81LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 46 - num. 2 marzo-aprile 2001 (81-95)

Metodologia di approccio alla tipizzazione HLADRBmediante analisi del DNA

Maria Edvige Fasano(1), Monica Berrino(2), Gina Mazzola(1), Ennia Dametto(2),Maurizio Tacconella(1), Francesca Brancatello(1), Francesca Marin(1),Emilio Sergio Curtoni(2)

(1)UOADU Immunologia dei Trapianti, Azienda Ospedaliera S. Giovanni Battista di Torino(2)Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica Medica, Sezione di Genetica, Universit di Torino

Ricevuto: 9 novembre 2000 - Accettato: 14 dicembre 2000Corrispondenza: Dott.ssa Maria Edvige FasanoUOADU Immunologia dei TrapiantiIstituto di Genetica MedicaAzienda Ospedaliera S. Giovanni BattistaVia Santena, 1910128 Torino

Class II molecular typing has major advantages incomparison with serological typing; therefore, in manylaboratories the former took the place of the second. Inour laboratory, since 1996, serology has beensubstituted by molecular methods for Class II typing.

In this paper we present our experience on the mostimportant features of molecular techniques for typingat a low and intermediate level. All our laboratory resultsare analysed in order to establish which is theproportion of unambiguous results that can be obtained.The techniques considered are: "direct and reverseSSOP" and "SSP"; the reagents used are eithercommercial (Roche, Oxoid-Dynal) or produced in thelaboratory. All the techniques described have severalsteps, each one relevant for a good final result. Thesesteps are: DNA extraction, amplification, deposition ofamplicons onto the membranes, hybridisation andcolorimetric assay, scoring of the positive probes andinterpretation of results obtained. All these aspects arecarefully analysed. We present results of the technique"SSOP reverse" obtained using two different kits:Amplicor DRB20 and 29 (HLA DRB20 and 29). For eachprobe the alleles recognised are listed. 894 sampleswere typed using HLA DRB20 and 120 of these hadambiguous results, 702 samples were typed using HLADRB29 and 134 of them had ambiguous results."Ambiguity" means that more than two groups of allelesare equally possible considering the results obtained.The operator has no means to distinguish the rightresults except the higher frequency of some alleleswith respect to others in population typed, which doesnot seem a proper way. The ways to solve theseambiguities are presented, generally using SSPtechnique. The necessity is discussed that the resultanalysis take into account the most recent knowledge

concerning the allele classification, which is based onthe increasing knowledge of DNA sequences. The allelenumber has been growing in the last years and acontinuous update of them is important in order to obtaingood results.

Parole chiave: PCR-SSOP, PCR-SSP, tipizzazioneHLADRB.Key words: PCR-SSOP, PCR-SSP, HLADRB typing.

Introduzione

Molti laboratori hanno abbandonato del tutto latipizzazione HLA sierologica per la classe II in favore ditecniche di analisi del DNA. La tipizzazione molecolare dellaclasse II presenta, infatti, indiscutibili vantaggi rispetto aquella sierologica.

I principali problemi riscontrati nella tipizzazionesierologica dipendono da:1- rischio di cattiva qualit delle cellule usate per la

tipizzazione: i linfociti devono essere sufficientementereattivi ed al tempo stesso la percentuale di cellule morteaspecificamente deve essere bassa;

2- difficolt di rifornimento di antisieri specifici;3- rischio che un antisiero peggiori la sua qualit nel tempo;4- mancanza di antisieri specifici per alcune delle specificit

conosciute; alcune di esse vengono identificate tramiteantisieri polispecifici.Considerati i vantaggi della tipizzazione molecolare

rispetto a quella sierologica, nel 1996 il nostro laboratoriodecise di abbandonare definitivamente la tipizzazionesierologica degli antigeni HLA-DRB1* passando a quellamolecolare.

Il primo sistema di tipizzazione HLA molecolare, chefaceva uso di enzimi di restrizione per mettere in evidenza i

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relativi polimorfismi (RFLP), fu messo a punto proprio perriconoscere gli alleli di classe II1. L'introduzione dellareazione di polimerizzazione a catena (PCR)2 ha permessolo sviluppo di tecniche pi progredite per la tipizzazionemolecolare degli alleli HLA.

Queste tecniche permettono di scegliere il livello didettaglio della tipizzazione, a seconda degli scopi che siintendono raggiungere.

La tipizzazione molecolare di "bassa risoluzione"permette di identificare solo le specificit "broad"(supertipiche) o gruppi di specificit; quella "intermedia"permette di identificare tutte le specificit corrispondentiad antigeni evidenziati sierologicamente e, in pi, diidentificare qualche allele subtipico3.

Infine, una tipizzazione ad "alta risoluzione" permettedi suddividere ciascuno degli alleli identificati con larisoluzione intermedia in pi alleli subtipici.

La tipizzazione molecolare ad alta risoluzione dellaClasse II permette di evidenziare oltre 200 alleli al locusHLADRB*, mentre usando metodi di tipizzazionesierologica si pu evidenziare un numeroconsiderevolmente inferiore di specificit4 (Figura 1).

Il polimorfismo DRB* localizzato a livello dell'esone 2e pi precisamente ristretto in 3 regioni ipervariabili5. Ledifferenze per HLA-DRB1* fra donatore e ricevente di untrapianto di midollo osseo sono in grado di provocareun'intensa reazione da parte dei linfociti T allogeneici: diconseguenza sono associate con lo sviluppo della Graftversus Host Disease6. Uno dei maggiori problemi incontratinella tipizzazione molecolare della classe II il gran numerodi alleli finora identificati. Nel 1991 gli alleli identificati allocus DRB erano 344, nel luglio 1996 erano 2297 e 268 neidati pubblicati nel 19988. Per questi motivi, il problemadell'aggiornamento della nomenclatura e della tipizzazionein laboratorio non di poco conto.

Al fine di facilitare la corretta identificazione di tutti glialleli trovati, si sono stabilite regole sull'identificazione dinuovi alleli.

ora possibile accedere al sito web della FondazioneAnthony Nolan9, dove sono riportati ogni due mesi icambiamenti intervenuti. Si pu vedere come dalla creazionedel sito Internet a oggi siano state apportate notevolimodifiche. Come esempio di importante cambiamento diattribuzione, si pu citare il caso di un allele che era sembratosubtipico a DRB4*0101 e, invece, da studi successivi risultato subtipico a DRB4*0103. Pertanto la suadenominazione, che era DRB4*0101102N, stata cambiatain DRB4*0103102N10.

Scopo del lavoro

La presente indagine ha i seguenti obiettivi:- indagare gli aspetti tecnici della tipizzazione molecolare

della Classe II ai livelli di risoluzione basso ed intermedio;- analizzare i risultati della tipizzazione che possono

generare ambiguit nell'assegnazione degli alleli, alloscopo di identificare una metodologia per la lorosoluzione;

- confrontare i livelli di risoluzione forniti da diversi set direagenti (in pratica da diversi kit forniti dal commercio) pervalutare quanto nell'evoluzione sulla conoscenza degli alleliHLA sia riflesso nei kit di pi recente produzione.Pertanto, verr qui riportata l'esperienza acquisitaeseguendo la tipizzazione HLA-DRB1* con i prodotticommerciali usati nel nostro laboratorio, oppure conreagenti prodotti dal laboratorio stesso, sulla scorta diindicazioni fornite da altri laboratori e pubblicate suriviste scientifiche. Molte delle osservazioni cheverranno esposte sono di carattere generale, percisono valide per affrontare situazioni che si incontranonel corso della tipizzazione molecolare, anche usandokit diversi da quelli menzionati.

ME Fasano et al.

Figura 1: molecola HLA Classe II - Struttura delle molecoleHLA di classe II in cui sono evidenziati 4 dominiextracellulari (1, 2, 1, 2) e il solcocombinatorio (evidenziato dal triangolo nero),che accoglie il peptide antigenico, situato tra idue domini distali

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Materiali e metodi

Tecniche di laboratorioSono stati indagati, per la tipizzazione di livello basso o

intermedio, i due metodi che principalmente si utilizzanoper la tipizzazione molecolare di classe II: la tecnica PCR-SSOP (PCR seguita da ibridazione con oligonucleotidisequenza-specifici) e PCR-SSP (dove la PCR eseguitausando primers sequenza-specifici).

PCR-SSOP reverseLa metodica PCR-SSOP11 una tecnica accurata nella

quale le sonde impiegate presentano nella parte centrale lasequenza specifica, che si legher alla porzionecomplementare del DNA da tipizzare. Uno degli svantaggidi questa tecnica che sono necessarie parecchie ore perottenere il risultato: pertanto, non pu venire utilizzata neicasi in cui si debba effettuare una tipizzazione urgente.

Per questa ragione, le case produttrici hanno sviluppatoed introdotto sul mercato dei metodi chiamati "PCR-SSOPreverse" (PCR-SSOP-inversa)12. In questi metodi, le sondesono state legate ad un supporto solido, tramite unpolinucleotide costituito da sola timina, in modo da lasciarela parte finale libera d'interagire con il DNA amplificato datipizzare. Questo ha, alle due estremit, i primers marcaticon biotina e si legher solo a quelle sonde a cui complementare. I prodotti biotinilati sono evidenziatiaggiungendo un anticorpo anti-biotina complessato allastreptavidina-perossidasi di rafano: questa reagisce con ilsubstrato, tetrametilbenzidina, con formazione di unprodotto colorato.

PCR-SSPNei casi in cui la tipizzazione venga effettuata utilizzando

il metodo PCR-SSP, il risultato dell'amplificazione stessache evidenzia gli alleli, poich si utilizzano un primercomplementare all'estremit 5' e due o pi primers antisenserispetto all'estremit 3'13. Questo metodo ha un grandepotere di risoluzione ed anche accuratezza e velocit diesecuzione: in tre ore si pu ottenere una tipizzazionecompleta