Metodi spettroscopici per le Biotecnologie

Spettroscopia di emissione UV-VIS (2)

AA 2013-2014

Dott. Alfonso Zoleo

I  percorsi  possibili  dallo  stato  eccitato  

In  ragione  della  maggiore  o  minore  probabilità  di  un  certo  processo  fotofisico  di  diseccitazione  possiamo  definire  una  costante  cine*ca  di  quel  processo.  Tanto  più  il  processo  è  probabile,  tanto  maggiore  è  la  sua  costante  cine=ca.  I  processi  fotofisici  di  diseccitazione  sono  equazioni  cine=che  del  primo  ordine,  ovvero  dipendono  dalla  popolazione  di  molecole  in  quello  stato  ele@ronico  

Equazioni  cine,che  per  i  processi  fotofisici  

Diseccitazione  per  fluorescenza  da  S1  a  S0  

S1  

S0  

kF  

Conversione  interna  da  S1  a  S0  S1  

S0  

kIC  

radia*vo  

termico  

Conversione  ISC  da  S1  a  T1  kISC  

S1  T1  

N1   Molecole  nello  stato  di  singole@o  S1  

Numero  di  molecole  che  lasciano  lo  stato  S1  nell’unità  di  tempo  

Equazioni  cine,che  per  i  processi  fotofisici  

Diseccitazione  per  fosforescenza  da  T1  a  S0  

T1  

S0  

kP  

Conversione  interna  da  T1  a  S0  T1  

S0  

kTIC  

radia*vo  

termico  

NT1   Molecole  nello  stato  di  triple@o  T1  

Numero  di  molecole  che  lasciano  lo  stato  T1  nell’unità  di  tempo  

Intensità  della  fluorescenza  

Questo  termine  rappresenta  le  molecole  che  lasciano,  nell’unità  di  tempo,  lo  stato  S1  per  tornare  nello  stato  S0  eme@endo  radiazione.  Ogni  molecola  che  va  da  S1  a  S0  in  questo  processo  eme@e  un  fotone.  Quindi  il  numero  di  fotoni  emessi  per  fluorescenza  nell’unità  di  tempo,  è  kF  N1  

Come  vengono  emessi  i  fotoni  nell’emissione  per  fluorescenza  ?  

Ogni  molecola  che  si  diseccita,  eme@e  il  fotone  in  una  direzione  casuale  che  dipende  da  come  è  orientata  la  molecola  in  quel  momento  

In  una  soluzione  di  cromofori,  le  molecole  sono  poste  in  tu@e  le  orientazioni,  e  quindi  i  fotoni  sono  emessi  con  la  stessa  probabilità  in  ogni  direzione  dello  spazio  

Esperimento  di  fluorescenza  

Lampada  

Monocromatore  Di  eccitazione:  fisso  per  selezionare  la  lunghezza  ‘onda  del  massimo  di  assorbimento  

Luce  alla  lunghezza  d’onda  del  massimo  di  assorbimento  

Le  molecole,  eccitate  in  seguito  all’assorbimento  di  un  fotone,  rieme@ono  la  luce  in  tu@e  le  direzioni.  La  luce  emessa  è  policroma*ca  (in  ogni  punto).  Posso  raccogliere  lo  spe@ro  di  emissione  in  un  punto  qualsiasi.  Lo  faccio  a  90°,  così  evito  la  luce  di  eccitazione    

Monocromatore  Di  emissione:  lo  ruoto,  portando  di  volta  in  volta  la  rivelatore  la  luce  emessa  alle  varie  lunghezze  d’onda  In  questo  modo  faccio  una  scansione  della  luce  emessa  alle  varie  lunghezze  d’onda,  misurandone  l’intensità  

I(λ)  

La  quan=tà  che  misuro  è  I(λ),  cioè  l’intensità  di  luce  emessa  alla  lunghezza  d’onda  λ  per  ogni  lunghezza  ‘onda  dello  speFro  di  emissione  

Eccito  a  questa  lunghezza  d’onda  

Raccolgo  tu@o  lo  spe@ro  di  emissione  facendo  una  scansione  della  luce  emessa  ad  ogni  λ    

Spe@rofluorimetro  

Lampada

Monocromatore di eccitazione

Cella campione

Monocromatore di emissione

Fotomoltiplicatore

Esperimento  di  eccitazione  

Lampada  

Monocromatore  Di  eccitazione:  lo  ruoto  selezionando  via  via  diverse  lunghezze  d’onda  di  eccitazione  

Luce  a  lunghezza  d’onda  variabile  

Monocromatore  Di  emissione:  lo  tengo  fisso,  selezionando  una  sola  lunghezza  d’onda  di  emissione  

I(λ)  

La  quan=tà  che  misuro  è  I(λecc),  cioè  l’intensità  di  luce  emessa  per  ogni  lunghezza  ‘onda  di  eccitazione,  tenendo  fissa  la  lunghezza  d’onda  di  fluorescenza  

Raccolgo  ad  una  lunghezza  d’onda  

Faccio  una  scansione  su  tu@e  le  lunghezze  d’onda  di  eccitazione.  Lo  spe@ro  che  o@engo  è  simile  a  quello  di  assorbimento,  ma  le  intensità  possono  essere  diverse  per  effe@o  dei  processi  concorren=  alla  fluorescenza  

λex λex

λ

Resa  quan,ca  di  fluorescenza  

Questo  termine  rappresenta  le  molecole  che  lasciano,  nell’unità  di  tempo,  lo  stato  S1  per  tornare  nello  stato  S0  eme@endo  radiazione.  Ogni  molecola  che  va  da  S1  a  S0  in  questo  processo  eme@e  un  fotone.  Quindi  il  numero  di  fotoni  emessi  per  fluorescenza  nell’unità  di  tempo,  è  kF  N1  

11 NKk

dtdNKI FF =−= L’intensità  di  fluorescenza  ad  un  certo  tempo  è  semplicemente  

proporzionale  al  numero  di  molecole  nello  stato  di  singole@o  eccitato  S1  

Rammen=amo  le  tre  equazioni  cine=che  che  rappresentano  le  molecole  che  decadono  da  S1  per  i  vari  processi:  

111111 )( NkNkkkNkNkNk

dtdN

totICISCFICISCF −=++−=−−−=

Quindi,  il  decadimento  complessivo  è  dato  da  

Supponiamo  di  aver  eccitato  un  certo  numero  di  molecole  N1  allo  stato  S1:  come  varia  nel  tempo  l’intensità  della  fluorescenza  prodo@a  da  queste  molecole?  

t  

N1  

Risolvendo  questa  equazione  differenziale,  si  oXene:  

tottot ttk eNeNtN τ/111 )0()0()( −− ==

Quindi,  il  numero  di  molecole  che  si  trova  nello  stato  eccitato  S1  decade  esponenzialmente  con  il  tempo  (se  nessuno  ripopola  lo  stato  S1!).    

τtot  

N1  /e  

τtot=1/ktot  

tottFFF eNKktNKk

dtdNKtI τ/

111 )0()()( −==−=

Ne  consegue  che  anche  l’intensità  della  fluorescenza  decade  esponenzialmente  con  costante  τtot:  

La  costante  τtot  è  de@a  tempo  di  vita  effeKvo  della  fluorescenza:  

Definiamo  RESA  QUANTICA  DI  FLUORESCENZA  il  rapporto  tra  le  molecole  che  (nell’unità  di  tempo)  decadono  da  S1    per  emissione  di  fluorescenza  rispeKo  a  quelle  che  decadono  per  tuL  i  processi    

F

tot

tot

F

tot

F

kk

NkNk

ττ

φ ===1

1

Chiaramente,  risulta  sempre  0≤  φ≤1

FF k

1=τ è  il  tempo  di  vita  «naturale»  della  

fluorescenza      

Flash  photolysis  

campione  

Impulso  di  luce  Un  impulso  di  luce  (laser)  molto  più  breve  dei  decadimen=  che  si  vogliono  misurare  viene  inviato  sul  campione  producendo  «istantaneamente»  una  popolazione  di  molecole  eccitate.  Un  detector  veloce  registra  la  luce  emessa  in  funzione  del  tempo.    

-­‐  Possiamo  misurare:  il  tempo  di  vita  effeXvo  della  fluorescenza  -­‐  Il  tempo  di  vita  effeXvo  della  fosforescenza  

Poiché  tu@e  le  molecole  che  decadono  nei  vari  processi  sono  quelle  che  vengono  eccitate  dalla  luce,  possiamo  calcolare  la  resa  quan=ca  di  fluorescenza    anche  come  

φ=(n.  molecole  che  fluorescono)/(n.  molecole  eccitate)=IF/IA

IF  =  intensità  della  luce  emessa  per  fluorescenza  

IA  =  intensità  della  luce  assorbita  

EffeKo  solvente  sugli  speKri  di  fluorescenza  

Uno  degli  effeX  più  u=li  negli  studi  biologici  è  lo  spostamento  dello  spe@ro  di  fluorescenza  rispe@o  allo  spe@ro  di  assorbimento  in  relazione  alla  polarità  del  solvente  

0  -­‐  0  

In  un  solvente  apolare,  o  nel  vuoto,  la  banda  0-­‐0  dello  spe@ro  di  assorbimento  e  dello  spe@ro  di  emissione  coincidono  

0  -­‐  1   1  -­‐  0  

0  -­‐  0  0  -­‐  1   1  -­‐  0  0  -­‐  0  

In  un  solvente  polare  la  banda  0-­‐0  dello  spe@ro  di  assorbimento  e  dello  spe@ro  di  emissione  non  coincidono,  perché  la  banda  0-­‐0  dello  spe@ro  di  emissione  è  spostata  a  lunghezze  d’onda  maggiori  

S0  

S1  S1  

S0  

Molecola  in  stato  fondamentale,    ambiente  di  stato  fondamentale  

Molecola  in  stato  eccitato,    ambiente  di  stato  fondamentale  

Molecola  in  stato  eccitato,    ambiente  in  stato  eccitato  

Molecola  in  stato  fondamentale,    ambiente  in  stato  eccitato  

Riorganizzazione  delle  molecole  

Riorganizzazione  delle  molecole  

Vantaggi  della  fluorescenza  

-­‐  Elevata  sensibilità:  la  fluorescenza  può  essere  rilevata  a  concentrazioni  nanomolari  (talora  perfino  a  singola  molecola)  

-­‐  Possibilità  di  operare  «in  vivo»  -­‐  Basso  costo  della  strumentazione  -­‐  Ampia  disponibilità  di  fluorofori  biocompa=bili  da  usare  come  sonde    -­‐  Sensibilità  del  fluoroforo  all’ambiente  -­‐  Misura  di  distanze  tra  sonde  di  fluorescenza  (labelling  di  biomolecole)  

Sonde  endogene:    Fluorofori  (=  molecole  fluorescen=)  naturalmente  presen=  nella  biomolecola:  es.  triptofano,  =rosina,  fenilalanina  in  proteine  

Sonde  esogene:    Fluorofori  aggiun=  alla  biomolecola:    es.  e=dio  bromuro  per  DNA/RNA,pirene  in  membrane,  iso=ocianato  di  fluoresceina  e  dansil  cloruro:  legame  covalente  alla  lisina  delle  proteine    

Trp esposto ad ambiente acquoso fluoresce a 350 nm, mentre Trp sepolto nel core emette a 330 nm e con >intensità. Possibilità di studiare conformazione delle biomolecole/cambi conformazionali

Tyr contribuisce generalmente alla fluorescenza perché residui di tirosina sono spesso presenti in elevato numero Fluorescenza di Tyr può essere quenciata da Trp via energy transfer = studi di distanza

Fluorescenza di Phe può essere vista solo in assenza di Trp e Tyr

Fluorescenza intrinseca di proteine

0.04 282 nm 200 257 nm 6.4 ns Phenylalanine 0.14 303 nm 1400 274 nm 3.6 ns Tyrosine 0.20 348 nm 5600 280 nm 2.6 ns Tryptophan

Quantum Wavelength Absorptivity Wavelength Fluorescence Absorption

Lifetime Amino acid

ANS (1-Anilino-8-napthalene sulphonate (proteine)

Fluorescin (proteine)

Ethidium bromide (DNA)

Acridine orange (DNA)

Fluorofori esogeni

Un probe fluorescente è un fluoroforo disegnato per legarsi a una regione specifica di una macromolecola o per rispondere a un particolare stimolo.    

Microscopia  in  fluorescenza  

Usando  marker  fluorescen=  che  si  legano  a  specifici  organelli  o  a  specifiche  sostanze  si  possono  o@enere  mappe  di  distribuzione  di  una  sostanza  biologica  assorbita  o  di  organelli  esponendo  la  coltura  a  luce  UV  

Bromuro  di  e,dio  

Il  bromuro  di  e=dio  si  intercala  a  DNA  o  RNA.  Quando  è  legato,  la  sua  fluorescenza  è  significa=vamente  maggiore  rispe@o  a  quando  è  in  soluzione  acquosa.  E’  possibile  studiare  denaturazione  del  DNA