ORGANI - TESSUTI – parenchima e cellule funzionali tessuto di sostegno, connettivo

Muscolo scheletrico – miociti, fibrocellule; muscolo cardiaco: cardiomiociti; Encefalo: neuroni, astrociti, glia; Sangue: eritrociti; linfomonociti, granulociti, piastrine;Fegato: epatociti; rene: unità funzionale nefrone

Muscolo scheletrico – miociti, fibrocellule; muscolo cardiaco: cardiomiociti; Encefalo: neuroni, astrociti, glia; Sangue: eritrociti; linfomonociti, granulociti, piastrine;Fegato: epatociti; rene: unità funzionale nefrone

Matrice extracellulare - liquidi interstiziali, liquidi biologici: siero (plasma), liquor cefalorachidiano, liquido sinoviale, saliva, liquido amniotico.

Frazionamento cellulare, basilare per lo studio di proteine cellulari in organi e tessuti specifici o in linee cellulari: si devono ottenere frazioni definite di “arricchimento” di particolari componenti cellulari: ex. frazione citoplasmatica o solubile; frazione di membrane plasmatiche; frazione microsomiale; frazione mitocondriale; nuclei.

Le tecniche separative che si possono utilizzare si diversificano in relazione al tipo di tessuto/cellula e al grado di purezza della/e frazione/i subcellulare/i ritenuto necessario.

COLTURE CELLULARI: linee cellulari, cloni cellulari, etc.

Studio proteine: proteine extracellulari – cellulari Studio proteine: proteine extracellulari – cellulari

PROTEINE CELLULARI: legate alla membrana plasmatica e intracellulari

PROTEINE EXTRACELLULARI:

STUDIO DELLE PROTEINE CELLULARI- FRAZIONAMENTO CELLULARE STUDIO DELLE PROTEINE CELLULARI- FRAZIONAMENTO CELLULARE

Le cellule eucariotiche (ex. animali) sono organizzate in modo complesso:compartimenti, organelli, strutture subcellulari, dove le proteine sono variamente distribuite. Lo studio di proteine specifiche (enzimi, recettori, etc.) si effettua in frazioni cellulari (sub-cellulari): quelle, ad esempio, dove le proteine di nostro interesse sono >> espresse. Il frazionamento può anche servire per vedere il profilo di distribuzione di una o più proteine nella cellula; come fase iniziale di preparazione alla purificazione di una o più proteine, a partire da un omogenato grezzo.

Le cellule eucariotiche (ex. animali) sono organizzate in modo complesso:compartimenti, organelli, strutture subcellulari, dove le proteine sono variamente distribuite. Lo studio di proteine specifiche (enzimi, recettori, etc.) si effettua in frazioni cellulari (sub-cellulari): quelle, ad esempio, dove le proteine di nostro interesse sono >> espresse. Il frazionamento può anche servire per vedere il profilo di distribuzione di una o più proteine nella cellula; come fase iniziale di preparazione alla purificazione di una o più proteine, a partire da un omogenato grezzo.

FRAZIONAMENTO CELLULAREFRAZIONAMENTO CELLULARE

1) Fase di omogeneizzazione: disorganizzazione del tessuto e rottura di cellule

OMOGENATOOMOGENATO

2) Fase di separazione: reintroduce un ordine di nuovo tipo raggruppando le componenti cellulari contenute nell’omogenato in base a uguali caratteristiche e proprietà di tipo fisico quali dimensioni, densità.

CENTRIFUGAZIONE(differenziale, zonale,isopicnica)

CENTRIFUGAZIONE(differenziale, zonale,isopicnica)

Eterogeneità del tessuto Eterogeneità del tessuto

Procedure che devono essere eseguite al fine di ottenere la max. resa possibile;in particolare l’omogeneizzazione, deve essere adattata all’eterogeneità dei diversiorgani e tessuti: cellule che differiscono x dimensioni, densità e fragilità

Procedure che devono essere eseguite al fine di ottenere la max. resa possibile;in particolare l’omogeneizzazione, deve essere adattata all’eterogeneità dei diversiorgani e tessuti: cellule che differiscono x dimensioni, densità e fragilità

Mezzo, soluzione ; metodo di omogeneizzazioneMezzo, soluzione ; metodo di omogeneizzazione

L’omogeneizzazione avviene in tampone solitamente ipotonico e a pH fisiologico; il tampone ipotonico facilita la rottura delle cellule;

si cerca tuttavia di mantenere condizioni in vitro non troppo drastiche: nondeve essere alterata la struttura delle proteine che vogliamo studiare

L’omogeneizzazione avviene in tampone solitamente ipotonico e a pH fisiologico; il tampone ipotonico facilita la rottura delle cellule;

si cerca tuttavia di mantenere condizioni in vitro non troppo drastiche: nondeve essere alterata la struttura delle proteine che vogliamo studiare

(Blendor)

Ultraturrax; Potter-Dounce manuale; Potter-Elvejham-elettr.

Sonicazione: onde sonore alta freq.

(x omogenati di colture batteriche)

Condizioni opportune per l’omogeneizzazione di tessuti e cellule:Se eseguiamo il frazionamento cellulare per studiare la funzione di una o più proteine,dobbiamo ottenere, alla fine della procedura, una buona resa di queste(a) proteine(a). Per ogni tessuto, organo, tipo di frazione cellulare e proteine in studio esistono procedure e protocolli adattati e variabili al fine di ottenere risultati il più possibile ottimizzati.

Condizioni opportune per l’omogeneizzazione di tessuti e cellule:Se eseguiamo il frazionamento cellulare per studiare la funzione di una o più proteine,dobbiamo ottenere, alla fine della procedura, una buona resa di queste(a) proteine(a). Per ogni tessuto, organo, tipo di frazione cellulare e proteine in studio esistono procedure e protocolli adattati e variabili al fine di ottenere risultati il più possibile ottimizzati.

Temperatura: si opera in ghiaccio- 4°C – non si devono denaturare le proteine;a basse temperature si bloccano anche attività enzimatiche proteolitiche e digestiveche si trovano in lisosomi e perossisomi e si possono liberare durante la lisi – inibitori di proteasi. Composizione salina bilanciata e adattata, ipotonica per provocare rottura dellemembrane.

pH fisiologico, 7-7.4 – media che sono tamponi – uso di detergenti per solubilizzareproteine. Tamponi: impediscono cambiamenti del pH fisiologico x aggiunta di acidi o basi – acido o base deboli + loro sale ottenuto da base e acido forte. Tamponi fosfato, Tris-HCl, Hepes-NaOH, a varie conc. 5-100 mM vs. conc. salinaisotonica ≈120 mM NaCl.

Temperatura: si opera in ghiaccio- 4°C – non si devono denaturare le proteine;a basse temperature si bloccano anche attività enzimatiche proteolitiche e digestiveche si trovano in lisosomi e perossisomi e si possono liberare durante la lisi – inibitori di proteasi. Composizione salina bilanciata e adattata, ipotonica per provocare rottura dellemembrane.

pH fisiologico, 7-7.4 – media che sono tamponi – uso di detergenti per solubilizzareproteine. Tamponi: impediscono cambiamenti del pH fisiologico x aggiunta di acidi o basi – acido o base deboli + loro sale ottenuto da base e acido forte. Tamponi fosfato, Tris-HCl, Hepes-NaOH, a varie conc. 5-100 mM vs. conc. salinaisotonica ≈120 mM NaCl.

Calore, pH estremi, solventi organici, detergenti: possono provocare denaturazione delle proteineCalore, pH estremi, solventi organici, detergenti: possono provocare denaturazione delle proteine

)9

r)(2v

0

2MP

2P

f/fr

(

Velocità di sedimentazione di particelle in soluzione per centrifugazione

Tra le numerose applicazioni della centrifugazione vi è la separazione di particelle (cellule, organelli,frazioni sub-cellulari, macromolecole)- preparativa o analitica.

-La velocità di sedimentazione V incrementa proporz al quadrato del raggio particella (rp

2)

- La velocità di sedimentazione V aumenta. proporz. alla diff. tra densità particella edensità del mezzo

-La V sed. incrementa con l’incremento del campo di centrifugazione = 2r

-- La V sed. diminuisce all’aumento della viscosità del mezzo ( ) e di f/f0 =rapporto di attrito

Frazionamento sub-cellulare e centrifugazione

Organello Diametro (M) Densità (g/cm3)

Nucleo 5-10 1.40

Mitocondrio 1-2 1.18

Lisosoma 1-2 1.13

Ribosoma 0.02 1.61

Centrifugazione differenziale, zonale e isopicnica

Rotori ad angolo fisso

Rotori swing-out – a braccio oscillante

Centrifugazione differenziale

OMOGENATO

600 g

10 min

25,000 g10 min

PELLET 1Nuclei

PELLET 2MitocondriCloroplastiLisosomi

Perossisomi

PELLET 3Microsomi

PoliribosomiFrammenti di

membrane

PELLET 3Ribosomi

VirusGrandi Ma-

cromolecole

100,000 g60 min

300,000 g120 min

SOVRANATANTE1

SOVRANATANTE2

SOVRANATANTE3

CITOSOL

tecnica più usata per il frazionamento cellulare centrifugando un omogenato cellulare per tempi relativamente brevi ed a velocità modeste sarà possibile ottenere la sedimentazione dei nuclei ma non degli altri organelli, che hanno densità e/o dimensioni minori e che rimarranno nel surnatante. Il surnatante può essere ulteriormente processato per ottenere altri tipi di particelle

centrifugazioni ripetute: con una serie di centrifugazioni opportune si possono ottenere le principali frazioni sub-cellulari; con le metodiche in gradiente di densità le frazioni possono essere ottenute con un solo passaggio.

p – m > 0 p – m > 0

Relazione tra RCF (g) e RPM

Equazione di conversione

Esercitazione - Tessuto muscolare

1 gr di tessuto - Omogeneizzazione in tampone fosfato 100mM pH 7,4 (1:10 p:vol), in ghiaccio

Surnatante Pellet

Centrifugazione diff. a 10,000 g a 4°C

FRAZIONE “SOLUBILE”

(contenente citosol, microsomi, particelle e organelli + leggeri, proteine del citoplasma, enzimi)

Ultraturrax

Dosaggio delle proteine totali ottenute: metodo biureto

Dosaggio dell’enzima LDH in condizioni saturanti