Metodi e determinazioni quantitative in farmacologia

Fusi Fabio

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SIENAFACOLTÀ DI FARMACIA

DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOMEDICHE

Aspetti generali

Farmaco = molecola chimica in grado di produrre effetti attraverso l’interazione con altre molecole.

Dai metodi di laboratorio alla sperimentazione clinica.

1. Principi generali del dosaggio biologico e loro applicazione agli studi sull’uomo.

2. Sviluppo di modelli animali attenuare le differenze tra fisiologia animale e patologie umane.

3. Studi clinici per valutare l’efficacia terapeutica.

4. Principi per la valutazione di rischi e benefici.

Il dosaggio biologico

Il dosaggio biologico è la determinazione della concentrazione o della potenza di un farmaco in base all’entità dell’effetto biologico indotto

Metodo in grado di valutare gli effetti di un farmaco:

1.Proprietà di sostanze diverse.

2.Proprietà della stessa sostanza in situazioni diverse.

Valutazione della risposta biologica

Determinazione quantitativa della potenza della sostanza

Il dosaggio biologico

Fornire informazioni predittive sugli effetti del farmaco nelle situazioni cliniche.

Scelta di modelli in vitro e/o in vivo per valutare gli effetti del farmaco a livello fisiologico

Comprensione delle basi molecolari delle malattie

Progresso della tecnologia

(binding, cellule ingegnerizzate,

animali transgenici, ecc.)

Livelli di organizzazione biologica e tipi di misurazioni farmacologiche

La parametrazione varia a seconda del livello di organizzazione biologica sulla quale influisce il farmaco. Gli approcci variano da tecniche di biologia molecolare a metodiche chimiche, da studi in vivo e in vitro su animali a studi clinici su volontari sani o pazienti, fino a valutazioni degli effetti a livello socioeconomico.

Utilizzo dei dosaggi biologici

1. Per determinare quantitativamente l’attività farmacologica di sostanze nuove o chimicamente indefinite.

2. Per studiare la funzione di mediatori endogeni.

3. Per determinare la tossicità o gli effetti indesiderati di un farmaco.

Essenziale nello sviluppo di nuovi farmaci e nello studio di nuovi sistemi di controllo mediati da ormoni o altre sostanze chimiche

Estratti del lobo posteriore della ghiandola pituitaria aumento della P sanguigna e contrazione dell’utero vasopressina e ossitocina

Dosaggi biologici su sistemi di valutazione diversi

Mediatore ignoto(prostanoidi, NO)

Dosaggio parallelo per mezzo della tecnica di superfusione a cascata identificazione e dosaggio di sostanze ignote presenti nel sangue.

Principi generali del dosaggio biologico

Uso degli standard

1950 J.H. Burn: I farmacologi odierni se la prendono con il “braccio del re” ma ingoiano rane, ratti e topi, per non menzionare cavie e piccioni.

I dosaggi biologici sono disegnati per misurare la potenza relativa di due preparazioni, di solito una standard di riferimento (sostanza pura) e una ignota

Disegno del dosaggio biologico (1)

Un dosaggio biologico deve fornire una stima della dose o della concentrazione della sostanza ignota che determina lo stesso effetto biologico di una dose o concentrazione nota dello standard.

Rapporto M di dosi equiattive:

non dipende dalla grandezzadella risposta selezionata

fornisce una stima delrapporto tra la potenza delledue preparazioni

Confronto tra l’entità deglieffetti prodotti da dosi ugualinon fornisce una stima di M

Confronto tra la potenza di una sostanza ignota e di una standard per mezzo del dosaggio biologico

Disegno del dosaggio biologico (2)

1. Minimizzare la variabilità biologica

2. Evitare errori sistematici che derivano dalla variabilità

3. Stimare i limiti di errore dei risultati del saggio

Analisi delle curve dose-risposta saggio 2+2:

due dosi che giacciono sulla porzione lineare della curva semilogaritmica dose risposta vengono somministrate ripetutamente in modo randomizzato.

Curve parallele

Curve NON parallele: i due farmaci hanno un diverso meccanismo d’azione differenze qualitative e quantitative necessarie determinazioni di ordine di grandezza superiore

Risposte graduali e quantali

1. Risposta misurabile (variazione [glucosio] ematico, contrazione di un organo isolato, ecc.)

2. Risposte discontinue o quantali - tutto o nulla (morte, perdita riflesso di raddrizzamento, ecc.)

La pendenza della curva dipende:

1. dal test impiegato

2. dalle variazioni individuali tra animali (variabilità biologica)

Analisi statistiche differenti devono essere usate in ciascuno dei due casi.

Dosaggi biologici nell’uomo

1. Farmacologia umana e clinica

2. Studi clinici

1. Volontari sani o pazienti per validare i meccanismi già descritti nell’animale di laboratorio (problemi etici e di sicurezza)

(test animale non predittivo)

Valutazioni successive su dosiequianalgesiche: effetti collaterali,durata d’azione, sviluppo di tolleranzao dipendenza

2. Misurano l’efficacia terapeutica(molte restrizioni) Valutazione dell’azione analgesica della

morfina e della codeina in pazienti affetti da patologie maligne

Modelli animali di malattie (1)

Ricoprono un ruolo rilevante nella scoperta di nuovi agenti terapeutici anche se riproducono in modo non perfetto soltanto alcuni aspetti delle malattie umane.

Esistono molti modelli sperimentali in grado di predire con una certa accuratezza l’efficacia terapeutica nell’uomo:

mal di moto e nausea (furetto in gabbia oscillante)Infiammazione (iniezione di sostanze irritanti nella zampa di ratto)diabeteipertensioneulcera gastricaecc.

Modelli animali di malattie (2)

Il modello animale dovrebbe essere simile alle patologie nell’uomo nei seguenti modi:

similarità di fenotipo (malattie psichiatriche)

causa comune (spesso complessa o ignota, per es. Alzheimer – necessità di creare modelli “causativi” piuttosto che “sintomatici”)

fisiopatologia simile (inapplicabile a depressione e ansia)

analoga risposta al trattamento (farmaci che agiscono attraverso meccanismi nuovi o non ancora codificati possono sfuggire)

Approccio genetico alla creazione di modelli animali (1)

Attraverso incroci selettivi è possibile ottenere una progenie pura di animali con caratteristiche strettamente simili a certe malattie umane.

I modelli genetici sono impiegati in aggiunta a quelli convenzionali di tipo farmacologico e fisiologico.

Ratti spontaneamente ipertesiTopi geneticamente obesiCani portatori di epilessiaEcc.

Approccio genetico alla creazione di modelli animali (2)

Animali transgenici con mutazioni ben definite vengono prodotti introducendo delle mutazioni nelle cellule germinali di animali (solitamente topi) che permettono di introdurre nuovi geni (knock-in) o di inattivare geni già esistenti (knock-out) o di mutarli negli animali di una colonia di allevamento.

Cambiamenti fenotipici simili a malattie umane per saggiare nuovi farmaci:

topi transgenici che sovraesprimono forme mutate della APP o delle preseniline (Alzheimer)topi transgenici che sovraesprimono la sinucleina (Parkinson)topi transgenici con sottotipi recettoriali inattivati

Approccio genetico alla creazione di modelli animali (3)

Limitazioni

morte dell’animale durante la gestazione o subito dopo la nascitainstaurarsi di cambiamenti adattativialterazione del controllo o delle funzioni di altri geni a causa dell’incorporazione di nuovo materiale genetico

Mutagenesi condizionata

i geni introdotti vengono espressi soltanto in alcune cellule (per es. neuroni)i geni introdotti possono essere attivati o spenti da un segnale esterno (interferone)

Studi clinici (1)

Una prova clinica è un tipo particolare di dosaggio biologico impiegato per paragonare obiettivamente i risultati di due o più procedure terapeutiche.

Per farmaci nuovi fase II e III del protocollo sperimentale clinico.

NB: molti farmaci di indubbia efficacia rimangono in uso senza mai essere stati sottoposti a studi clinici controllati.

Studi clinici (2)

Scopo:confrontare direttamente un farmaco da saggiare (A) con uno standard (B) a un singolo livello di dosaggio

A può anche essere:

combinazione nuova di farmaci notiintervento chirurgicodietatrattamento fisioterapicoecc.

NB: In anticipo deve essere decisa la dose e la frequenza delle somministrazioni.

Studi clinici (3)

L’uso dei controlli è cruciale nelle prove cliniche.

Controlli:

1. Gruppo di pazienti differenti (randomizzazione problemi etici)

2. Stesso gruppo di pazienti (sperimentazione cross-over)

Studi clinici (4)

Risultato:

1. B meglio di A2. B peggio di A3. nessuna differenza significativa

NB: diversamente dai saggi biologici viene paragonata l’efficacia non la potenza

Sono importanti anche:

prevalenza e gravità di eventuali effetti collaterali risposta peggiore o migliore in particolari categorie di

pazienti

Studi più complessi con elevato numero di pazienti

Studi clinici (5)

Anche se la domanda di base è meno sofisticata di quella posta da un convenzionale saggio biologico, l’organizzazione è notevolmente più complessa, lunga e costosa soprattutto in considerazione dell’assoluta necessità di evitare influenze soggettive legate alle aspettative da parte del soggetto e dell’osservatore (BIAS):

1. randomizzazione (assegnazione casuale dei soggetti ad A e B tenendo conto di età, sesso, gravità della patologia = randomizzazione stratificata)

2. disegno sperimentale in doppio cieco (né il soggetto né il ricercatore sanno se viene usato A o B per evitare influenze sullo studio)

3. prova clinica controllata (prevede un confronto tra A e B, e non uno studio di A)

Studi clinici (6)

Considerazioni etiche e di ordine economico impongono il coinvolgimento del minor numero di soggetti possibile.

La statistica ci dice in anticipo il numero necessario per poter ottenere un risultato attendibile anche se non assolutamente conclusivo.

Se il campione non è rappresentativo dell’intera popolazione si possono compiere errori di:

1. tipo I (falso positivo)

2. tipo II (falso negativo)

Potenza di uno studio clinico: probabilità di evitare errori di Tipo II

Studi clinici (6)

Studi sequenziali (Armitage, 1975): riduzione al minimo del numero di soggetti utilizzati attraverso la valutazione progressiva e continua dei risultati con il procedere dello studio per sospenderlo al raggiungimento del risultato (a un livello predeterminato di significatività e di potenza).

Valutazione del risultato clinico

1. Efficacia clinica oggettiva: misurazioni fisiologiche (P, funzionalità epatica), risultato a lungo termine (sopravvivenza), valutazioni soggettive (attenuazione del dolore)

2. Miglioramento della qualità della vita3. Miglioramenti sociali ed economici

Anni di vita di qualità migliore (Quality-Adjusted Life-Years, QALY)

=misura generale dell’efficacia terapeutica che correla il

tempo di sopravvivenza all’attenuazione della sofferenza.

Definizione della Quality-Adjusted LifeYears associata ad un trattamento.

Placebo

Finta medicina, procedura chirurgica o dieta

Risposta al placebo: potente effetto terapeutico in grado di apportare un beneficio significativo a circa un terzo dei pazienti.

Pochi studi paragonano il placebo con il gruppo di controllo non trattato:

1. molti sintomi migliorano spontaneamente2. il paziente è incline a riportare cose che facciano

piacere al medico curante

Rischi:

1. minare la fiducia dei pazienti nell’integrità professionale dei medici

2. dipendenza dalla terapia (non si capisce se il paziente ha ancora bisogno del placebo)

Meta-analisi

È una tecnica statistica utilizzata per valutare complessivamente e riunire I dati originati da parecchi studi indipendenti livelli più elevati di potenza e significatività.

Vantaggi:

Dati contraddittori

Svantaggi:

Mancata pubblicazione di dati negativiDoppia conta degli stessi dati

Determinazione dei rischi e dei benefici (1)

Ehrlich: un farmaco non deve essere giudicato solamente dalle sue proprietà utili, ma anche dai suoi effetti tossici

DL50

Indice terapeutico = ------DE50

Fornisce un’idea del margine di sicurezza di un farmaco.

Limitazioni:

1. DL50 non è un buon indice di tossicità2. Reazioni indesiderate sono mascherate nel test di

DL50 (reazioni idiosincrasiche, stato clinico del paziente)

3. DE50 dipende dal parametro considerato (aspirina)

Determinazione dei rischi e dei benefici (2)

L’indice terapeutico:

ha scarso valore come parametro di utilità clinica di un farmaco

è una misura molto grossolana della sicurezza (talidomide)

è basato su dati di tossicità animale che possono non riflettere forme di tossicità clinicamente importanti

può essere inteso come misura del margine di errore ammissibile nel somministrare un dato farmaco in dosi superiori a quelle terapeutiche (benzodiazepine hanno soppiantato i barbiturici)

Altri metodi per determinare rischi e benefici (1)

Number needed to treat (NNT): il numero di pazienti che deve essere trattato per poter mostrare un dato effetto, sia benefico sia indesiderato.

Efficacia antidolorifica di farmaci antidepressivi:

Beneficio NNT = 3Effetti indesiderati minori NNT = 3Effetti collaterali importanti NNT = 20

Su 100 pazienti:

33 avevano tratto beneficio33 avevano mostrato effetti collaterali minori5 avevano mostrato effeti indesiderati più gravi

Altri metodi per determinare rischi e benefici (2)

NNT è utile per guidare le scelte terapeutiche.

Può tener conto della malattia trattata nel quantificare il beneficio.

Se il farmaco A riduce del 50% la mortalità di una malattia spesso fatale (riducendola dal 50% al 25%) = NNT per salvare una vita è 4.

Se il farmaco B riduce del 50% la mortalità di una malattia raramente fatale (riducendola dal 5% al 2.5%) = NNT per salvare una vita è 40.

A è di maggior valore rispetto a B sebbene entrambi riducano la mortalità del 50%. Inoltre per salvare una vita devono essere esposti al rischio di un effetto collaterale 40 pazienti col farmaco B ma solo 4 col farmaco A.