1

Il fuso mitotico in metafaseIl fuso mitotico in metafase

2

3 TIPI DI MICROTUBULI3 TIPI DI MICROTUBULI

1. POLARI (sovrapposti sulla linea mediana del fuso)

2. DEL CINETOCORE (attaccati al cinetocore specializzato)

3. ASTRALI (irradiano in tutte le direzioni dai centrosomi)

3

Attacco dei microtubuli del Attacco dei microtubuli del cinetocore al cromosomacinetocore al cromosoma

4

Forza di esclusione astraleForza di esclusione astrale

• Respinge ciò che si Respinge ciò che si avvicina troppo ai poliavvicina troppo ai poli

• Agisce in direzione Agisce in direzione opposta ai microtubuli del opposta ai microtubuli del cinetocorecinetocore

• Segregazione dei 2 Segregazione dei 2 cromatidi fratelli ai lati cromatidi fratelli ai lati opposti della cellulaopposti della cellula

5

Modello di come Modello di come due forze due forze opposte possono opposte possono cooperare a cooperare a muovere i muovere i cromosomi verso cromosomi verso il centrosoma.il centrosoma.

6

Forze bipolariForze bipolari

• Formazione piastra metafasica• Come cromosomi si allineano a distanza uguale dai 2 poli del

fuso:C) TRAZIONE agisce sui cinetocori e tira i cromosomi

B) SPINTA agisce sui cinetocori e spinge i cromosomi all’equatore

7

• Equilibrio dinamico• Incorporazione tubulina fluorescente• TREADMILLING: subunità tubulina si muovono con

continuità verso i poli

Fuso mitotico in metafaseFuso mitotico in metafase

8

Fuso mitotico in anafaseFuso mitotico in anafase

•Movimento di cromatidi verso i poli

•Accorciamento dei microtubuli del cinetocore

•Separazione dei poli•Allungamento microtubuli polari; movimento spinto da proteine motrici

Anafase A Anafase B

9

Anafase A Anafase A

2 modelli alternativi per spiegare questo movimento:Proteina motrice/ATPMovimento passivo

Forze generate a livello del cinetocoreForze generate a livello del cinetocore

10

Anafase BAnafase B

2 forze agiscono per separare i poli:2. Spinta (microtubuli polari)3. Trazione (microtubuli astrali)

11

12

(C)(C)Microfotografia a Microfotografia a fluorescenza di una fluorescenza di una ameba colorata per ameba colorata per actina (in rosso) e actina (in rosso) e miosina II (in verde) miosina II (in verde)

(B)(B)Microfotografia del Microfotografia del solco di segmentazione solco di segmentazione di una cellula animale di una cellula animale

13

Influenza della posizione degli aster sul piano Influenza della posizione degli aster sul piano di segmentazionedi segmentazione

14

La maggior parte delle cellule si divide La maggior parte delle cellule si divide simmetricamente;simmetricamente;

Il fuso mitotico generalmente è Il fuso mitotico generalmente è posizionato al centro del citoplasma;posizionato al centro del citoplasma;

L’anello contrattile si forma in prossimità L’anello contrattile si forma in prossimità dell’equatore della cellula parentale;dell’equatore della cellula parentale;

Le due cellule figlie hanno uguali Le due cellule figlie hanno uguali dimensionidimensioni

15

In alcuni casi le cellule si dividono asimmetricamente per produrre due cellule figlie che differiscono per

dimensioni e/o contenuto citoplasmatico

Segregazione asimmetrica di componenti citoplasmatici (granuli P fluorescenti) in una cellula figlia durante la prima divisione mitotica dell’uovo fecondato di C. elegans. I granuli P vengono ereditati solo dalle cellule che daranno origine a uova e a spermatozoi.

Colorazione in blu del DNA

Localizzazionedei granuli P con anticorpo fluorescente

16

Per creare due cellule figlie con destini diversi, la Per creare due cellule figlie con destini diversi, la cellula madre deve prima segregare alcuni componenti cellula madre deve prima segregare alcuni componenti (determinanti del destino)(determinanti del destino) ad un lato della cellula e poi ad un lato della cellula e poi posizionare il piano di divisione in modo che la cellula posizionare il piano di divisione in modo che la cellula

figlia appropriata erediti questi componenti.figlia appropriata erediti questi componenti.

Il fuso mitotico deve essere mosso in maniera Il fuso mitotico deve essere mosso in maniera controllata all’interno della cellula in divisione controllata all’interno della cellula in divisione

17

18

La divisione asimmetrica è particolarmente importante nelle cellule vegetali.

Poiché queste cellule non possono muoversi dopo la citocinesi, la scelta dei piani di divisione è cruciale per determinare la morfologia del tessuto.

I movimenti del fuso mitotico sono diretti da I movimenti del fuso mitotico sono diretti da cambiamenti in regioni locali della corteccia cambiamenti in regioni locali della corteccia cellulare.cellulare.

Proteine motrici presenti in queste regioni sono Proteine motrici presenti in queste regioni sono responsabili del movimento dei microtubuli astrali.responsabili del movimento dei microtubuli astrali.

19

Differenti Differenti

meccanismi di meccanismi di

separazione dei separazione dei

cromosomi sono cromosomi sono

usati in diversi usati in diversi

organismiorganismi

20

START or Restriction PointSTART or Restriction Point

The Cell CycleThe Cell Cycle

The durations of G1 and G2 are variable,

even within an organism or cell type.The durations of S and M are usually quite consistent

21

Cardiac muscle cells ⇒ they no longer dividethey no longer divide

Skin fibroblasts, smooth muscle cells, endothelial cells of blood vessels, and the epithelial cells of

most internal organs ⇒ they can resume they can resume proliferation to replace dead cellsproliferation to replace dead cells

Liver cells normally divide rarely ⇒ but if a large but if a large number of cells is lost, the remaining ones number of cells is lost, the remaining ones proliferate to replace the missing ones.proliferate to replace the missing ones.

Differentiated cellsDifferentiated cells

22

Some types of differentiated cells are replaced via proliferation of cells that are less differentiated, and

called stem cells

STEM CELLS

Unipotent stem cells produce only one type of differentiated cell, whereas totipotent ones produce many different differentiated cells

23

Formazione delle cellule differenziate del sangue dalle Formazione delle cellule differenziate del sangue dalle cellule staminali ematopietiche del midollo osseocellule staminali ematopietiche del midollo osseo

24

They are stem cells with the most powerful differentiative ability.They are present in the early embryo and can give rise to all kind of differentiated cell types of the adult organism.

Embryonal stem cells

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Results from the breakdown of the regulatory mechanisms that govern normal cell behavior (proliferation, differentiation, apoptosis, necrosis).

When cell regulation is lost, cancer cells will grow and divide, and ultimately spread throughout the body interfering with the function of tissues and organs.

CANCERCANCER

26

Arresto in G1Arresto in G1✠ Cellule del sistema nervoso centrale differenziate;Cellule del sistema nervoso centrale differenziate;

✠ Cellule del tessuto muscolare differenziate;Cellule del tessuto muscolare differenziate;

✠ Cellule dei tessuti che costituiscono la radice, il fusto e le Cellule dei tessuti che costituiscono la radice, il fusto e le foglie delle piante (ad eccezione dei meristemi e dei cambi)foglie delle piante (ad eccezione dei meristemi e dei cambi)

Arresto in G2Arresto in G2✠ Cellule renali dei vertebrati superiori;Cellule renali dei vertebrati superiori;

✠ Cellule dell’epidermide dell’orecchio del topo;Cellule dell’epidermide dell’orecchio del topo;

✠ Alcune cellule embrionali di DrosophilaAlcune cellule embrionali di Drosophila

27

Le tre fasi principali del ciclo cellulare (INTERFASE, MITOSI, CITODIERESIINTERFASE, MITOSI, CITODIERESI) sono coordinate e presenti tutte all’interno di un

ciclo cellulare tipico.

1. Cromosomi politenici di Drosophila melanogasterReplicazione del DNA e assenza di citodieresi

ECCEZIONIECCEZIONI

Formazione di nuclei politeniciFormazione di nuclei politenici

28

Il DNA di ciascuno dei quattro cromosomi di D. melanogaster è stato replicato attraverso 10 cicli senza separazione dei cromosomi figli, sicchè 1024 (210) filamenti identici di cromatina sono allineati fianco a fianco.I quattro cromosomi sono uniti in corrispondenza dei cromocentri.

29

2. Cellule multinucleate del fegato dei mammiferiAlla replicazione del DNA e alla mitosi non segue la citodieresi

3. 3. Cellule dell’endosperma dei cerealiCellule dell’endosperma dei cerealiCicli successivi di replicazione del DNA e mitosi

Produzione di cellule mono nucleateProduzione di cellule mono nucleate

citodieresi

Produzione di un embrione precoce multinucleato

30

GermGermcontains vitamins, minerals,protein and fat

EndospermEndospermcontains mainly starch and protein

Seed coatSeed coatcontains many minerals, vitamins and dietary fibre

Section through a gran of cerealSection through a gran of cereal

31

Crescita cellulare e contenuto di DNA Crescita cellulare e contenuto di DNA durante un ciclo cellulare durante un ciclo cellulare

Processi continuiProcessi continui: avvengono durante l’interfase e portano ad un processo continuo di crescita: sintesi di nuovi ribosomi, membrane, mitocondri, proteine cellulari

Processi discontinuiProcessi discontinui: avvengono una sola volta per ogni ciclo cellulare: sintesi di DNA, segregazione dei cromosomi

32

INTERFASEINTERFASE

FASE G1: sintesi di proteine, carboidrati, lipidi

FASE S: sintesi di DNA e di proteine che legano i cromosomi

FASE G2: sintesi delle proteine necessarie per l’ingresso in Mitosi

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Different cell cycleDifferent cell cycle

The shortest cell cycle occur in early embryos (8 min). The length of each cycle is very constant.

The cell cycle of growing cells lasts from 90 min to more than 24 h; its duration is variable within a population of cells.

Post-embryonic cells can leave the cell cycle for several hours or years.

34

INDUZIONE: si ottiene mediante l’uso di droghe specifiche che bloccano il ciclo cellulare in momenti particolari; la rimozione del blocco consente la ripresa del ciclo di tutte le cellule in coltura

SELEZIONE: si isola una sub-popolazione di cellule che si trovano nella stessa fase del ciclo cellulare (cell sorting).

Le cellule somatiche non crescono in maniera Le cellule somatiche non crescono in maniera sincrona; la loro sincronizzazione puo’ sincrona; la loro sincronizzazione puo’ avvenire in due modi:avvenire in due modi:

Le cellule precoci embrionali fertilizzate sono Le cellule precoci embrionali fertilizzate sono “naturalmente” sincronizzate. Uso di cellule “naturalmente” sincronizzate. Uso di cellule embrionali di riccio di mare e embrionali di riccio di mare e Xenopus leavisXenopus leavis..

35

G1 S G2 M G1 S G2 M

S M S MS M S M S M

ciclo cellulare standard

ciclo cellulare embrionale precoce

Nel ciclo cellulare delle cellule embrionali precoci non si ha crescita, così che ciascuna cellula figlia è la metà della cellula madre.La durata del ciclo è breve e le fasi S e M si alternano senza fasi G1 e G2.

36

Crescita cellulare di cellule somatiche e di Crescita cellulare di cellule somatiche e di cellule embrionali cellule embrionali

Le cellule somatiche “nascono” piccole e devono importare nutrienti per poter crescere e duplicare la massa cellulare.

Le cellule embrionali ”nascono” già grandi ed ereditano tutti i nutrienti dalla cellula madre.

37

Ciclo cellulare ed embrionale di Ciclo cellulare ed embrionale di Xenopus leavisXenopus leavis

Una femmina di rana produce svariate migliaia di uova di circa 1 mm di diametro che possono dare origine ad una popolazione enorme di cellule che si riproducono in maniera sincrona per parecchi cicli cellulari.

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Crescita dell’oocita e divisione dell’uovo Crescita dell’oocita e divisione dell’uovo in in XenopusXenopus

Dopo la fecondazione l’uovo si divide repentinamente (12 divisioni sincrone di circa 30 min) per produrre la blastula che darà poi origine ad un girino multicellulare entro un giorno o due.

39

Different experimental systems have contributed Different experimental systems have contributed distinct kinds of information to our understanding distinct kinds of information to our understanding

of the cell division cycleof the cell division cycle

Embryos (amphibian and echinoderm)Embryos (amphibian and echinoderm) have provided large numbers of synchronized cells for useful biochemistry, which has in turn led to the identification of important control proteins;

Mammalian cellsMammalian cells showed us the subdivision of interphase into G1, S, and G2;

Yeast cellsYeast cells have provided insight into the pathways that control the decision to move from one stage to the next.

40

Experimental Systems Important for Cell Cycle StudiesExperimental Systems Important for Cell Cycle Studies

Arbacia punctulata(riccio di mare)

Xenopus leavisSchizosaccharomyces pombe

Saccharomyces cerevisiae

Fused mammalian cells

41

Quali sono gli approcci sperimentali che si possono Quali sono gli approcci sperimentali che si possono

usare per definire in quale fase del ciclo cellulare usare per definire in quale fase del ciclo cellulare

si trova una popolazione di cellule sincrone?si trova una popolazione di cellule sincrone?

INDICE DI MARCATURA:INDICE DI MARCATURA:

Marcatura degli acidi nucleici con composti Marcatura degli acidi nucleici con composti

radioattivi o con bromodeossiuridina (BrdU).radioattivi o con bromodeossiuridina (BrdU).

INDICE MITOTICO:INDICE MITOTICO:

Esame delle cellule in mitosi: stima della durata Esame delle cellule in mitosi: stima della durata

della fase M.della fase M.

42

Various labeling schemes

Label with 3H thymidine: DNALabel with 3H uridine: RNALabel with 35S: proteins

Autoradiograph to see where label has gone

But: To achieve some sense of when materials are being synthesized: use “pulse” labeling technique

Add labelWash cells

Time

43

1. Feed radioactivethymidine (T*) tocells growing inculture.

2. After 30 minutes,wash unincorporatedT* out of cell culture.

3. Spread out cellsand lay x-ray filmover them.

Only interphase cells are labeled with T*

Typical method of study: a pulse labeling experiment

T*

44

Separatore cellulare attivato dalla Separatore cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS)fluorescenza (FACS)

45

Analisi del contenuto di DNA in Analisi del contenuto di DNA in due popolazioni cellularidue popolazioni cellulari

A: distribuzione di cellule di controlloA: distribuzione di cellule di controlloB: cellule bloccate in G1 B: cellule bloccate in G1

G1 G1

S

G2/M

46

Completion problem: Completion problem: How does a cell know each cell cycle step is How does a cell know each cell cycle step is

complete?complete?

Multiple checkpointsMultiple checkpoints

G1 Checkpoint:G1 Checkpoint: “Is my DNA damaged?”“Is my DNA damaged?”G2 Checkpoint:G2 Checkpoint: “Is my DNA replicated?”“Is my DNA replicated?”Mitotic Checkpoint:Mitotic Checkpoint: “Are my chromosomes “Are my chromosomes

properly attached to the properly attached to the spindle?”spindle?”

47

48

Il ciclo cellulare è il risultato finale Il ciclo cellulare è il risultato finale dell’azione di una serie di dell’azione di una serie di EVENTI EVENTI

COSTITUTIVICOSTITUTIVI che sono alla base del che sono alla base del funzionamento del macchinario del funzionamento del macchinario del

ciclo cellulare e l’azione di ciclo cellulare e l’azione di ELEMENTI ELEMENTI REGOLATIVIREGOLATIVI che rappresentano che rappresentano

l’interfaccia con l’ambiente esternol’interfaccia con l’ambiente esterno

49

Cell Cycle CheckpointsCell Cycle Checkpoints

50

La logica del ciclo cellulare:La logica del ciclo cellulare:• I cromosomi devono essere REPLICATI correttamente• I cromosomi devono essere SEGREGATI correttamente

La REPLICAZIONE e la SEGREGAZIONE devono essereCOORDINATECOORDINATE

La mitosi può iniziare solo se tutto il DNA è stato replicato: esempio di COMPLETAMENTO delle fasi

Ad ogni mitosi deve corrispondere una sola duplicazione del DNA: esempio di ALTERNANZA delle fasi

51

52

Cell fusion experimentsCell fusion experiments

53

Fusion of mitotic cell to interphase cellsFusion of mitotic cell to interphase cells

Interphase cells are induced to enter mitosis: chromosome Interphase cells are induced to enter mitosis: chromosome condensation + nuclear membrane breakdowncondensation + nuclear membrane breakdown

54

Fusione fra cellule in interfase e cellule in Fusione fra cellule in interfase e cellule in mitosi:mitosi:

La mitosi è dominante rispetto alle altre fasi;

Le cellule in mitosi contengono dei fattori solubili che inducono cellule in interfase ad entrare prematuramente in mitosi

M-phase Promoting Factor = MPFM-phase Promoting Factor = MPF

55

Fusione fra cellule in G1 e cellule in S:Fusione fra cellule in G1 e cellule in S:

Le cellule in S contengono dei fattori solubili che inducono la replicazione in nuclei in G1;

L’eterocarion fuso non entra in M fino a che il nucleo G1 non si è replicato

CONTROLLO FEEDBACKCONTROLLO FEEDBACK

56

Fusione fra cellule in G2 e cellule in S:Fusione fra cellule in G2 e cellule in S:

Le cellule in G2 non rientrano in S;

L’eterocarion fuso entra in M solo quando tutto il nucleo in S è stato completamente replicato

Blocco di rireplicazioneBlocco di rireplicazione

57

Different experimental systems have Different experimental systems have contributed distinct kinds of information to our contributed distinct kinds of information to our

understanding of the cell division cycleunderstanding of the cell division cycle

Mammalian cellsMammalian cells showed us the subdivision of interphase into G1, S, and G2

EmbryosEmbryos (amphibian and echinoderm) have provided large numbers of synchronized cells for useful biochemistry, which has in turn led to the identification of important control proteins

Yeast cellsYeast cells have provided insight into the pathways that control the decision to move from one stage to the next

58

Xenopus Xenopus oocyte maturationoocyte maturation

Good model for studying cell cycle regulation Oocyte cytoplasm can be obtained in quantity

and manipulated, allowing both experimental and biochemical studies

59

Maturation of frog eggs is induced by Maturation of frog eggs is induced by progesterone, induction of progesterone, induction of

embryogenesis is induced by a spermembryogenesis is induced by a sperm

Maturation Activation

Use Oocyte maturation to study a simple, synchronized cell cycleHormone can drive G2 - MActivation can drive M-G1

60Yoshio Masui, Differentiation (2001) 69:1-17

Once they are activated, oocytes produce a cytoplasmic Maturation Promoting Factor (MPF), which is Transferable and Autocatalytically produced

~100x dil. ~100x dil. ~100x dil.

(106 x dil.In toto)

61

MPF turns out to regulate the MPF turns out to regulate the embryonic Cell Cycleembryonic Cell Cycle

Yoshio Masui, Differentiation (2001) 69:1-17

MPF Regulates Mitosis as well as Meiosis

62

How to pursue the purification of How to pursue the purification of MFP? Take advantage of synchronyMFP? Take advantage of synchrony

Collect many eggs that contain active MPF Crush them and make cytoplasm or “egg

extract” Fractionate by standard biochemistry, but

use a bioassay for MPF activity Achieve several thousand-fold purification

63

centrifuge

Xenopus laevis egg extract system

collect Cytoplasm

= “egg extract”

Xenopussperm nucleus

+rhodamine tubulinspindle assembly

in vitro

+ Ca++

interphase

64

Preparazione del citoplasma di XenopusPreparazione del citoplasma di Xenopus

65

Add Xenopus sperm nuclei can undergo rounds of S and M-phase centrosome attached that nucleates microtubules stain with blue DNA dye

Add rhodamine-labeled tubulin incorporates into frog microtubules microtubules appear red

To follow changes during the cell cycle:To follow changes during the cell cycle:

66

- use of cell free assay to purify MPF- test on various cytosolic fractions for MPF activity

MPF

67

Assay for Maturation Promoting Factor (MPF)Assay for Maturation Promoting Factor (MPF)

68

MPF Activity Peaks Before Each Cell DivisionMPF Activity Peaks Before Each Cell Division

Moreover, MPF has kinase activityMoreover, MPF has kinase activity

69

M-phase promoting factor = MPF M-phase promoting factor = MPF =cdk1/cyclinB=cdk1/cyclinB

cdk1 cyclin dependent kinase 1 (32 kDa) Induces mitosis by phosphorylating

specific downstream targets on serine and threonine

cyclin B (45 kDa) regulatory subunit that activates cdk1 abundance oscillates during the cell cycle

MPF is a 2 subunit protein kinase complex:

70

Cyclin was Discovered in Sea Urchin EmbryosCyclin was Discovered in Sea Urchin Embryos

ProteinLevel

Time

cyclin A cyclin B

M M M

can stimulate to

lay lots of eggs

71

2001 Nobel Prize in Medicine

Paul Nurse Lee Hartwell

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Yeast:Identified genes that regulate the cell cycle and showed that humans also have them

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Tim Hunt

Sea urchin:Identified cyclinproteins in sea urchin eggs

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“for their discovery of key regulators of the cell cycle”

72

La presenza di La presenza di inibitori della sintesi inibitori della sintesi proteica blocca l’uovo proteica blocca l’uovo

fertilizzato in fertilizzato in interfaseinterfase

L’aggiunta di MPF L’aggiunta di MPF spinge l’uovo in mitosi spinge l’uovo in mitosi anche in presenza di anche in presenza di inibitori della sintesi inibitori della sintesi

proteica proteica

73

Il progesterone induce l’attivazione di MPF e la Il progesterone induce l’attivazione di MPF e la rottura della membrana nucleare solo se l’oocita è in rottura della membrana nucleare solo se l’oocita è in grado di sintetizzare proteine;grado di sintetizzare proteine;

Gli oociti devono contenere complessi (definiti pre-Gli oociti devono contenere complessi (definiti pre-MPF) che possono essere convertiti in MPF attivo MPF) che possono essere convertiti in MPF attivo mediante modifiche post-traduzionali;mediante modifiche post-traduzionali;

L’attivazione di MPF è un evento citoplasmatico L’attivazione di MPF è un evento citoplasmatico poiché oociti privati del nucleo continuano a produrre poiché oociti privati del nucleo continuano a produrre MPF attivo se trattati con progesteroneMPF attivo se trattati con progesterone

L’iniezione di citoplasma contenente MPF induce la L’iniezione di citoplasma contenente MPF induce la maturazione anche se la sintesi proteica dell’oocita maturazione anche se la sintesi proteica dell’oocita recipiente è inibitarecipiente è inibita

74

L’attività di MPF oscilla indipendentemente dalla L’attività di MPF oscilla indipendentemente dalla sintesi di DNA e dall’assemblaggio del fuso mitoticosintesi di DNA e dall’assemblaggio del fuso mitotico

Presenza di Presenza di afidicolinaafidicolina (inibitore della (inibitore della

polimerizzazione di DNA) polimerizzazione di DNA)

Presenza di Presenza di nocodazolonocodazolo (inibitore dell’assemblaggio (inibitore dell’assemblaggio

del fuso) del fuso)

75

Schema di funzionamento del ciclo cellulareSchema di funzionamento del ciclo cellulare

Il “motore” del ciclo cellulare Il “motore” del ciclo cellulare è MPF: una elevata è MPF: una elevata

concentrazione di MPF concentrazione di MPF induce la mitosi e una sua induce la mitosi e una sua

bassa concentrazione induce bassa concentrazione induce l’ingresso in interfasel’ingresso in interfase

76

Organizzazione del ciclo cellulare di una cellulaOrganizzazione del ciclo cellulare di una cellula

embrionaleembrionale somaticasomatica

77

Il ciclo cellulare embrionale ha solo due transizioni: Il ciclo cellulare embrionale ha solo due transizioni: attivazioneattivazione e e inattivazioneinattivazione di MPF di MPF

Nel ciclo cellulare di una cellula somatica c’è anche Nel ciclo cellulare di una cellula somatica c’è anche una terza transizione: una terza transizione: STARTSTART

78

Two sets of studies converged on same regulators of the cell cycle:

3.3. Identification of proteins whose abundance varied Identification of proteins whose abundance varied with the cell cycle from the eggs of marine with the cell cycle from the eggs of marine invertebrates;invertebrates;

4.4. Identification of mutants and the subsequent cloning Identification of mutants and the subsequent cloning of the corresponding genes that are defective in of the corresponding genes that are defective in cell cycle progression.cell cycle progression.

These lines of investigations converged on the same These lines of investigations converged on the same set of regulatory proteins.set of regulatory proteins.

The mechanisms regulating the progression through The mechanisms regulating the progression through the cell division cycle are largely conserved in all the cell division cycle are largely conserved in all eukaryotes!!eukaryotes!!

79

MPF regulation was elucidated MPF regulation was elucidated by Tim Hunt’s discovery of Cyclinsby Tim Hunt’s discovery of Cyclins

Cyclin B protein is synthesized continuously Threshold cyclin B level induces MPF kinase activity Cyclin B disappears suddenly during anaphase

80

81

Purification of MPF: The BirthPurification of MPF: The Birthof Cyclin Dependent Kinasesof Cyclin Dependent Kinases

This is cdc2+!!(Cdc28 in

S. cerevisiae)

This is cyclin!!

(cdc13+

in S. pombe)

82

Interphase Interphase Inactive MPFInactive MPF

Mitosis Mitosis Active MPFActive MPF

Cyclin synthesisCyclin synthesis

Cyclin degradationCyclin degradation

83

Dimostrazione che la sintesi e la degradazione della Dimostrazione che la sintesi e la degradazione della ciclina sono necessarie per le oscillazioni cicliche ciclina sono necessarie per le oscillazioni cicliche

dell’attività dell’MPFdell’attività dell’MPF

84

Cyclins are synthesized and degraded Cyclins are synthesized and degraded during each cell cycleduring each cell cycle

Cyclin B:• abundance peaks during G2/M• degraded at anaphase onset

Anaphase-promoting complex (APC) causesPolyubiquitination of cyclin B

Cyclins are a family of related proteins

Ubiquitination triggers degradation by the proteasome

85

86

G1 S G2 M G1

Cyclin Destruction Drives Mitotic ExitCyclin Destruction Drives Mitotic Exit

87

Mitotic Cyclins are Destroyed by Mitotic Cyclins are Destroyed by Ubiquitin-Dependent ProteolysisUbiquitin-Dependent Proteolysis

M-cyclin

Cdk

M-cyclin

Cdk