1

METODI DELLA MICROBIOLOGIA

•Microscopia:otticaelettronica: a trasmissione, a scansione.

•Sterilizzazione e inibizione della crescita:metodi fisici:

calore (umido, secco, incinerazione). radiazioni (UV; ionizzanti: X, gamma).filtrazione

metodi chimici•Coltivazione dei microrganismi:

terreni di colturaisolamento di microrganismi da ambienti naturalicolture pureanalisi della crescita batterica

Riferimenti:LaboratorioBrock, cap. 6, 14

METODI DELLA MICROBIOLOGIA

• LA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI:

STRUMENTO INDISPENSABILE PER POTERLI IDENTIFICARE, STUDIARE, CARATTERIZZARE

CI FORNISCE INFORMAZIONI SUI FLUSSI DI MATERIA ED ENERGIA NECESSARI PER IL "MANTENIMENTO" E "RIPRODUZIONE" DELL'ORGANISMO

• RICHIEDE:

SERILIZZAZIONE DEL MATERIALE

FORMULAZIONE DEI TERRENI E DELLE CONDIZIONI DI COLTURA

Sterilizzazione e altri metodi di controllo della crescita microbica

Metodi fisici: CALORE

incinerazione: bunsen, forni crematori…

calore secco: stufa: 160 °C/2h; 170 °C/1h…

calore umido: autoclave (o pentola a pressione): 121 °C/15 min

per l'abbattimento della carica microbica:bollitura: 100 °C/30 minbollitura ripetuta 3 voltepastorizzazione: 63 °C/30 min

oppure 72 °C/15 sec

2

Sterilizzazione e altri metodi di controllo della crescita microbica

tempo (min)

fraz

ione

di s

oprv

vive

nti

1

0.1

0.01

0.001

tempo di riduzione decimale

50 °C

60 °C70 °C

Metodi fisici: CALORE

Sterilizzazione e altri metodi di controllo della crescita microbica

Metodi fisici: RADIAZIONI: UV: 220-300 nm(lampade germicide)

radiazioni ionizzanti

Metodi fisici: FILTRAZIONE:

membrane filtranti 0.45 µm0.20 µm

Uso di COMPOSTI CHIMICI

• -STATICI (batteriostatici, fungistatici, virostatici…)

• -CIDI (battericidi, fungicidi, virocidi…)

• -LITICI (batteriolitici)

Sterilizzazione e altri metodi di controllo della crescita microbica Sterilizzazione e altri metodi di controllo della crescita microbica

Uso di COMPOSTI CHIMICI

• ANTISETTICI: Non (troppo) dannosi per pelle e mucose• DISINFETTANTI: Danneggiano i tessuti animali.

• CONSERVANTI: (non dovrebbero essere tossici se ingeriti)

• CHEMIOTERAPICI: tossicità selettiva• ANTIBIOTICI: ne riparleremo

3

Antisettici e disinfettanti

Agente uso modo di azione

ANTISETTICIOrgano mercuriali pelle si combinano coi gruppi –SH delle proteineTintura di iodio pelle iodina le tirosine; agente ossidanteAlcol 70% pelle scioglie i lipidi, denatura le proteineDifenoli (esaclorofene) saponi detergente, danneggia le membraneDetergenti cationici saponi danneggiano le membraneAcqua ossigenata pelle agente ossidante……..

DISINFETTANTICloro gassoso acqua potabile agente ossidanteComposti di cloro industria alimentare agente ossidanteComposti fenolici superfici denatura le proteineOssido di etilene materiale di laboratorio agente alchilante

termosensibile (plastica…)Ozono acqua potabile forte agente ossidante…….

Terreni di coltura

•LIQUIDI

•SOLIDIcapsule di Petri (piastre)

Beute, provette, piastre (capsule di Petri)

. . ....

.. .

....

.

Terreni di coltura liquidi e solidi

Tecniche asettiche per il prelievo e l'inoculo di microrganismi

4

"striscio" con ansa per ottenere colonie isolate

Tecniche asettiche per il prelievo e l'inoculo di microrganismi

- SPATOLAMENTO

- INCLUSIONE IN AGAR SCIOLTO

Tecniche asettiche per il prelievo e l'inoculo di microrganismi

PIASTRAMENTO CON AGAR MOLLE (TOP AGAR, SOFT AGAR)

5

Terreni di coltura: composizione

•Minimi •Completi•Ricchi (brodi)

•Sintetici (chimicamente definiti)•Complessi

•Di arricchimento•Selettivi

COLTURA PURA

• Campionamento da ambienti naturali.

• Inoculo in terreno solido o liquido appropriato (di arricchimento, più o meno selettivo).

• Purificazione: normalmente per strisci successivi (almeno 2-3) in terreno solido

• Rinnovo e mantenimento di ceppi puri

Colonie batteriche e fungine Colonie batteriche

6

Formazione di una colonia (a)

http://www-micro.msb.le.ac.uk/Video/pneumo.mov

Crescita di batteri su un terreno solido (colonie)

(visti a occhio nudo dopo varie ore di incubazione)

Studio della crescitaMetodi per il conteggio dei microrganismi.Misurare l’incremento di una popolazione microbica.Curva di crescita.Descrizione matematica della crescita.

Velocità di crescita, Tempo di generazione.

Crescita “in batch”, crescita in continuo, chemostato. Resa di crescita.

Principi generali della nutrizione microbicaGruppi metabolici

diversità e versatilità metabolica dei procarioti

Studio della crescita

Crescita di una popolazione batterica in coltura liquida

-coltura “a termine” (in “batch”, in lotto)-coltura in continuo (chemostato)

7

Allestiamo una coltura batterica

Inoculiamo 1 l di terreno di coltura appropriato con una colonia batterica (circa 1 milione di cellule).

Es.: Escherichia coli in brodocoltura.

Incubiamo il tutto in condizioni appropriateEs.: 37 °C, con aerazione.

Dopo neppure 24 ore vedremo che la coltura è diventata molto torbida per la presenza di nuove cellule batteriche identiche per forma, struttura e composizione alle cellule iniziali.

Come monitorare la presenza e la crescita batterica?

Metodi di conteggio: a. conta al microscopio

Camera di Petroff- Hauserb. Coulter Counterc. metodi turbidimetrici (torbidità, assorbanza)d. misura del peso (biomassa)

peso umido peso secco

e. conteggio vitale in piastra (UFC)

Come "contare" i microrganismi(o stimarne quantitativamente la presenza)

a. conta al microscopio: Camera di Petroff- Hauser

0.02 mmDistanza vetrino portaoggetto-coprioggetto0.02 mm3Volume totale

0.04 mm2Area di un quadrato grande1 mm2Griglia di 25 quadrati grandi (suddivisi in 16 quadratini)

1.5x107

1.5x104

12

= N/cm3x 1000= N/mm3N/(0.04x0.02) [Nx25x50]

N/0.04 mm2numero medio di batteri/quadrato grande

c. metodi turbidimetrici (torbidità, assorbanza)

8

“Conta vitale”: il metodo più sensibile

colonie visibili a occhio nudo dopo varie ore di incubazione

e. conteggio vitale in piastra (UFC)

n colonietitolo (ufc/ml) = ----------------------- × Fattore di diluizione

volume seminato

n colonietitolo (ufc/ml) = -----------------------------------

volume seminato × diluizione

Fattore di diluizione: 1, 10, 100, 1000 ...Diluizione: 1/1; 1/10; 1/100; 1/1000 ...

Calcolo del titolo

Campione (µl) 10 10 100100

Diluente (ml)

Diluizione

Diluizionecomplessiva

Fattore didiluizione

10-0

100

1

10-2

10-2

102

0.9

10-1

10-5

105

0.9

10-1

10-6

106

1

10-2

10-4

104

9

Allestiamo una coltura batterica

Inoculiamo 1 l di terreno di coltura appropriato con una colonia batterica (circa 1 milione di cellule).

Es.: Escherichia coli in brodocoltura.

Incubiamo il tutto in condizioni appropriateEs.: 37 °C, con aerazione.

Dopo neppure 24 ore vedremo che la coltura è diventata molto torbida per la presenza di nuove cellule batteriche identiche per forma, struttura e composizione alle cellule iniziali.

Monitoriamo la concentrazione batterica a diversi tempi

Curva di crescita di una coltura microbica(X vs. t)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

0 1 2 3 4 5 6 7 8

tempo (ore)

OD

600

t (h) OD600

0.0 0.0140.5 0.0151.0 0.0161.5 0.0192.0 0.0332.5 0.0683.0 0.133.5 0.264.0 0.524.5 1.15.0 2.25.5 2.86.0 3.16.5 3.37.0 3.47.5 3.4

Curva di crescita di una coltura microbica(logX vs. t)

t (h) OD600 log OD6000.0 0.014 -1.850.5 0.015 -1.821.0 0.016 -1.801.5 0.019 -1.722.0 0.033 -1.482.5 0.068 -1.173.0 0.13 -0.893.5 0.26 -0.594.0 0.52 -0.284.5 1.1 0.045.0 2.2 0.345.5 2.8 0.456.0 3.1 0.496.5 3.3 0.527.0 3.4 0.537.5 3.4 0.53

-2.00

-1.50

-1.00

-0.50

0.00

0.50

1.00

0 2 4 6 8

tempo (ore)

log

OD

600

Curva di crescita di una coltura microbica(X vs. t su carta da grafico semilogaritmica)

t (h) OD600 log OD6000.0 0.014 -1.850.5 0.015 -1.821.0 0.016 -1.801.5 0.019 -1.722.0 0.033 -1.482.5 0.068 -1.173.0 0.13 -0.893.5 0.26 -0.594.0 0.52 -0.284.5 1.1 0.045.0 2.2 0.345.5 2.8 0.456.0 3.1 0.496.5 3.3 0.527.0 3.4 0.537.5 3.4 0.53

0.01

0.1

1

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8

tempo (ore)

OD6

00

10

Grafici in scala lineare e semilogaritmica a confronto

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

0 1 2 3 4 5 6 7 8

tempo (ore)

OD6

00

0.01

0.1

1

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8

tempo (ore)

OD6

00

La crescita esponenziale riflette il meccanismo di divisione binaria in una popolazione in crescita bilanciata

FASI: • adattamento (“lag”) • crescita esponenziale• fase stazionaria….• morte

1.E+06

1.E+07

1.E+08

1.E+09

0 2 4 6 8 10 12

tempo (ore)

titol

o (u

fc/m

l)

Crescita (moltiplicazione) batterica

DESCRIZIONE MATEMATICA DELLA CRESCITA ESPONENZIALE

dX----- = kXdt

0.001

0.01

0.1

1

10

0 1 2 3 4 5 6 7tempo (ore)

OD6

00

11

DESCRIZIONE MATEMATICA DELLA CRESCITA ESPONENZIALE

X = qualsiasi parametro relativo alle cellule: torbidità (OD), biomassa, numero di cellule, ufc, n di ribosomi, quantità di proteine, di DNA, di peptidoglicano, etc…

/unità di volume di coltura

k = costante di crescita (t-1) (es.: h-1, min-1)

DESCRIZIONE MATEMATICA DELLA CRESCITA ESPONENZIALE

dX----- = kXdt

integrando: X2 = X1 ek (t2-t1)

lnX2 = lnX1 + k(t2-t1)lnX2-lnX1

k = --------------t2-t1

tempo di generazione g (= t2-t1 quando X2=2X1)

ln2k =

g

0.693g =

k

logX2-logX1 k = 2.3 --------------

t2-t1

Crescita esponenziale

t (h) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 ... 5.0 10 n 0 1 2 3 4 5 ... 10 20 X 1 2 4 8 16 32 ... 1024 106 X exp2 20 21 22 23 24 25 ... 210 220

log2 X 0 1 2 3 4 5 ... 10 20 log10 X 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 ... 3 6

Esempio con g = 30 min (0.5h)

X = numero di cellulen = numero di generazonig = tempo di generazione

X2/X1 = 2n X2 = X1 × 2n

numero di generazioni n avvenute in un lasso di tempo t2-t1

X2/X1 = 2n log(X2/X1)= n log2

log(X2/X1) log(X2/X1)n = ------------------ = ------------------

log2 0.3

tempo di generazione g

(t2-t1)g = ---------

n

Numero di generazioni e tempo di generazione

ln2g =

k

12

Parametri che caratterizzano la fase di crescita esponenziale: ricavare graficamente

0.01

0.1

1

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8

tempo (ore)

O

D

6

0

0

g

0.001

0.01

0.1

1

10

0 2 4 6 8 10 120

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 20 40 60 80

tempo (h) [substrato limitante]

OD

600

OD

600

mas

sim

a

1x

64x

16x

4x

Fase stazionaria e substrato limitante

- la coltura cresce in uno stato di equilibrio permanente (steady state)

- il tasso di crescita può essere regolato variando il flusso del terreno

- la biomassa prodotta può essere regolata variando la concentrazione del fattore di crescita limitante

Chemostato

13

Alcuni fattori che influenzano la crescita batterica

OSSIGENO

TEMPERATURA

pH

"Attività" H2O

OSSIGENO

Crescita in AmbienteGruppo Aerobio Anaerobio Effetto/ruolo

dell’ O2

Aerobi obbligati + - respirazione aerobia

Microaerofili (<0.2 atm) + - idem

Anaerobi obbligati - + Tossico

Anaerobi facoltativi + + utilizzato, non(Aerobi facoltativi) indispensabile

Anaerobi Aerotolleranti + + non richiesto, non utilizzato

Forme tossiche (reattive) dell’ossigeno

anione superossido [.O2-]

ossigeno [O2]

perossido di idrogeno [H2O2]

radicale ossidrile [.OH] ione ossidrile [OH-]

Formazione di specie reattive dell’ossigeno

radiazioni ionizzanti

radiazioni UV

respirazione (sottoprodotto)

reazioni dedicate (neutrofili, macrofagi)

composti chimici, antibiotici (adriamicina, bleomicina)

14

Brock-F.5.23

Formazione di specie reattive dell’ossigeno nel processo di respirazione

O2 + e- [.O2-] superossido

[.O2-] + e- + 2H+ H2O2 perossido di H

H2O2 + e- + H+ H2O + .OH radicale ossidrile.OH + e- + H+ H2O acqua

O2 + 4e- + 4H+ 4H2O

STRESS OSSIDATIVO

Le specie reattive dell’ossigeno

son forti ossidantiinducono la formazione a catena di radicali liberidanneggiano molecole (lipidi, DNA) della cellula

Gli organismi aerobi o aerotolleranti hanno sviluppato sistemi diversi di detossificazione, che difendono la cellula dagli effetti dannosi delle specie reattive dell'ossigeno.

Detossificazione di radicali dell’Ossigeno

2[.O2-] + 2 H+ O2 + H2O2

superossido dismutasi(SOD)

2H2O2 2H2O + O2

catalasi

H2O2 + NADH + H+ 2H2O + NAD+perossidasi

Saggio della catalasi

Brock-F.5.25

H2O2 H2O + 1/2 O2

catalasi

15

TemperaturaTemperatura: psicrofili, mesofili, termofili

Temperatura

Temperature di crescitaminima ottimale massima

Psicrofili ≤ 0 ≤ 15 20Mesofili > 15 20-40 45Termofili > 45Ipertermofili > 70

Psicrotrofi < 15 > 15 >20Termotolleranti: sopravvivono alla pastorizzazione

-filo-trofo-tollerante

Batterio Minima Ottimale MassimaListeria monocytogenes 1 30-37 45Vibrio marinus 4 15 30Pseudomonas maltophilia 4 35 41Thiobacillus novellus 5 25-30 42Staphylococcus aureus 10 30-37 45Escherichia coli 10 37 45Clostridium kluyveri 19 35 37Streptococcus pyogenes 20 37 40Streptococcus pneumoniae 25 37 42Bacillus flavothermus 30 60 72Thermus aquaticus 40 70-72 79Methanococcus jannaschii 60 85 90Sulfolobus acidocaldarius 70 75-85 90Pyrobacterium brockii 80 102-105 115

Temperatura minima, massima, ottimale (°C)

16

pH: acidofili, neutrofili, alcalofili

Organismo Minimo Ottimale Massimo

Thiobacillus thiooxidans 0.5 2.0- 2.8 4.0- 6.0Sulfolobus acidocaldarius 1.0 2.0-3.0 5.0Bacillus acidocaldarius 2.0 4.0 6.0Zymomonas lindneri 3.5 5.5- 6.0 7.5Lactobacillus acidophilus 4.0 -4.6 5.8- 6.6 6.8Staphylococcus aureus 4.2 7.0- 7.5 9.3Escherichia coli 4.4 6.0- 7.0 9.0Clostridium sporogenes 5.0 -5.8 6.0-7.6 8.5- 9.0Erwinia carotovora 5.6 7.1 9.3Pseudomonas aeruginosa 5.6 6.6-7.0 8.0Thiobacillus novellus 5.7 7.0 9.0Streptococcus pneumoniae 6.5 7.8 8.3Nitrobacter spp 6.6 7.6-8.6 10.0

pH minimo, massimo e ottimale.

pH

Disponibilità di acqua (Aw - osmolarità-salinità)

alofili deboli NaCl 1- 6 %moderati NaCl 6-15 %estremi NaCl 15-30 %

alotolleranti

osmofili

osmotolleranti

xerofili

Organismo Aw minima per crescere

Caulobacter 1.00Spirillum 1.00Pseudomonas 0.91Salmonella/E. coli 0.91Lactobacillus 0.90Bacillus 0.90Staphylococcus 0.85Halobacterium 0.75

Disponibilità di acqua (Aw - osmolarità-salinità)

17

Disponibilità di acqua (osmolarità-salinità)

a: non alofilob: alotollerante (es.: Stafilococus aureus)c: alofilo estremo (Halococcus)