Metodi per il rilevamento degli OGM in matrici alimentari ... · ricerca del DNA e delle proteine...

Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare Alessandria 21 maggio 2010

Metodi per il rilevamento degli OGM in matrici alimentari: principi ed i metodi di analisi basati sulla

ricerca del DNA e delle proteine

Dott.ssa Patrizia Cesaro

Università degli Studi del Piemonte Orientale “A. Avogadro”CORSO DI ALTA FORMAZIONE IN LEGISLAZIONE

ALIMENTARE

Gli Organismi Geneticamente Modificati sono BATTERI, FUNGHI, VIRUS, PIANTE e ANIMALI le cui caratteristiche genetiche sono state modificate in laboratorio. In genere UNO O PIÙ GENI PRESI DA ALTRI ORGANISMI vengono introdotti nel patrimonio ereditario dell’organismo (DNA) che si vuole modificare (Definizione giuridica in Direttiva 2001/18/CE).

IL GENE/I INSERITO CODIFICA PER UN TRATTO DI PARTICOLARE INTERESSE

Le applicazioni degli OGM investono gli ambiti più disparati; la MEDICINA, L'ECOLOGIA, IL SETTORE AGRO-ALIMENTARE e ZOO-TECNICO. Meno conosciuto, ma molto importante dal punto di vista medico, è il loro utilizzo in campo farmaceutico, dove hanno consentito la produzione di vaccini sicuri.



• Il DNA è la sede dell’informazione genetica

• È presente nel nucleo di ogni cellula

• È identico per ogni cellula dello stesso organismo

• Successione di nucleotidi contenti le basi azotate A, T, C e G

• Numero di geni variabile a seconda dell’organismo

• Diversi livelli organizzazione

TUTTE LE PIANTE OGGI COLTIVATE SONO GENETICAMENTE MODIFICATEo GENETICAMENTE MIGLIORATE

Il principale obiettivo del miglioramento genetico delle piante coltivate èquello di ottenere varietà con caratteristiche PRODUTTIVE, QUALITATIVE e di RESISTENZA AGLI STRESS migliori di quelle varietà già disponibili sul mercato.METODOLOGIE USATE:

• incrocio SELEZIONE• mutagenesi (uso di radiazioni che provocano mutazioni) SELEZIONE• trasferimento genico SELEZIONE



COMPONENTI DI UN COSTRUTTO O CASSETTA DI ESPRESSIONE PER OTTENERE PIANTE GM

promotore GENE terminatore

ELEMENTI REGOLATORI DELLA TRASCRIZIONE E TRADUZIONE: - promotore e terminatore- sito di legame per il ribosoma

GENE: - gene di interesse- gene reporter- marcatore di selezione


METODI PER IL RILEVAMENTO DEGLI OGM NEGLI ALIMENTI (DETECTION)

1. RICERCA DELLE PROTEINE

2. ANALISI DEL DNA

Qualunque sia la tecnica utilizzata, per garantirerisultati affidabili ènecessario ottimizzarne vari aspetti legati alla qualità: PROCEDURE,REAGENTI e STRUMENTAZIONE. Risulta pertanto di cruciale importanza la “VALIDAZIONE” dei metodi.


TANTO PIU’ UN PRODOTTO E’ GREZZO TANTO PIU’ E’ FACILE ISOLARE ED ANALIZZARE L’ANALITA


Limite consentito <1% (10 volte superiore al limite di rilevabilità0,1%, che rappresenta la più bassa soglia scientificamente difendibile per la quantificazione di materiale OGM) 3 motivi:

• STATISTICA (0,1% la variabilità delle ripetizioni è statisticamente accettabile)

• TECNICA (0,1% per evitare errori tecnici dovuti al limite di sensibilità di un metodo che in realtà è 0,01%)

• CAMPIONAMENTO (una quantificazione affidabile al 0,1% richiede almeno 10000 fagioli di soia, 2,5kg, se si scende a 0,01% occorrerebbero 25kg di grani)


CAMPIONAMENTO• Gli schemi per il campionamento degli OGM si basano sulle procedure utilizzate per l’analisi delle micotossine. La direttiva 98/53 (Direttiva 98/53/CE del 16 luglio 1998, GUCE L 201 del 17/7/1998, pag. 93) riguardante il campionamento e l’analisi di alcuni contaminanti negli alimenti è stata la prima linea guida di campionamento per gli OGM ed è oggi ancora utilizzata, ma ce ne sono altre più recenti.

• Il materiale OGM NON ha una distribuzione omogenea, di conseguenza la rappresentatività del campionamento sta alla base di tutta l’analisi. Per questo è indispensabile effettuare il prelievo in modo ACCURATO, cercando di CAMPIONARE DIVERSI PUNTI DEL PRODOTTO.


Come si eseguono le analisi?Tre livelli:- RILEVAMENTO (presenza/assenza OGM)

- IDENTIFICAZIONE (dell’evento di trasformazione)

- QUANTIFICAZIONE (determinazione %)

campione

positivonegativo

RILEVAMENTO

IDENTIFICAZIONE

È autorizzato?

sì no> 1%

etichetta obbligatoria

< 1% no etichetta QUANTIFICAZIONE

È ILLEGALE


Metodi basati sulla RICERCA DELLE PROTEINE

Il transgene codifica per una PROTEINA

Metodi con un basso LIVELLO TECNOLOGICO si tratta di:

• saggi immunologici BASATI SUL RICONOSCIMENTRO ANTIGENE-ANTICORPO

• che consentono analisi qualitative e quantitative• in cui l’analita deve essere conosciuto

Western blotELISA Lateral flow assay

Limiti: - localizzazione della proteina- le proteine non devono essere degradate

USATI PER IL CONTROLLO DI SEMENTI E MATERIE PRIME


IL LATERAL FLOW ASSAY

• Basso costo• Facilità di esecuzione

NON QUANTITATIVO


Lateral Flow Strip Protocol

1 2

3

1. Punch leaf disc

2. Add buffer and grind in tube

3. Insert flow strips for testing


OGM Sì

OGM No


Limite detection 1seme/1000 semi


TEST ELISA

Provette singole o piastre multipozzetto

• Analisi quantitativa, alta sensibilità, economico• Ideale per analisi di laboratorio• Sono processabili + campioni contemporaneamente

• Possibilità di automatizzare il saggio• Disponibili kit commerciali • Sono necessarie proteine NON denaturate

well

Enzyme-labelled Anti-antibody antibody

antibody specific to antigen

Antigen

Colour Response Concentration

Dependent

Blocking protein


TEST ELISA: PRINCIPIO del Sandwich


TEST ELISA: PRINCIPIO

Western Blotting• Test QUALITATIVO altamente specifico• usato in ricerca


RILEVAMENTO GENERICO: si utilizzano primers o sonde specifici per sequenze molto usate per la costruzione di OGM (p35S CaMV, tnos3’ A. tumefaciens, ecc.).

RILEVAMENTO SPECIFICO: si utilizzano primers o sonde per lo specifico evento di trasformazione (transgene).

Metodi con un MEDIO-ALTO LIVELLO TECNOLOGICO basati su:• Polymerase Chain Reaction (PCR end point, PCR quantitativa), • ibridazione con sonde (Southern blot, microchip GMO)

Metodi basati sulla RICERCA DEL DNA


campione

positivonegativo

RILEVAMENTO GENERICO (PCR end-point, ibridazione con sonde)

IDENTIFICAZIONE - rilevamento SPECIFICO (PCR end-point, ibridazione con sonde)

È autorizzato?

no sì

> 1% etichetta

obbligatoria

< 1% no etichetta

QUANTIFICAZIONE (PCR quantitativa)ILLEGALE

estrazione DNA

Verifica DNA estratto (PCR end-point con primers universali per geni di pianta)

QU

ALI

TATI

VA


Per una buona riuscita dell’analisi sono importanti: 1. CAMPIONAMENTO2. PREPARAZIONE dell’ANALITA (estrazione e purificazione)3. ANALISI QUALITATIVA e QUANTITATIVA dell’ANALITA

L’OBIETTIVO PRIMARIO DEI METODI DI ESTRAZIONE È QUELLO DI OTTENERE DNA CON IL PIÙ BASSO LIVELLO DI DEGRADAZIONEPOSSIBILE

Es.: ESTRAZIONE DNA

2. Preparazione dell’analita: metodi di estrazione: CLASSICI (CTAB)COMMERCIALI (resine brevettate)COMBINATI

3. Analisi qualitativa e quantitativa del DNA: lettura allo spettrofotometro (260 e 280 nm)Quantità: 1 unità assorbanza 260nm = 50 µg ds DNA/mlQualità (purezza): rapporto assorbanza 260nm/280nm (1,7-1,9)


• Frammentazione del DNA dell’OGM mediante• digestione enzimatica• corsa e separazione dei frammenti su gel d’agaroso• trasferimento del DNA su membrana di nilon• incubazione con la sonda molecolare• sviluppo mediante autoradiografia

P32 labelledprobe

M

M

+ve -veM

METODI DI RILEVAMENTO GENERICO E SPECIFICO

• Southern Blot


• PCR end-point


Rendimento teorico di molecole di DNA che si formano a partire da una singola molecola stampo:

N° molecole finali = N x 2C

N= n° di molecole inizialiC= n° cicli


FALSI POSITIVI: - digestione enzimatica dell’amplificati- ibridazione con sonde specifiche (southern blot)- sequenziamento- PCR con primers interni al frammento amplificato(NESTED PCR)

FALSI NEGATIVI: amplificazione di un gene di pianta per verificare la presenza del DNA nel campione analizzato

PCR FRAGMENT CONFIRMATION


ESEMPIO: RICERCA SOIA GM Primer per le-1 118bp

Primer per transgene 169bp


campione

positivonegativo



È autorizzato?

no sì

> 1% etichetta

obbligatoria

< 1% no etichetta


estrazione DNA


QU

ALI

TATI

VA


COS’È:è una reazione PCR che può essere seguita in tempo reale (mentre avviene);la quantità di DNA che si sintetizza può essere misurata ad ogni ciclo PCR

teoria

pratica• La crescita esponenziale è limitata• Segue una crescita lineare• Il plateau non è correlato alla quantità

iniziale del DNA

La REAL TIME PCR misura il DNA ad ogni ciclo

PCRmisura il DNA end-point

(saturazione)

METODI DI QUANTIFICAZIONE: LA REAL TIME PCR


Plot lineareIncremento difluorescenza

• Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione• Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio• Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer

PCR quantitativa


Chimiche fluorescenti per PCR Real-Time

LA FLUORESCENZA SI GENERA DURANTE LA PCR PER EFFETTO DI DIVERSE POSSIBILI REAZIONI CHIMICHE

Le chimiche principali sono basate:

• sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano in modoaspecifico nella doppia elica di DNA (SYBR Green);

• sia sull'ibridazione di sonde specifiche per il frammento di interessemarcate con molecole fluorescenti (Dual-labeled (come le sonde TaqMan) Molecular beacons, Scorpion, sonde FRET (FluorescenceResonance Energy Transfer))


Curve di amplificazione

Plot lineare

Cicli di amplificazione

Fluo

resc

enza

Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui CT (=Threshold Cycle) è inversamente

proporzionale alla quantità di templato iniziale


Plot di amplificazione

PCR cycle number

Nor

mal

ised

repo

rter

fluo

resc

ence

(Rn)

E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnaledi fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della linea soglia (Threshold)

Indica il valore al di sopra del quale inizia l ’ accumu lo d i un a m p l i f i c a t o

L i n e a s o g l i a s c e l t a d a l l ’ o p e r a t o r eIn maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella f a s e e s p o n e n z i a l e


Analisi tramite software


DNA DI RIFERIMENTO (STANDARD)

STANDARD COMMERCIALI• OGM• 0% OGM

È necessario produrre almeno 5 diluizioni dello stesso standard allo scopo di costruire una curva standard

I campioni da determinare vengono affiancati agli standard ed aicontrolli NEGATIVI (H2O)

È necessario produrre almeno 3 repliche sia per ogni campione siaper gli standard per aumentare l’affidabilità del risultato


STANDARD DI RIFERIMENTO

Un “CALIBRATORE” è una qualsiasi matrice da cui si ottiene un DNA a percentuale nota di transgene con cui vengono costruite le curve di taratura. Viene di norma utilizzato Materiale di Riferimento Certificato (CRM) a percentuale nota di OGM (w/w); si tratta di farine a granulometria finissima e controllata, preparate da Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM, Belgio) e commercializzate dalla ditta Fluka.

Sono disponibili in commercio per l’analisi quantitativa farine standard a contenuto di OGM pari a 0%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 5% per i principali eventi transgenici.


CURVA STANDARD

La retta di regressione deve avere un coefficiente correlazione il più possibile vicino a 1 e un valore di pendenza il più possibile vicino a 3,322. La pendenza della retta è indice dell’efficienza di reazione


10 710 6

10 510 4

10 310 2

10 1

15

2 3 4 5 6 7log10 quantity

Ct

unknown sample

3500 copies

35

25

1

La quantità di DNA dei campioni deve essere compresa all’interno della curva degli standard per un calcolo affidabile

Quantificazione con METODO DELLA CURVA STANDARD


gene endogeno transgene


Kit commerciali basati sulla tecnica PCR


campione

positivonegativo



È autorizzato?

no sì

> 1% etichetta

obbligatoria

< 1% no etichetta


estrazione DNA


QU

ALI

TATI

VA


LA TECNOLOGIA E LA RICERCA VANNO AVANTI………

Sono disponibili NUOVI METODI SEMPRE PIU’ SOFISTICATI E PRECISI:

• Biosensori• Microarray• Chip

……. MA OCCORRE LA LORO VALIDAZIONE

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