nuova frontiera del tecnico di laboratorio · permette l’individuazione e la localizzazione degli...

Relatore: Codecà Monia11 dicembre 2008Dip. di Medicina di Laboratoriodirettore Dott.Claudio Dotti

Biologia Molecolare:Biologia Molecolare:nuova frontiera del nuova frontiera del

tecnico di laboratoriotecnico di laboratorio

Innanzitutto chi è il tecnico di laboratorio?

Mario è in montagna , accusa un malore , si reca al pronto soccorso, viene accolto dal personale medico e paramedico

che presta le prime cure e procede agli accertamenti…..

Dove vanno le provette di Mario ? Chi se ne occupa?

I tecnici di laboratorio biomedico, “gli invisibili a Mario”, provvedono all’esecuzione dei test

con competenza e professionalità, garantendo precisione ed accuratezza dei risultati.

Una piccola storia per conoscerci………..

2Reggio Emilia, 11 Dicembre 2008

La figura del tecnico di laboratorio nasce nelcontesto lavorativo degli anni 60. All’inizio la

professione richiedeva una grande manualità,e glistrumenti di lavoro erano: beute, provettoni, pipette, becchi Bunsen e sostanze chimiche di vario genere.

Reggio Emilia, 11 Dicembre 2008 3

Negli anni la medicina di laboratorio si è caratterizzata sempre più come settoread alta specializzazione in rapido e continuo progresso. L’aumento del numero e

della tipologia di analisi richieste ha prodotto nei nostri laboratori lo sviluppo di ben 40 settori di lavoro distinti. Le nuove tecnologie e l’informatizzazione

migliorano qualità ed accuratezza del dato, diminuiscono i tempi di risposta, aumentano la sicurezza degli operatori, ma richiedono al TSLB conoscenze, abilità,

e versatilità in situazioni sempre più complesse ed in continua evoluzione.

L’ultima evoluzione del laboratorio riguarda i test di biologia molecolare

5

L’elevata sensibilità di questi test richiede al

tecnico una grandissima attenzione e precisione.

BIOLOGIA MOLECOLAREÈ una branca della biologia che studia i meccanismi molecolari alla base della fisiologia cellulare, concentrandosi in particolare sulle interazioni tra le macromolecole, ovvero proteine e acidi nucleici (DNA e RNA).

La nascita della biologia

molecolare si può far risalire alla scoperta della

struttura del DNA da parte di James Watson e Francis

Crick nel 1953 quando

presentarono ufficialmente il loro modello a doppia elica.

James Watson

Francis CrickReggio Emilia, 11 Dicembre 2008 6


I biologi molecolari studiarono come caratterizzare, isolare e manipolare le componenti molecolari delle cellule e degli organismi con lo scopo di capire i loro

meccanismi di funzionamento più profondi.

DNA = depositario dell’informazione genetica

DNA = fonte di tutte le attività degli esseri viventi

Per biologia molecolare si intende una serie di tecniche che consentono la rilevazione, l'analisi, la

manipolazione e l'amplificazione degli acidi nucleici.

PCR: Reazione di Polimerizzazione a Catena

• È così sensibile da rilevare “teoricamente” anche una singola copia del DNA o RNA bersaglio ed ha un così alto grado di specificità che è entrata di diritto nella diagnostica di laboratorio

• Consente in poche ore di amplificare milioni di volte un segmento di DNA sfruttando i meccanismi cellulari di replicazione del DNA stesso

• Viene utilizzata per segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche di DNA come mutazioni, inserzioni virali e micro-organismipatogeni

• Tecnica inventata nel 1983 dal Dott.Kary Mullis, che gli valse il premio Nobel per la Chimica nel 1993

•Consente di amplificare in vitro segmenti di DNA specifici

Kary Mullis


Animazione PCR

Crescita esponenziale del numero di copie

ottenute con l’aumentare del numero dei cicli

di PCR

DNA stampo

1° ciclo 3° ciclo2° ciclo

•RT-PCR: utilizzata per amplificare l’RNA

•NESTED-PCR: aumenta la specificità dell’analisi

•PCR QUANTITATIVA: consente la quantificazione degli acidi nucleici

•REAL-TIME PCR: tipo di PCR che permette un’analisi in tempo reale

PCR: metodiche derivate


FISH: Ibridizzazione Fluorescente In Situ

•Metodica potente e versatile che permette l’individuazione e la

localizzazione degli acidi nucleici direttamente sul materiale fissato (cellule, cromosomi in metafase o

sezioni di tessuto) sfruttando particolari coloranti fluorescenti

•Permette sia la valutazione di anomalie cromosomiche (trisomie

complete o a mosaico), che la precisa caratterizzazione di riarrangiamenti strutturali (traslocazioni, inversioni,

delezioni, ecc).Reggio Emilia, 11 Dicembre 2008 11

Immagine FISH

Cromosoma marcato con tecnica FISH


Eseguire un esame di biologia molecolare assume significati diversi che dipendono dalla finalitàdell’analisi stessa. Può significare:

•ricercare la presenza di DNA o RNA di varia natura;

•ricercare la presenza nel DNA o nell'RNA di particolari sequenze di geni caratteristiche per ogni specifica patologia;

•ricercare la presenza nei geni dei riarrangiamenti strutturali quando ritenuti responsabili delle varie patologie.

Tutti i laboratori del Dipartimento di Medicina di Laboratorio, del Dipartimento Oncoematologico e Malattie Infettive

dell'Arcispedale Santa Maria Nuova eseguono analisi di biologia molecolare.


L.A.C.C.E: settore COAGULAZIONEEsegue test ematici collegati al rischio di patologie cardiovascolari: la prima causa di mortalità nei Paesi Occidentali

Fattori di rischio: ipercolesterolemiaipertensionediabetefumoobesitàFAMILIARITA’

Il 50% dei soggetti che sviluppano patologie cardiovascolari presentano

come unico fattore di rischio una forte storia di famigliarità indicando una

predisposizione genetica allo sviluppo di tali patologie

Vengono ricercate le mutazioni:del fattore V di Leidendella Protrombina (fattore II)della MTHFR (metilentetraidrofolatoreduttasi)

con varie metodiche di PCR

Queste mutazioni sono normalmente presenti nella popolazione sana ed

esserne portatore non significa necessariamente sviluppare una

patologia cardiovascolare.


Grafici di rilevazione delle PCR del fattore V


Campione positivo

presentante la

mutazione in omozigosi

Campione positivo

presentante la

mutazione in

eterozigosi

Campione negativo,

assenza di mutazione

L.A.C.C.E: settore EMATOLOGIAEsegue test ematici su DNA e RNA per seguire l’esordio, il monitoraggio, e la remissione di patologie leucemiche

DNA: BCL1 – Linfoma mantellareBCL2 – Linfoma follicolare

RNA: BCR/ABL – Leucemia mieloide cronicaPMR RAR α - Leucemia promielociticaAML1ETO – Leucemia acuta mieloide

Vengono utilizzate metodiche di PCR

qualitativa che indicano la

presenza o meno del clone cellulare

cercato.

Di più recente introduzione (2007) sono alcune metodiche di real-time PCR usate come esame prognostico per le leucemie mieloidi croniche sui geni BCR/ABL, JAK2 eWT1


Gel di amplificazione della Mutazione BCR-ABL


Marcatore di riferimento

Campione 1 POSITIVO per la mutazione

Campione 2 NEGATIVO

per la mutazione

Negativo

PCR-ABLPCR-P 190

PCR-P 120

PCR-ABLPCR-P 190

PCR-P 120

PCR-ABLPCR-P 190

PCR-P 120

L.A.C.C.E : settore EMATOLOGIAEsegue test ematici su DNA per confermare le diverse varianti emoglobiniche

DNA: α Talassemiaβ Talassemia- β Talassemia Mediterranea

BeTha Gene 2 / AsiaticaHb S-CHb fetale

Da alcuni anni a questa parte le emoglobinopatie sono aumentate molto, di numero e di variabilità, a causa

dell'immigrazione extracomunitaria che ha portato sul territorio etnie con caratteristiche genetiche tipiche.


LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA: settore BIOLOGIA MOLECOLARE

Esegue test su diverse tipologie di materiali per rilevare la presenza di numerosi agenti infettanti quali virus, batteri e protozoi.

Le tecnologie utilizzate spaziano dalle metodiche manuali, applicate ai campioni con bassa cadenza analitica, fino a quelle di più recente messa a

punto quali le real-time PCR usate ad esempio per la determinazione quantitativa di HIV, HCV e HBV.

VIRUS•v. Erpetici•Enterovirus•Parvovirus•Citomegalovirus•HIV•HCV•HBV

BATTERI•Mycoplasma pneumonie•Borrelia spp.

PROTOZOI•Chlamydia trachomatis•Toxoplasma gondii•Leishmania spp.


Esempio di gel ottenuto dopo PCR.La presenza delle bande indica l’avvenuta amplificazione.

LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA: settore BK

Circa un terzo della popolazione mondiale è infetta da Mycobacterium Tuberculosis ed è esposta ad un rischio del 10% di sviluppare la malattia nel corso dell’esistenza.

La lenta crescita di questo microrganismo (tempo di refertazione della coltura: 42 giorni) ritarda la diagnosi clinica e quindi il trattamento, contribuendo alla diffusione della malattia.

Viene utilizzata una real-time PCR che consente un’analisi rapida (esito in giornata) del campione, favorendo così un intervento medico tempestivo.

Esegue test su campioni di materiali respiratori per la rilevazione diretta del DNA del Complesso Mycobacterium Tuberculosis


LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA: settore BATTERIOLOGIAEsegue test real-time su campioni ematici per rilevare la presenza di batteri e funghi causa di sepsi: una delle principali cause di mortalitàospedaliera

BATTERI•Staphylococcus spp.•Streptococcus spp.•Escherichia coli•Klebsiella spp.•Proteus mirabilis•Pseudomonas aeruginosa, ecc.

FUNGHI•Candida spp.•Aspergillus fumigatus

È stato condotto uno studio per determinare la performance del test su materiali biologici diversi dal sangue (liquor, liquidi biologici vari e pus da ascessi) confrontandone i risultati con quelli ottenuti mediante coltura standard.

Considerando l’importanza dei materiali analizzati e le conseguenze cliniche, i risultati ottenuti fanno concludere che il sistema usato trovi un utile impiego nel

miglioramento della diagnostica microbiologica.

Esempio di grafico delle temperature di melting ottenuto durante la real-time PCR. La presenza dei picchi indica l’avvenuta amplificazione.


SERVIZIO TRASFUSIONALEEsegue, per legge, test con tecniche NAT (tecniche di amplificazione degli acidi nucleici) per garantire la sicurezza degli emocomponentiche ottiene dalle donazioni

Vengono analizzati :• tutti gli aspiranti donatori,• tutte le sacche prelevate,• tutte le donazioni di sangue cordonale.

Obbligo di leggeper esami NAT:•HCV dal 2002•HIV dal 2003•HBV dal 2006

POOLING ESTRAZIONE AMPLIFICAZIONE

ORGANIZZAZIONE DEL LAVORO


LABORATORIO DI GENETICAEsegue test con tecniche di PCR su persone che intraprendono il percorso della fecondazione assistita, per fare diagnosi di ritardo mentale e su donne affette dalla sindrome di Turner

PERCORSO DELLA FECONDAZIONE ASSISTITA•microdelezioni del cromosoma Y – gametogenesi •gene della fibrosi cistica – individuare i portatori sani

RITARDO MENTALE•metilazione del cromosoma 15 – sindrome di Prader-Willie

sindrome di Angelman•cromosoma X – sindrome dell’X fragile

SINDROME DI TURNER•segmenti del cromosoma Y – aumento della probabilità di

patologie tumorali


LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA

Esegue analisi con metodiche FISH per valutare le tipologie di alcune patologie oncologiche e nel caso di aborti spontanei.

•Carcinoma della mammella – ricerca di amplificazioni del gene Her2-neu (cromosoma 17)


•Gliomi - ricerca di delezioni sul cromosoma1 e sul cromosoma 19

•Linfomi – ricerca di traslocazioni cromosomiche tipiche

•Aborti nel 1° trimestre di gravidanza - valutazione del cariotipo

CARCINOMA DELLA MAMMELLA

Campione negativo per l’amplificazione del gene Her2-neu

Campione positivo per l’amplificazione del gene Her2-neu

LINFOMI

Linfoma follicolare Linfoma mantellareReggio Emilia, 11 Dicembre 2008 25

LABORATORIO DI ENDOCRINOLOGIA Abbina tecniche di RT-PCR e real-time PCR per uno studio sulla ricerca di cellule di carcinoma prostatico (CaP) circolanti nel sangue periferico. Il CaP è la neoplasia più frequentemente diagnosticata nel maschio adulto e la seconda causa di morte dopo il tumore al polmone.


Vengono ricercate le micrometastasi circolanti utilizzando il PSA (antigene prostatico specifico) come marcatore molecolare organo specifico, al fine di cercare di predire il decorso della patologia. Il ritrovamento di tali cellule nel

sangue periferico può essere considerato un indice di progresso della malattia. Questa metodica è in grado di individuare correttamente i soggetti sani con

una specificità del 100% in quanto non sono stati riscontrati falsi positivi però, gli elevati costi della metodica, ne fanno presupporre un utilizzo confinato a

casi selezionati per il follow-up e non su larga scala.Lo studio è tutt’ora in corso.

m-RNA del PSA

c-DNA del m-RNA

AmplificatoÈ l’espressione della produzione cellulare di PSA

Se presente indica la presenza di cellule PSA secernenti nel campione (micrometastasi)

RT-PCR PCR

Il TSLB è responsabile dei campioni, ne valuta l’idoneità ed esegue le

procedure per la corretta conservazione e smaltimento.

Attua e controlla le fasi del processo preanalitico e del processo

analitico/produttivo, giudicando il funzionamento della strumentazione utilizzata , la validità dei reagenti e le

modalità operative. Inoltre procede ad una valutuazione e validazione tecnica del dato.

E’ abilitato all’esercizio della professione dal corso di Laurea istituito nel 2001 o da titoli pregressi equipollenti , ma soprattutto attraverso corsi di aggiornamento teorico-

pratici riguardanti gli specifici campi di attività.

IN DEFINITIVA……….

ConclusioniLa biologia molecolare è un’ulteriore dimostrazione della versatilità della professione del tecnico di laboratorio. Oggi il tecnico di laboratorio è un

professionista con competenza teorica e manuale, chiamato a confrontarsi in modo autonomo con una realtà multidisciplinare ad

ampio spettro. Inoltre il continuo divenire tecnologico richiede al TSLB dinamicità, adattabilità e necessità di mantenersi aggiornato per poter

lavorare in modo competente e responsabile.

ADATTABILITA’

RESPONSABILITA’

DINAMICITA’

COMPETENZA

MANUALITA’

VERSATILITA’


Un sentito ringraziamento a tutti i colleghi che hanno contribuito alla realizzazione di questa presentazione.

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