­stanze proteicl11e e successivo passaggio di queste nel citoplasma, ove si rac­colgono a formare i ribonucleoprotidi (R N P), che costituiscono la sostan­za tigroide. In modo anaiogo, altri ricercatori (BRACHET 1947, PASTEELS

1948), hanno osservato, all'inizio del secondo periodo di accrescimento del­l' ovogenesi, quando le cellule si dispongono ad accumulare le sostanze deuto­plasmatiche, un aumento nel volume e, spesso, anche nel numero dei nucleoli, cui corrisponde, nel citoplasma, un accumulo di R N P ; in un secondo tern-

( *) lstituto di Zoologia e Anatomia comparata deii'Universita di Modena, diretto dal Prof. ENRICO VANNINI.

137) [Oaryologia, vol. V, n. lit, 1963.

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po, all' epoca della comparsa del tuorlo, questi R N P citoplasmatici si van~ no man mano ra11efacendo, ment~e I' apparato nucleolare riprende le sue proporzioni normali.

La presenza di R N P nei nucleoli e nel citoplasma, durante I' accre~ scimento cellulare, quale preludio alia sintesi proteica in seno a! citoplasma nel corso dell' ovogenesi, e ormai ammessa e con fermata dalle piu recenti ricerche (BRACHET 1947, MoNTALENTI 1949, URBANI 1949, ARVY 1950 a, b, PANIJEL 1951, VANNINI 1951 a, MoNTEFOSCHI 1952, \V IT~ TEK 1952).

I primi ricercatori, che si erano occupati di questi problemi, avevano dovuto limitarsi ad interpretare i loro accurati esami morfologici quasi uni~ camente in base aile affinita tintoriali del protoplasma, rispetto a miscele dei comuni coloranti acidi e basici, giungendo, in molti casi, a conclusioni tuttora accettabili, sia pure con qualohe riserva. F ra i .piu interessanti lavori del ge~ nere si puo, senza dubbio, includere quell a della ] ORGENSEN ( 1913), che esamino comparativamente I' accrescimento ovocitario in diversi tipi animali, con ~peciale riferimento all' apparato nucleolare. Egli vide che Ia maggiore varieta di comportamento dei nucleoli si trova fra i Molluschi e, particolar~ mente, nelle specie del genere PateUa, dal caso piu semplice in P. rota al piu complesso in P. coerulea; che nei nuclei ovocitari piu giovani esiste in genere un solo nucleolo, ment11e piu tardi puo aumentare il loro numero: questa e Ia !oro massa so no pero indipendenti dall' accrescimento del nucleo; che Ia sostanza nucleolare rappre~enta un organ'ello cellulare abtivamentte funzionante e presente nel nucleo dell' ovocita durante tutto il periodo del~ I' accrescimento ovocitario. T uttavia concluse affermando: « troppo poco finora si conosce sui rapporti esistenti tra la sostanza basofila dei nucleoli da un lato e Ia sostanza basofila del citoplasma ovocitario dall'altro. Non e esclu­so che fra questi due cos1ituenti, che sono le uniche sostanze nucleoproteiche dell'uovo in via di accrescimento, possa esistere un rapporto di parallelismo o di reciprocita >>.

BRETSCHNEIDER & HIRSCH ( 1937) osservarono che, nell' ovogenesi di Lima, ment11e il nucleo continua ad aumentare durant,e tutto il secondo periodo di accrescimento, il nucleolo rallenta o anes'ta il proprio sviluppo in un dato momenta, essen do un « sistema parziale n, dotato di una propria autonomia funzionale.

SERRA & QuEIROZ LoPES ( 1945) studiarono le trasformazioni della composizione chimica del nucleolo, in 1:1elazione con i cambiamenti morfolo~ gici, che hanno luogo durante I' accrescimento dell' ovocita, in Helix e T achea e ammisero che il nucleolo elabori atttivamente nudeoproteine destinate a passare nel citoplasma. Tale passaggio fu poi osservato anche in altri Mol~

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luschi, da BRETSCHNEIDER ( 1946), da ARVY ( 1949 a,b, 1950 a) da GABE & PRENANT ( 1949 a, b) e da FRANC ( 195 I ) ; le sue modalita consistono in una espulsione diretta nel nucleo delle sostanze nucleolari, oppure nella produzione di vacuoli pironinofili endonucleolari, che, portatisi alia superficie del nucleolo, vi formano delle gemme e, staccatisi, migrano V·erso Ia mem­brana nudeare, dove si svuotano nel citoplasma. Questi fenomeni si verifi­cano durante il periodo che prelude alia massima intensita della vitellogenesi.

II presente lavoro vuole ,essere una continuazione delle ricerche di JoRGENSEN sull'apparato nucleolare di Patella coerulea, eseguita con tec­nica moderna. L'impostazione, simile a quella data da VANNINI aile sue ri­cerche sull'ovogenesi di Antedon (1951 b, 1953 a) e di Gobius (1951 c, 1953 b), consiste in un confronto tra I' analisi citometrica di tutti gli stadi della maturazione ovocitaria e Ia determinazicne istochimica dei nucleopro­tidi e delle proteine. Cio allo scopo di controllare i risultati e le interpre·ta­zioni di JoRGENSEN e di dare, per quanto possibile, una risposta alia que­stione lasciata in sospeso, sui rapporto tra nudeoprotidi nucleolari e cito­plasmatici; di stabilire se anche nei Molluschi si verifichino le condizioni gia descritte da VANNINI in Anted on e Gobius; di vedere, infine, quale signifi­cato possano avere gli anfinucleoli ovocitari di Patelfa coerulea, descritti da JoRGENSEN come costituiti da due sostanz.e, che assumono diverse colora­zioni con Ia miscela di verde jodio e fucsina basica.

MATERIALE E TECNICA

La presente ricerca e stata compiuta su esemplari sessualmente maturi, in fase femminile (BACCI 1949), di Patella coerulea L. raccolti a Capo S. Chiara (Genova Sturla) nel maggio 1951 .

L' ova rio si trova tra Ia mass a dei visceri e I' epa,topancreas; si rese quindi necessaria staccare gli animali dalle conchiglie ed estrarne Ia gonade per avere una buona fissazione. Questa fu compiuta esclusivamente con for­moJo alcoolico acido ( alcool 70" I 00 em a - formal ina 40 % 5 em~ - acido acetico glaciale 5 cm:1

); i pezzi furono inclusi in paraffina e tagliati in serie di fette di 5 p. .

Le colorazioni impiegate furono: ematossilina-eosina; emallume (Me­yer) - saffranina (Pfitzner) - orange G; ematossilina f,errica ( Heidenhain); il metoda di Zimmermann del verde jodio-fucsina basica (ZIMMERMANN 1896), per il confronto con le osservazioni di joRGENSEN; Ia reazione <li F eulgen per Ia rice rca dei desossiribonucleoprotidi ( D N P); il metodo di Brachet del verde metile-pironina, in mezzo tamponato secondo le indica­zioni di GEROLA & V ANNINI ( 1948, 1949), per il riconoscimento e il do-

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saggio approssimativo dei R N P nel citoplasma e nei nucleoli, col controllo della ribonucleasi e deii'idrolisi in HCI; Ia reazione di Serra per Ia ricerca dell'arginina e di Millon modificata da Serra e Queiroz Lopes per Ia tirosina (SERRA 1947).

La ricostruzione degli ovociti dalle sezioni e, di conseguenza, tutte le misurazioni relative al calcolo dei volumi ovocitari, nucleari e nucleolari, sono state effettuate sulla gonade matura, in fase esclusivamente femminile, di un solo esemplare di Patella, di 27 mm di lunghezza, allo scopo di eli~ minare Ia possibilita di er.rori dovuti a variabilita individuaJle; cio e reso possibile dal fatto che gli ovociti non si sviluppano tutti contemporanea~ mente, coesistendo, neila stessa gonade, una gamma completa di stadi di rna~ turazione, dagli ovogoni agli ovociti aila fine del II periodo di accrescimento.

Con I' oculare da disegno Leitz sono stati accuratamente riprodotti i contorni ceilulari, nudeari e nucleolari di 60 ovociti, da queili in riposo pre~ sinaptico a quelli alia fine della deutoplasmogenesi. Le loro dimensioni mas~ sime corrispondono aile sezioni in cui e interessato il nucleo; rna, per mag~ gior sicurezza, ne sono stati disegnati i ·contorni anche in alcune delle se~ zioni precedenti e seguenti.

I mezzi ottici ( obbiettivo a immersione e distanze) furono scelti e di~ sposti in modo da ottenere un ingrandimento di I 000 diametri esatti: Ia corrispondenza tra micron ncl preparato e millimetri nel disegno permise, cosi, di semplificare le misurazioni, eliminando, nel contempo, cause di errore nei calcoli.

I volumi della cellula, C, e del nucleo, N, sono stati ricavati misurando, sulla sezione in cui essi presentavano Ia superficie piu estesa, il diametro mas~ simo, a, e quello ad esso ortogonale, b, ed applicando Ia formula che da ii volume di un elissoide di cui si conoscono solo due diametri:

A tale solido si possono, con una certa approssimazione, riferire gli ovocth e, a maggior rai?Jione, i nuclei e i nucleoli, piu regolarmente sferoidali. Il volume nucleolare, n, e stato ottenuto sommando quello dei singoli nucleoli presenti, in numero vario, in uno stesso nucleo.

Per confrontare il ritmo di accrescimento dei componenti cellulari con quello deii' ovocita, sono stati costruiti dei diagrammi cartesiani, aventi sul~ I' a sse delle ascisse i volumi ovocitari e su quello delle ordinate: i volumi nu~ cleari, quelli nucleolari e il numero dei nucleoli. Tutti questi dati sono sta:ti espressi con i relativi logaritmi; infatti sarebbe stato praticamente impossi~ bile rappresentare, mediante i valori aritmetici, i volumi ovocitari, poiche

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essi variano da 140 [l-3 a 1.663.000 [l-3 , cioe come uno sta a 118 mila. Sono poi stati calcolati per ogni ovocita i rapporti nucleo-plasmatico

N( . . I . I . I . N . p quoz1ente tra 1 vo um1 nuc eare e c1top asmatico: C _ N, appross1mato

al terzo decimale); nucleolo-nucleare ~ (quoziente tra i volumi nucleolare

e nucleare « netto »: N~' approssimato al quarto decimale); nudeolo--n

plasmatico ~ ( quoziente tra i volumi nucleolare e citoplasmatico: C ~ N

approssimato al quarto decimale).

In un altro gruppo di grafici questi tre rapporti ~ , ~ ed ; , posti

sull' asse delle ordinate di al.trettanti diagrammi cartesiani, sono stati messi a raffronto con i volumi ovocitari, espressi, sull' asse delle ascisse, mediante logaritmi, per lo stesso motivo esposto prima.

Esame morfologico e citochimico delle diverse fasi dell'accresciment'o ova-· dtario.

L'accrescimento degli ovociti di Patella si presenta come un fenomeno continuo, nel quale si osserva il graduale progressive succedersi dei diversi momenti dell'auxocitosi e della vitellogenesi, accompagnati da una caratte­ristica intensa attivita del nucleo e dei nudeoli. E' quindi, se non arbitraria, per lo meno artificiosa una suddivisione in fasi o stadi, anche se questi sono indicati mediante riferimento ai vari aspetti funzionali o fisiologici piu che aile dimensioni cellulari; tuttavia Ia necessita di una descrizione ordinata, che tenga contemporaneamente conto di tutti i dati dei numerosi procedi­menti tintoriali e citochimici, mi ha impasto di accettare quella come l'unica via di uscita.

L' ovocita si presenta, all'inizio della meiosi, come una cellula piu o meno arrotondata, il cui volume si aggira sui 200 p.3 all'incirca (fig. 1 ). II citoplasma, di aspetto omogeneo, si colora normalmente con l'eosina e l'o­range, rna assume anche, leggermente, Ia saffranina e il verde jodio; il nu­cleo, ben visibile, e piu chiaro del citoplasma e vi si notano un reticolo era­matico con filamenti e zolle o, in parecchi casi, i cromosomi sinaptici feulgen­positivi, che si colorano egualmente con la fucsina, Ia saffranina e le ematos­siline; il nucleolo, unico, prende bene l'eosina e l' orange e, d' altra parte, la saffranina e la fucsina basica: e piu colora bile del citoplasma e feulgen­negativo.

In ovociti di queste caratteristiche tintoriali, rna alquanto piu grossi, piu

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rigonfi ( 400 P·3 al massimo), si vede, nel nucleo, come sostanza feulgen-posi­tiva, solo un esile reticolo di filamenti sottili e piumosi: piu oltre, questa rea­zion e. tipica per i D N P, sara sempre e assolutamente negativa.

Ovociti piu sviluppati, il cui volume varia notevolmente, da oltre 400 11a fino a 4000 P·3 , presentano altre caratteristiche comuni (fig. 2). II citoplasma ha sempre un aspetto omogeneo, rna assume ora ugualmente bene e con una certa intensita, oltre ai colori acidi (orange, eosina) anche quelli basici (saf­franina, fucsina, verde jodio, ematossiline); nel nucleo non si vedono che i nucleoli, diversi per numero e per dimensioni ( da uno a nove, a second a delle dimensioni cellulari), colorati come il citoplasma, rna piu vivamente e, spesso, in modo diverso gli uni dagli altri; con l' ematossilina ferrica sono di un nero impenetrabile; Ia cariolinfa e chiara, omogenea o a zone di di­versa intensita, che sfumano le une nelle altre.

Un altro grande gruppo di ovociti di maggiori dimensioni (fino a 30.000 f13

), presenta un aspetto assolutamente nuovo, che nei piu voluminosi nella categori,a ora descritta, era solo lievemente accennato (fig. 3).

Anzitutto si nota una intensa basofilia del citoplasma, che si manifesta con una spiccata affinita per Ia saffranina, la fucsina, il verde jodio e per i color anti a ba~e di ematossilina; cio non esclude tuttavia quell a per i colo­ranti acidi, eosin a ed orange. N onostante I' aspetto a prima vista omogeneo, l'esame piu attento mostra una finissima struttura alveolare, in cui lo stroma e basofilo e le lacune acidofile. Queste scno particolarmente evidenti con i' orange che, grazie alia sua tonalita, nettamente diversa da quelle dell' emal­lume e della saffranina associate, le rende visibili sotto forma di minuscole brillanti goccioline. II citoplasma presenta delle zone a colorazione piu in­tensa, variamente localizzate, che ben si vedono con la miscela verde jodio­fucsina con cui si osserva un passaggio graduale dal viola intenso a zone blu-grigio o rosso vivo.

In secondo luogo i nucleoli sono assai numerosi (fino ad una trentina; rna la maggior parte e costituita da quelli di piccole e medie dimensioni) e spesso di notevole mole (da 80 113 fino a 200 e piu p.3 ) con inclusioni di tipo vacuolare. Essi assumono i coloranti basici fortemente e con diversa intensita. N ello stesso nucleo, alcuni nucleoli, di un rosso vivo, so no colorati dalla sola fucsina, altri, violacei, pure dal verde iodio; i piu grossi sono talvolta piu chiari, anche nei preparati all' ematossilina ferrica; i piu piccoli con l' eosina si colorano in rosa. Le inclusioni nucleolari sono molto rifrangenti e bene colorate dalla saffranina, dall' orange e dall' eosin a, non individuabili sotto la lacca dell'ematossilina ferrica. II nucleo prende intensamente I' emallume e la saffranina, poco Ia fucsina e il verde jodio; solo con l'ematossilina fer­rica mostra una struttura a zolle.

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Con I' aumentare delle dimensioni (fino a 200 mila tt3), I' cvccita va

perdendo, nel nucleo, le caratteristiche ora descritte, che permangono, in parte, solo nel citoplasma (fig. 4); esso infatti e ancora intensamente colo­rabile, specie nelle parti periferiche ed assume, a zone sfumate, tutti i colo­ranti basici ed acidi. La sua struttura e ora chiaramente alveolare, schiumosa, e le goccioline acidofile sono di maggiori dimensioni. II nucleo e chiaro, sen­za una struttura definita; vi spiccano i nucleoli, che raggiungono Ia cinquan­tina c sono debolmente basofili, specie i piu piccoli; i piu grossi nucleoli va­cuolizzati sono propri di questo momento dell' ovogenesi e superano, spesso, i 300 p.:,, ma sono scarsamente basofili; le !oro inclusioni si distinguono solo per Ia forte rifrangenza.

In seguito gli ovociti, aumentando le dimensioni (fig. 5), perdono Ia basofilia del citoplasma; in esso vanno via via ingrossandosi le sferule di tuorlo, che assumono ora piena evidenza e derivano dalle goccioline acido­file degli stadi precedenti. La cellula e circondata da un orlo d' aspetto ap• parentemente omogeneo (Ia « zona radiata >> ), colora to piu intensamente e ohe resta sempre lievemente basofilo. II nucleo e chiaro; i nucleoli, nume­rosissimi ( un centinaio o, eccezionalmente, di piu), generalmente piccoli e difficilmente colorabili, benche conservino ancora una debole basofilia re­sidua, si trovano alia periferia del nucleo, vicino alia membrana.

Una serie di sezioni e stata impiegata per riconoscere e dosare appros­simativamente il contenuto di R N P negli ovociti ora descritti. Seguendo il metoda gia citato, i due coloranti verde metile e pironina sono stati diluiti, in mezzo tamponato, a pH crescenti da 5 a I 0. I risultati, per quanto ri­guarda Ia tonalita e l'intensita di colorazione asmnta dal citoplasma, met­tono in evidenza (tabella I") che solo uno dei coloranti ha potuto agire ai pH estremi, con intensita maggiore per quella stessa categoria di ovociti, della terza fase di accrescimento, che dimostrava le piu spiccate affinita tin­toriali per le altre soluzioni impiegate; si vede, inoltre, che i medesimi ovociti sono quelli che assumono le tinte piu caridhe, anche a tutti gli altri pH in­termedi, nei quali, in proporzioni diverse, hanno agito sia il verde di metile che la pironina.

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I VOLUMI OVOCITARI IN 113

pH 140-400 113 400-4000 ,,3 4000-30.000 ll3 30.0!10- 200.000-

-200.000113 -1.700.000 113

--

I I I 10 verde ehiaro verde verde intenso

I verde verde ehiaro

I I I --

I blu-violaceo I 9 verde ehiaro I blu-verde bin-verde verde ehiaro

I intenso

-- -blu-verde viola bluastro blu-verde

8 viola blna•tro viola bluastro ehiaro

I in ten so

I ehiaro

viola rossastro I viola rossa8tro 7 viola I viola iritenso viola

ehiaro

I I I chiaro

rosso violaeeo ros8o violaceo I

rosso violaeeo 6 ros8o violaceo rosso violaeeo

chiaro

I I intenso

I I chiaro

-5 ro88o ehiaro ro880 rosso intensn I ro8so rosso ehiaro

I I I TABELLA I

Colorazione del citopiasma negli ovociti di Patella, assunta a differenti pH con Ia miscela

verde metile-pironina. La zona racchiusa da una linea indica i pH in cui esiste affinita

per entrambi i coloranti.

Essendo ormai accettato che la pironinofilia corrisponde, generalmente, a presenza di R N P e constatando, d' altra parte, che in un mezzo forte~ mente alcalino la pironina non colora piu, e lecito pensare che quanto mag~ giore e la carica di R N P in una cellula, tanto piu rulto e il pH cui si deve salire 'per inattivare il colorante. Questo risulta evidente nel caso degli ~vociti

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di Patella e si nota che sono sempre gli ovociti del terzo gruppo quelli che conservano tracce di pironina anche a pH 9, quando tutti gli altri sono verdi o bluastri, per effetto del solo verde metile. In una colorazione come questa, le tinte si fondono, Sl ohe Ia presenza di entrambi i colori e tradita dal tono piu o meno violaceo dell'insieme: nella tabella 1 ", che riassume il complesso di queste osservazioni, il fatto e messo in evidenza da una linea piu marcata: gli ovociti che hanno gia iniziato I' accrescimento o Ia vitellogenesi (rispet­tivamente del 2" e 4o gruppo), hanno reazione positiva per Ia pironina fino a pH 8; gli altri. i piu piccoli e quelli con tuorlo gia forma to, solo fino a pH 7.

Parallelamente si rileva che i nucleoli, negli ovociti del primo gruppo, sono colorati dal solo verde metile anche al pH piu basso: nel secondo e nel quarto conservano tracce di pironina fino a pH 8 (come il citoplasma); nel terzo, in cui sono presenti nucleoli vacuolizzati e di colore intenso, fino a pH 9; nel gruppo dei grossi ovociti, ricchi di tuorlo, i nucleoli sono sempre di tinte pallide, a tono rosso fino a pH 7 e verde piu oltre.

I vacuoli nucleolari sono, a tutti i pH, della stessa tonalita del nucleolo, rna colorati piu debolmente.

Dopo il trattamento con ribonucleasi o l'idrolisi in HCI caldo, Ia colo­razione con Ia miscela verde metile-pironina e negativa per i nucleoli e il citoplasma degli ovociti di tutte le dimensioni anche ai pH piu bassi (fig. 6 e 7); cio prova che, nel nostro caso, la pironinofilia dipende effettivamente dalla presenza di R N P.

La reazione di Serra per il riconoscimento dell' arginina rive! a la pre­senza del diaminoacido nel citoplasma di tutti gli ovociti; esso e poi parti­colarmente abbondante in quelli della terza fase di accrescimento, nella mag­gior parte dei !oro nucleoli e nelle zone citoplasmatiche perinucleari di tutti gli ovociti in vitellogenesi. E' scarso, invece, nei nuclei in gener~. nei nucleoli degli ovociti piu grossi e nei globuli di tuorlo. I vacuoli nucleolari sono leg­germente piu colorati dei nucleoli che li contengono.

La reazione di Serra e Queiroz Lopes per la tirosina dimostra, nel citoplasma, una quantita quasi costante e uniformemente distribuita di que­sta amminoacido, durante tutta I' ovogenesi. Non si no~ano differenze nelle intensita di colorazione fra i nucleoli, tutti e sempre positivi. I vacuoli nu­cleolari sono piu colorati dei nucleoli soltanto durante la prima fase della deutoplasmogenesi.

L'elaborazione di questi dati verra svolta nella discussione, dopo la descrizione dei diagrammi.

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Analisi delle modalita di accrescimento del nudeo e del complesso dei nu~ cleoli rispetto all' ovocita.

L' accrescimento del nucleo, durante Ia maturazione degli ovociti di Patella, segue un ritmo approssimativamente uguale a quello di tutta Ia eel~ lula. Cia e dimostrato e messo in evidenza, nel grafico n. 1, dal fatto che i punti, rappresentanti i volumi, sono distribuiti, con dispersione trascurabile, lunge un tragitto quasi rettilineo; questo fatto e veramente notevole, se si pensa che, durante i processi di elaborazione e di accumulo delle sostanze di riserva, I' ovocita aumenta, come si e gia accennato, di 118 mila volte Ia sua mole iniziale. Si vedra tuttavia, esaminando I' andamento del rap~

OllOd ~ durante l' ovogenesi, che esiste un certo scostamento dalla condi~ zione di perfetta linearita, che si dovrebbe avere se I' accrescimento nucleare fosse esattamente proporzionale a quello di tutta Ia cellula.

GRAFJCO N. I. - Accrescimento del volume nucleare. I punti piu marcati indicano Ia coinci­denza di due valori; le frecce, Ia separazione tra i cinque gruppi di dimensioni ovocitarie.

L' aumento volumetrico della mass a dei nucleoli si svolge secondo un piano alquanto diverso da quello seguito dal nucleo. L' accrescimento, du~ rante Ia prima, Ia seconda e Ia terza fase di sviluppo degli ovociti, e piu

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rapido e la curva piu inclinata (grafico n. 2), in corrispondenza al conside~ revole aumento sia del numero che delle dimensioni dei nucleoli, descritto precedentemente. Aumentando il volume degli ovociti (quarta fase) l'incli~ nazione della ourva diminuisce fino a farla divenire parallel a all' asse delle ascisse, in relazione al fatto che, a questo stadio, si osserva un rallentamento delle attivita nucleolari e una diminuzione della carica di sostanze basofile e di R N P nel nucleo. lnfi.ne, alia quinta fase, quando nell' ovocita si r gia

GRAFICO N. 2. - Accrescimento del volume nucleolare.

formato il tuorlo, la curva discende, dimostrando una contrazione del volume nucleolare totale. N el complesso, I' andamento ricorda quello di una curva sigmoide, comune a molti fenomeni biologici ed e nettamente indipendente da quello seguito nel nucleo.

L'aumento numerico dei nucleoli segue, nelle prime tre fasi dell'accre~ scimento ovocitario, un ritmo rapido ed intenso, corrispondente alia prima parte rettilinea del tracciato (grafico n. 3); ritmo che subisce un graduale rallentamento nel periodo corrispondente alia quarta fase e coincide con ana~ logo fenomeno nell'aumento del volume nucleolare. Mentre quest'ultimo, pero, diminuisce alia quinta fase, il numero dei nucleoli aumenta ancora e tende, tutt' al piu, a mantenersi costante alia fine dell' accrescimento. Si puo

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cosi pensare che la riduzione del volume totale dei nucleoli, in questa pe­riodo terminale, sia dovuta alia scomparsa, a suo tempo segnalata, dei piu grossi, ammettendo che non siano rimpiazzati da un numero, corrispondente per volume, di quelli piccoli. All a terza fase, quando I' aumento numerico e rapido, corrisponde anche la comparsa dei nucleoli di maggiori dimensioni (piu di 200~3) e vacuolizzati.

GRAFICO N. 3. - Aumento numerico dei nucleoli.

II rapporto ~- diminuisce con I' aumentare del volume degli ovociti;

fatto che risulta evidente dall' esame del grafico n. 4, nonostante la disper­sione dei punti su una vasta superficie. Questa dimostra che la grandezza relativa del nucleo subisce una progressiva diminuzione, durante I' accresci­mento ovocitario; cia e in accordo con quanta vide gia JORGENSEN e con quanta si era rilevato descrivendo il primo grafico che, ad un primo ,esame, sembra erroneamente presentare un tracciato rettilineo.

Le variazioni dei rapporti nucleolo-nucleare ~ e nucleolo-plasmatico

n p durante la maturazione degli ovociti sono somiglianti tra loro e seguono

il medesimo andamento {grafici n. 5 e 6). Entrambi i rapporti hanno va-

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Iori bassi all'inizio dell' ovogenesi; nella seconda fase aumentano e raggiun­gono il massimo nella terza, durante Ia quale si nota tuttavia una !oro no­tevole dispersione. Nella quarta fase subiscono una rapida diminuzione e rag­giungono, nella quinta, valori inferiori a quelli iniziali.

GRAFICO N. 4. Andamento del rapporto nucleo- plasmatico ~.

Questo andamento ricorda quello della basofilia del citoplama o, me­glio, della quantita in esso di R N P, cosi come vengono approssimativa­mente dosati con Ia colorazione mediante verde metile-pironina a pH cre­scenti. Per rendere evidente questa fatto, sullo stesso diagramma del rap-

porto ~ sono stati riportati, previa ·aggiunta di una scala laterale recante

la gradazione in pH delle soluzioni coloranti, i dati altrimenti esposti nella tabella 1 a: Ia linea spezzata indica il pH di viraggio, a! di sopra del quale la pironina non puo piu colorare i R N P presenti nel citoplasma. Si puo cosi osservare che, nello stesso periodo della loro maturazione in cui hanna

un alto rapporto ; , gl.i ovociti sono piu ricchi di RNP. Sull'importanza

di questa parallelismo si ritornera piu avanti.

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GRAFICO N. 5. - Andamento del rapporto nucleolo-nucleare ~. N

n GRAFICO N. 6. - Andamento del rapporto nucleolo-plasmatico p· La linea spezzata indica,

rispetto alla scala di destra, il pH di viraggio della colorabilita con pironina.

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DISCUSSIONE E CONCLUSION!

La maturazione dell' ovocita in Patella coeru.lea consiste, durante un primo periodo del suo accrescimento volumetrico, nell' accumulo di R N P nel citoplasma, seguito, in un secondo tempo, da una loro rarefazione, che si attua gradualmente quando compare e si accumula a tuor:lo.

La condizione iniziale, di un nucleolo unico e pironinofobo, viene ra~ dica~lmente rovesciata nel periodo in cui il citoplasma si carica di R N P: sono presenti infatti piu nucleoli, che aumentano progressivamente di nume~ ro, dimensioni, basofilia e pironinofilia, tutti, o quasi, provvisti di inclusioni o vacuoli. Non si e osservato un nucleolo principal e. che si stacchi dagli altri per dimensioni e presenza costante durante tutta la durata dell' ovoge~ nesi, come videro SERRA & QuEIROZ LoPES ( 1945) in Helix e T achea; si e invece identificato, negli stadi zo e 3°, il nucleolo (( primario )) descritto da JoRGENSEN, per la colorabilita leggermente minore con le ematossiline e una lieve pironinofilia; esso non e visibile nelle successive fasi di accresci~ men to, ne mostra, all' esame citodumico, una costituzione proteica diversa da quella di tutti gli altri nucleoli.

L'affinita dei nucleoli ovocitari per i coloranti nucleari in passato aveva fatto prospettare l'ipotesi che essi fossero costituiti di una « basicromatina )) simile a quell a cromosomica; ] ORGENSEN trovo che la dige5tione in pepsina dei nucleoli richiede un tempo progressivamente minore, con il progredire della maturazione e, avendo constatato la grande resistenza dei cromosomi alia stessa digestione, giunse ad ammetteere che i nucleoli contenessero una quantita di acidi nucleici inversamente proporzionale aile dimensioni ov~ citarie.

Qual ora non si facciano distinzioni tra D N P e R N P, si puo ritenere tale supposizione valida e concordante con i risultati, descritti in precedenza, delle ricerche citochimiche, escludendo pero il nucleolo degli ovociti di mi~ nori dimensioni. lnfatti, in questi ultimi (che sono stati riuniti nel ro gruppo), il nucleolo, pironinofobo, non contiene R N P in quantita rilevabile e, ben~ che assuma il verde metile anche ai pH piu acidi, e feulgen~negativo. Pari~ menti SERRA & QUEIROZ LoPES ( 1945) e ARVY ( 1950 a) non trovarono mai, nel corso dell'ovogenesi, nucleoli contenenti D N P, che furono invece descritti da GABE & PRENANT ( 1949 b), da FRANC ( 1951) e da MoNTE~ FOSCHI ( 1952).

Anche gli anfinucleoli, descritti da joRGENSEN, non contengono che R N P; I'unica differenza tra le zone che assumono elettivamente il verde j.odio o la fucsina basica consiste nella diversa concentrazione di R N P e proteine acide e basiche.

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N ei preparati istologici non si e mai notata Ia presenza di gemme o pro~ tuberanze sulla superficie dei nucleoli, come quelle descritte da SERRA & QUEIROZ LoPES ( 1945) e da ARVY ( 1950 a), ohe le videro anche a fre­sco e con il miscroscopio a contrasto di fase. Mancano quindi gli indizi di una emissione in massa di sostanze nucleolari e si puo pensare che le sostanze elaborate dai nucleoli passino lentamente nel nucleo e da questa nel citopla­sma. Questo passaggio puo essere facilitato dalla maggiore superficie che il complesso nucleolare presen.ta quando, come in Patella, esso e suddiviso in un grande numero di componenti; mentre nelle specie studiate da SERRA & QUEIROZ LOPES e da ARVY il nucleolo e generalmente unico. D' altra parte le proteine basiche e acide nei vacuoli nucleolari, nel periodo della massima attivita, s·ono piu abbondanti che altrove, forse perche qui ne avviene l'accu~ mulo; nel citoplasma esse sono particolarmente addensate nella zona peri­nucleare: il I oro trasferimento fuori dal nucleo e quindi estremamente pr~ babile, anche se non si e potuto osservarne le modalita. Si puo supporre inol­tre che, dalle zone nucleolari ricche di R N P, I' acido ribonucleico migri separatamente nel citoplasma, per combinarsi di nuovo con le proteine.

Quando inizia Ia pwduzione del tuorlo negli ovociti del quarto gruppo, Ia quantita di R N P nel nucleo si attenua, rimanendone un poco solo nei nucleoli piu voluminosi: questa puo significare che, cessata Ia sintesi, le s~ stanze nucleol•ari non diffondono sensib~lmente attraverso il succo nucleare per portarsi nel citoplasma. In conseguenza di cio, si arresta nel citoplasma Ia produzione di R N P, che van no progressivamente scomparendo col proce­dere della f.ormazione del tuorlo, cui, evidentemente, prendono parte inte­grante. I nucleoli, nella stesso tempo, piccoli e disposti alia periferia del nu~ cleo, in prossimita della membrana, sono poco visibili e diflicilmente col~ rabili.

I nucleoli sono un costituente cellulare indipendente, nella sua attivita, dal nuoleo che li oontiene: le vedute di joRGENSEN, condivise da BRET~ SCHNEIDER & HIRSCH ( 1937), ricevono un'ulteriore conferma dal confronto tra l'accrescimento del volume nucleare e quello nucleolare. Mentre il primo e praticamente proporzionale rispetto a quello dell' OVocita, il Secondo si ar~ rest a e subisce anzi una diminuzione, in corrispondenza al cessare dell' atti­vita di sintesi nei nucleoli nel periodo della vitellogenesi.

In conseguenza si spiega Ia diversita di variazione tra i rapporti ~ e ~ Soprattutto significativo e il comportamento del rappor.to ; , perche esso se~

gue il medesimo andamento della carica in R N P del citoplasma, fatto, questo, in accordo con I' attuale concezione che il nucleolo ne sia il centro

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di elaborazione. Le v·ariazioni del rapporto -;:,- sarebbero quindi un indice

della attivita dei nucleoli rispetto al citoplasma durante I' ovogenesi, che au­menta e raggiunge il suo massimo nei primi periodi dell'accrescimento ovoci­tario (carica del citoplasma in R N P) e diminuisce progressivamente duran­te Ia vitellogenesi ( utilizzazione dei R N P nella genesi del tuorlo).

Cia e in accordo con i reperti di VANNINI, che ha descritto il medesimo comportamento dei volumi nucleolari nell' ovogenesi del crinoide Anted•on rosacea ( 1951 b, 1953 a) e del teleos•teo Gobius ophio'cephalus ( 1951 c, 1953 b). L'unica differenza consiste nella maggiore dispersione, segnalata in Patella, tra i valori del rapporto nucleolo-plasmatico, negli ovociti del terzo gruppo: si puo supporre che durante questa fase dell' ovogenesi Ia sostanza nucleolare sia soggetta a forti variazioni quantitative, a causa della sua in­tensa attivita funzionale, che si manifesta con una abbondante emissione di sostanze destinate a passare nel citoplasma.

Questo parallelismo tra reperti ottenuti in ovociti di animali sistemati­camente assai lontani potrebbe difficilmente venire attnibuito ad una pura co­incidenza casuale; con ogni probabilita esso dimostra che le descritte varia­zioni volumetriche dei nucleoli, durante I' accrescimento ovocitario, rappre­sentano un fenomeno largamente diffuso.

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CARYOLOGIA Vol. V, Tav. XII.

F. RANZOLI. - Osservazioni citometriche e citochimiche sul comportamento dei nu~ cleoli nell' ovogenesi di Patella coerulea L.

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CARYOLOGIA Vol. V, Tav. XIII.

F. RANZOLI. - Osservazioni citometriche e citochimiche sul comportamento dei nucleoli nell' ovogenesi di Patella coerulea L.

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OSSERVAZIONI SUI NUCLEOLI NELL'OVOGENESI DI PATELLA COERULEA 155

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Sp1egazione delle Tavole XII e XIII.

TAVOLA XII.

Fig. I. - Ovociti nella 1" fase di accrescimento; nucleo scarsamente basofilo. con reticolo

cromatico; citoplasma acidofilo. Ematossilina-eosina; 1200 X .

>> 2. - Ovociti nella 2" fase; nudeoli di diverse dimcnsioni; citoplasma basofilo. Ematos­

silina-eosina; 1200 X .

>> 3. - Ovociti nella 3• fase; numerosi nucleoli intensamentc basofili, con inclusioni vacuo­

lari; citopiasma a struttura alveolare. Ematossilina-eosina: 1200 X.

>> 4. - Ovocita nella 4• fase; due grossi nucleoli basofili con inclusioni vacuolari e nu­

merosi piccoli nudeoli scarsamente colorabili: citoplasma basofilo con granuli di tuorlo.

Ematossilina-eosina; 670 X.

>> 5. - Ovocita nella 5° fase: numerosissimi piccoli nucleoli marginali; citoplasma acidofilo

con sferule di tuorlo. Ematossilina-eosina; 670 X.

T A VOLA XIII.

Fig. 6. - Sezione di ovario a piccolo ingrandimento: intcnsa pironinofilia del nucleo e del

citoplasma negli ovociti piu piccoli e delle parti periferiche in quelli di maggiori di­

mensioni. Verde metile-pironina, pH 5; 75 X.

» 7. - Sezione di ova rio a piccolo ingrandimento, dopo idrolisi, in HCI N a 60° per I 0':

scompa,rsa della pironinofilia da tunti gli ovociti. Verde metile-pironina, pH 5; 75 X.

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TABELLA II

Ovociti di Patella in o1'dine di gmndezza, con i 1·elativi volumi e mppm·ti

0 I

8 -~ Volume Volume Volume N II "' "' n

8 ~ p - --:::l cD O\'ncita nne leo nucleoli N p ~ f:

""' 1 140 47 1, 75 0,505 0,0388 0,0188

2 263 86 1,75 0,485 0,0208 0,0098

3 338 80 1,75 0,310 0,0223 0,0067

4 362 52 4,18 0,167 0,0874 0,0134

5 502 143 4,18 0,398 0,0300 0,0116

6 5a2 85 8,36 0,190 0.1085 0,0187

7 5K7 175 14,09 0,424 0,0875 0,0341

8 672 140 8,15 0,263 0,0617 0,0153

9 672 164 32,68 0,322 0,2475 0,0643

10 726 143 17,76 0,245 0,1420 0,0304

11 750 160 21,94 0,271 0,1589 0,0371

12 786 140 8,15 0,216 0,0617 0,0126

13 786 220 10,74 0,388 0,0513 0,0189

H 878 175 4,13 0,248 0,0244 0,0059

15 878 195 R,36 0,285 0,0447 0,0122

16 1251 263 7,112 0,208 0,0306 0,0061

17 1316 267 40,50 0,254 0,1788 0,0386

18 1730 500 65,84 0,406 0,1517 0,0535

19 1756 380 25,12 0,276 0,0707 0,0182

20 2523 672 102,66 0,363 o, 1804 0,0554

21 2962 829 101,44 0,388 0,1393 0,04'/5

22 3258 417 54,84 0,146 0,1514 0,0193

23 3288 517 33,94 0,186 0,0702 0,0122

24 3511 672 143,41 0,236 0,2710 0,0505

25 3G48 768 64,61 0,276 0,0919 0,0232

26 37(9 G92 40,16 0,187 0,0727 0,0127

27 3919 744 118,96 0,234 0,1903 0,0374

28 3919 774 101,12 0'246 o, 1502 0,0321

29 456! 706 99,52 0,182 0,1639 0,0257

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Segue Tab. 11

0

8 -~ Volume Volume Volume N 11 n "' "' El "' - -::l ... ovocita nucleo nu;Jleoli p N p z~ ... ~

30 5000 774 51,79 0,183 0,0717 0,0122

31 5267 672 107,49 0,146 0,1902 0,0233

32 5925 1260 1!2,83 0,270 o, 1278 0,0306

33 6884 1580 112,25 0,297 0,0764 0,0211

34 696! 2782 334,54 0,665 0,1366 0,0799

35 8467 2481 339,57 0,!14 0,1585 0,0567

36 88H 349! 484,17 0,653 0,1608 0,0904

37 8933 1936 434,25 0,276 0,2891 0,0620

38 9363 1456 234,70 0,184 0,1920 0,0296

39 10.776 2531 4i0,41 0,306 0,1934 0,0497

40 11.255 2065 254,81 0,224 0,1407 0,0277

41 11.9S2 1915 245,44 0,189 0,1818 0,0243

42 14.044 551o 639,88 0,645 0,131:3 0,tJ749

43 17.117 1565 180,32 0,100 0,1301 O,Ollii

44 18.058 35411 695,12 0,24·1 0,2436 0,0479

45 24.5;{3 3010 496,63 0,139 0,1975 0,0230

46 27.086 4455 339,69 0,196 0,0825 0,0150

47 36.736 6057 502,72 0,197 0,0890 0,0162

48 38.623 5925 1004,03 0,181 0,20!0 0,0307

49 41.183 4138 254,13 0,111 0,0654 0,0068

50 97.472 10.737 1293,79 0,123 IJ, !369 0,0149

51 115.316 11.470 942,13 0,110 0,089! 0,0090

52 116.016 11.338 1108,32 0,108 0,1083 0,0105

53 125.086 14.581 1296,32 0,131 0,0975 0,0117

54 263.340 43.934 1211,21 0,200 0,0283 0,0055

55 439.924 54.917 1020,55 0,142 0,0189 0,0026

56 508.622 32.765 1589,67 0,066 0,0509 0,0033

57 545.114 66.086 926,54 0,137 0,0142 0,0019

58 824.781 96.019 671,71 0,131 0,0704 0,0092

59 1.302.855 39.295 705,60 0,031 0,0182 0,0005

60 1.662.904 147 . .£23 715,79 0,097 0,0048 0,0004

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2014

158 RANZOLI

SUMMARY

The role explained by nucleoli during the growth and the yolk formation in Patella

coerulea oocytes, is studied by examining their R N P and proteins, and the volumetric ratios

between nucleolus, nucleus and cytoplasm.

In a first time, both in nucleoli and cytoplasm. formation and storage of R N P are

observed, which later rarefy when yolk appears in the cytoplasm. Volumetric modifications

of nucleus and nucleoli do not follow the same rhythm: while the nucleus increases almost

proportionally to the cytoplasm, the nucleoli grow indipendently. The nucleolo-plasmic index

variu in a similar way to the charge of R N P in the cytoplasm. and shows its highest value

in the phase immediately preceding the yolk formation; during this period o.f maximum of

lctivity, the nucleoli are largely supplied with vacuolar inclusions.

That all agrees with the hypothesis according to which the nucleoli are the elaboration

center of the nuclear and cytoplasmic R N P. regulating the cellular growth and the yolk

synthesis.

RIASSUNTO

La parte esplicata dai nucleoli durante l'accrescimento e Ia vitellogenesi negli ovociti di

Patella coerulea viene studiata con l'esame del contenuto in nucleoprotidi e proteine e con

quello dei rapporti volumetrici fra nudeolo, nucleo e citoplasma.

In un prima tempo si osserva, nei nucleoli e nel citoplasma. Ia formazione e l'accumulo

di ribonucleoprotidi, che poi si rarefanno quando nel citoplasma compare il tuorlo. Le mo­

dificazioni di volume del nucleo e dei nucleoli non seguono lo stesso ritmo: mentre il nucleo

si accresce quasi proporzionalmente al citoplasma, i nucleoli hanna un accrescimento indipen­

dente. I valori del rapporto nucleolo-plasmatico variano con un decorso analogo a quello della

carica dei ribonucleoprotidi cellulari e mostrano il livello piu alto nella fase che precede im­

mediatamente Ia comparsa del tuorlo; durante tale period a di !oro massima eflicienza, i nucleoli

sono largamente provvisti di inclusioni vacuolari.

Tutti questi reperti si accordano con l'interpretazione che i nucleoli siano il centro di

elaborazione dei ribonucleoprotidi nucleari e citoplasmatici, regolanti 1' accrescimento cellulare

e Ia genesi del tuorlo.

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