“I virus vegetali nellaformulazione di un

vaccinocontro il virus HIV-1”

Carla MarusicUTS BIOTEC-GEN

ENEA - Trisaia

"Molecular Farming:produzione di cibi funzionali,

di nutraceutici ebiofarmaceutici" ENEA - Casaccia4 Dicembre 2003

VsVs

Piante come “biofabbriche” per laproduzione di vaccini

Nature Reviews Genetics (2003) Vol.4; 794-805

Molecole a scopo vaccinale espresse in piante transgeniche

Vaccini in trial clinico

Nucleo

Gene inserito

Proteina estranea

2) Trasformazionetransiente mediata daVirus Vegetali (PVX) Cellula vegetale

DNA della pianta

Nucleo

Vettore virale

Trasformazione della cellula vegetale

Nucleo

Proteina estranea

Replicazionedel virus

1) Trasformazionestabile mediata da

Agrobacterium Cellula vegetale

DNA della pianta

Nucleo

Confronto tra due sistemi di espressione in pianta

Vaccine 19 (2001) 2735–2741

Strategie di clonaggio per l’espressione dimolecole vaccinali mediata da virus vegetali

Genoma virale WT

Replicasi Movimento Proteina di rivestimento

Gene estraneo

+

Genoma virale modificatoA)

B)

Particelle Virali Chimeriche

Patogeno Pianta Proteina Sistema diEspressione

Bibliografia

Virus di Norwalk Tabacco/Patata

Virus vegetaleAMT

Proteina dirivestimento delvirus di Norwalk

Influenza Tabacco Virus vegetale TMV

EmoagglutininaEngineering plants forcommercial products andapplications (eds. CollinsG.B. and Sheperd, R.J.) 1996

HIVTabacco/ Fagiolo

N. benthamiana

Virus vegetaleAMT/CPMV

HIV epitopo (gp120)

HIV epitopo (gp41)

Curr. Opin. Biotechnol.11, 199-204 (2000)

J.Virol. Vol 75, 8434-8439 (2001)

Virus vegetale PVX

TrendsBiotechnol. 15,441-444 (1997)

TabaccoVirus vegetaleAMT

proteina disuperficie SpaA

Microbes Infect. 1,777-783 (1999).Streptococcus

mutans(agente della carie)

Molecole a scopo vaccinale espresse mediante virus vegetali

Produzione di vaccini mediante esposizione suvirus vegetali, principali vantaggi :

•Facilità di manipolazione del genoma virale

•Elevati livelli di produzione di virus ricombinante per peso fresco di tessuto infetto

•Purificazione del virus rapida ed efficiente

•Molti virus vegetali sono stabili a temperatura ambiente

•Ciascuna particella virale può esporre molte copie del frammento proteico scelto (da 60 fino a 2,000 copie per virione)

•La produzione e validazione di un nuovo vaccino può essere ottenutain tempi molto brevi

Programma Nazionale di Ricerca sull’AIDSProgetto: Piante ingegnerizzate come

biofabbriche per la formulazione di vaccini.Sviluppo di un vaccino anti HIV-1

Vaccino contro HIV-1: una sfida

• Il virus HIV-1 muta molto velocemente

• Il virus deve essere bloccato in una fase precoce dell’infezione

• Scelta dell’antigene, punti cruciali:

• Variazioni nella conformazione delle proteine virali (isolatiprimari e ceppi di laboratorio).

Attivazione del sistema immunitario per indurre la produzionedi anticorpi neutralizzanti capaci di bloccare il virus nelleprimissime fasi dell’infezione.

•Induzione di una risposta immunitaria di tipo cellulare conproduzione di cellule del sistema immunitario specializzate ingrado di eliminare il virus ed eventuali cellule infettate.

Proteine coinvolte nel processo di penetrazione del virus HIV-1 all’interno della cellula bersaglio

‘Broadly Neutralizing Antibodies Targeted to the Membrane-Proximal External Region ofHuman Immunodeficiency Virus Type 1 Glycoprotein gp41’MICHAEL B. ZWICK et al. JOURNAL OF VIROLOGY, 2001, p. 10892–10905

Modello della struttura dellaglicoproteina gp41

HIV-1

gp 41 (2F5)

PVX-2F5

Particelle di virus X della patata (PVX) cheespongono sulla loro superficie unaporzione della proteina gp41 di HIV-1

Clonaggio della sequenza HIV-1 nel genoma del PVX

•Ogni Particella ViraleChimerica di PVX ècostituita da circa 1300molecole di CP.

Pianta infettata con il PVX-2F5

0200400600800

100012001400

C- WT-PVX PVX-2F5E

OD

405

Gli estratti di pianta reagisconocon anticorpi umani anti HIV-1

CsC

l gra

dien

t

Purificazione del virus

Per via intraperitonealePer via intraperitoneale

PrelieviPrelievi

GiorniGiorni 0 14 28 42 56 70

ImmunizzazioniImmunizzazioni

Per via intranasalePer via intranasale

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70

Immunizzazione di topi con il virus PVX-2F5

0

500

1000

1500

14 28 42 56 70

0500

100015002000250030003500

0500

100015002000250030003500

WT-PVXWT-PVX

0500100015002000250030003500

PVX-2F5E

500

1000

1500

0 14 28 42 56 70

IgA (Somministrazione IN)

IgG (Somministrazione IN)

Risposta immunitaria indotta dal virus PVX-2F5

0 14 28 42 56 70Giorni

0500

100015002000250030003500

IgG (Somministrazione IP)

OD

405

Il PVX-2F5 induce la produzione di anticorpi umaniin un modello murino “umanizzato” SCID (Severe

Combined Immuno-Deficient Mice)

Prelievi edanalisi deisieri

1Giorni 1 2

Identificazione diAnticorpi umani anti-HIV

0 7 50

0.2 0.4 0.6

0.81.0

1.21.41.6

O.D

.405

nm

Topi trattatiTopi controlloTopi controllo

Purificazione di cellulemononucleate del sangue

periferico

Prelievo da un donatore sano

Gra

dien

te d

i den

sità

Cellule Dendriticheumane trattate con ilvirus PVX-2F5

Topo SCID ricostituito con celluleumane del donatore sano

Immunizzazionecon le cellule

dendritiche trattate

Inibizione della formazione disincizi indotta dal virus HIV-1

HIV-1IIIB

Siero topiSCID

Siero topiC57BL/10

Cellule in coltura

Saggio di Neutralizzazione del virus HIV-1in vitro

0102030405060708090100

20 40 80 160 320Diluizione del siero

M1M4H4M7H6

% D

i Neu

tral

izza

zion

e

Produzione di un vaccino mediante virus vegetali

2) Clonaggio nel vettore virale

3) Infezione della pianta e purificazione del virus

CsC

l gra

dien

t

1) Identificazione della sequenza di interesse

Gp41 epitopo 2F5

4) Esperimenti di immunizzazione in modelli animali

•Le Particelle Virali Chimeriche PVX-2F5 espongono un epitopo di HIV-1 altamente conservato.

Conclusioni

•Inducono una potente risposta immunitaria neutralizzante sia in topi normali che nel modello “umanizzato” SCID (Hu-PBL-SCID).

•L’immunizzazione per via intranasale induce la produzione di alti livelli di anticorpi associati alle mucose (IgA).

•La risposta immunitaria è stata ottenuta senza l’aggiunta di adiuvanti.

Brevetto Congiunto ENEA – ISSInventori: Benvenuto E., Marusic C., Belardelli F.

Rizza P., Capone I. 01.02.2002 EP 1 167 530 A3

Manipolazione del PVX, infezioni dipianta, purificazione del virus,analisi dei sieri. Immunizzazioni eprelievi.

Modello SCID e saggi di neutralizzazione in vitro.

Progetti futuri

•Valutare l’efficacia del sistema PVX nell’induzione di risposte immunitarie di tipo cellulare

• Capire l’effetto di PVX come adiuvante

•Valutare/verificare la sicurezza del sistema PVX in modelli animali e nell’uomo

•Costruire nuove Particelle Virali Chimeriche per la formulazione di un vaccino multicomponente

SIXTH FRAMEWORK PROGRAMMEPRIORITY [LSH-2002-1.2.5-2]RECOMBINANT PHARMACEUTICALS FROM PLANTFOR HUMAN HEALTH(PHARMA-PLANTA)

Selene BaschieriChiara LicoFloriana CapuanoCamillo Mancini

Eugenio BenvenutoResponsabile di progetto

Collaboratori esterni

Filippo BelardelliDirettore del Laboratorio di VirologiaIstituto Superiore di Sanita’,Roma