Il protocollo sperimentalee

i calcoli in laboratorio

Fabio FusiDipartimento di Scienze Biomediche

Il protocollo sperimentale

In fo rm az ion i su ll'an im a le d i lab o ra to rio so lu z ion i p rep ara te

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P ro toco llo sp erim en ta le

Informazioni sull’animale di laboratorio

•Specie utilizzata (ratto, topo, cavia, ecc.)•Ceppo•Ditta fornitrice•Sesso•Peso ----> età•Digiuno (sì - no)•Eventuali trattamenti (reserpinizzato, ecc.)•Anestesia•Metodica di sacrificio•Note

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Sprague-Dawley outbred rats

Informazioni sulle soluzioni preparate

•Soluzioni fisiologiche di perfusione•Soluzioni madri•Pesata•Diluizione•Raccomandazioni per la conservazione della soluzione madre•Note (preparare fresca ogni giorno, agitare prima dell’uso, ecc.)

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Analisi dei risultati

•Raccolta dei tracciati, stampati, ecc.•Immagazzinamento dei dati nel computer•Catalogazione•Elaborazione dei dati raccolti•Produzione di un grafico

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Effetto della miricetina sulla curva concentrazione-risposta al K+

-2.25 -2.00 -1.75 -1.50 -1.25 -1.00

0

25

50

75

100

CTRL

Myr 30

Esperimenti: 7, 12, 19, 28 / 2 /2002

Log [K+] (M)

Ris

po

sta

%

Annotazioni

•Le annotazioni/osservazioni spesso forniscono le informazioni più importanti per la comprensione dei risultati e quindi dell’intero esperimento!

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Le soluzioni fisiologiche per organi isolati (1)

•“Fisiologica” è l’attributo che si associa a numerose soluzioni saline.

•NaCl 0.9% = isotonica

•La soluzione fisiologica serve a mantenere un organo isolato in vita ed in condizioni stabili

•Manipolazione delle proprietà di una soluzione fisiologica

Le soluzioni fisiologiche per organi isolati (2)

La soluzione fisiologica deve:

•assicurare un adeguato apporto di sostanze nutritive•O2

•37°C•corretta composizione ionica•pH•osmolarità

Concentrazioni di alcuni elettroliti (mM) e delle proteine (g/100 ml) nel plasma di alcune specie

Uomo Ratto Porcellino d’India

Na+ 150 151 145

K+ 3.6 5.9 7.4

Cl- 102 110 105

Ca2+ 2.4 2.5 2.2

proteine 7.0 6.3 5.4

Ca2+Na+

fenilefrina

Ca2+ Ca2+

IP3

Ca2+

Ca2+

Ca2+

Na+

Na+

Na+

K+

K+

K+

K+

Ca2+

K+

Na+

Concentrazioni di alcuni elettroliti (mM) e potenziali di equilibrio nel muscolo scheletrico di mammifero

Ione Concentrazione extracellulare

Concentrazione intracellulare

[Ione]o/[Ione]i Potenziale di equilibrio

Na+ 145 12 12 +67

K+ 4 155 0.026 -98

Ca2+ 1.5 1x10-7 M 15000 +129

Cl- 123 4.2 29 -90

RT [K+]o

Equazione di Nerst EK = ------- ln --------nF [K+]i

Soluzioni saline di perfusione per tessuti isolati

Ringer anfibi

Krebs Tyrode Ringer Tyrode Locke

De Jalon Reiter

NaCl 111.0 118.0 137.0 154.0 154.0 115.0

KCl 1.87 4.69 2.68 5.63 5.63 4.7

MgSO4 --- 1.18 1.05 --- --- 1.2

NaH2PO4 0.04 --- 0.42 --- --- ---

KH2PO4 --- 1.2 --- --- --- 1.2

Glucosio 11.0 11.0 5.6 5.6 2.8 10.0

NaHCO3 4.8 25.0 11.5 6.0 6.0 25.0

CaCl2 1.08 2.52 1.8 1.08 2.7 1.8

Gas aria 95% O2

5% CO2

O2

aria

O2 95% O2

5% CO2

95% O2

5% CO2

proteine

Le concentrazioni plasmatiche degli ioni presentano specie-specificità

Specie “Ionizzato” Totale

Cavia 1.7-1.8 2.0-2.3

Ratto 1.3-1.6 2.3-2.6

Uomo 1.1-1.2 2.2-2.9

Concentrazioni (mM) di calcio “ionizzato” e totale nel plasma di alcune specie

pKa

+1pH fisiologico

-1 Sufficiente capacità tampone

Le soluzioni fisiologiche sono soluzioni tampone

La soluzione tampone:

•miscela tra un acido debole e la sua base coniugata•minimizza le variazioni di pH

Perché una coppia coniugata possa essere considerata come un tampone di rilevanza fisiologica:

Ca2+

H2PO4 + HPO4-

pK’a = 7.2

H2CO3 + HCO3-

pK’a = 3.8

CO2(acq.)CO2(gas)

Legge di Henry

Il pHImportante per la vitalità e funzionalità del tessuto

Determina il grado di ionizzazione delle molecole

AH

BOH

A- H+

B+ OH-

Attività <-----> InattivitàEnzimiLivelli di [Ca2+]i

Contrattilità muscolareMeccanismi osmoticiEcc.

L’osmolarità

L’osmolarità di una soluzione deve essere vista come l’effettiva pressione osmotica che questa soluzione può sviluppare sui tessuti.

Una osmole = 22.4 atm a 0°C (pressione osmotica di una soluzione 1 M di un non-elettrolita ideale).

L’osmolarità di una soluzione reale può essere determinata direttamente dalla misura del punto di congelamento.

swelling

Soluzione ipo-osmotica

H2O

shrinking

Soluzione iper-osmotica

H2O

La temperatura

Variabile fisiologica strettamente controllata nel vivente

Influenza sia la risposta basale di un preparato che la responsività ai farmaci (utero di ratto)

La riduzione della temperatura diminuisce il consumo di ossigeno ed il rischio di ipossia

Influenza il pH delle soluzioni

L’ossigenazione

Importante per la sopravvivenza di un tessuto

Apparato sperimentale, spessore del tessuto, consumo di ossigeno tessutale (temperatura e attività) e pressione parziale di ossigeno nella soluzione fisiologica influenzano l’ossigenazione.

La quantità di un gas disciolto in soluzione dipende da:•solubilità del gas nell’acqua•pressione del gas nella fase gassosa•temperatura•presenza di soluti nell’acqua

I calcoli in laboratorio

Dalla molarità ai grammi (1)

M 1 x 100 mM 1 x 10-3 µM 1 x 10-6 nM 1 x 10-9 pM 1 x 10-12

Come si esprime la concentrazione di una soluzione

M = n / V con V = litro

Dalla molarità ai grammi (2)

Come si calcolano i grammi da pesare per preparare una soluzione a concentrazione e volume noti

M = n / V con n = g / PM

ne consegue che

M = g / PM x V

ovvero

g = M x PM x V

La pesata “approssimata”

Come si calcolano i g da pesare per preparare una soluzione a concentrazione e volume noti di una sostanza costosa

g = M x PM x V

Preparare 1 ml di una soluzione di quercetina (PM = 338) 10 mM

g = 0.01 x 338 x 0.001 = 0.00338pesata = 0.00221 g

applico la proporzione

0.00338 g : 1 ml = 0.00221 g : X ml

La diluizione

Come si prepara una soluzione a concentrazione e volume noti a partire da una soluzione più concentrata

C1 x V1 = C2 x V2

•1 indica la soluzione da preparare•2 indica la soluzione più concentrata•C e V devono essere sempre espressi con la stessa unità di misura

Il problema solvente

Molte sostanze impiegate nella ricerca di base e pre-clinica sono lipofile.

dimetilsolfossidoetanolo

dimetilformammide

metanolo

Effetto di un farmaco sulla contrazione indotta da10 µM fenilefrina

CTRL

DMSO

drug 1

0

drug 3

0

drug 1

000

25

50

75

100

***

*

Res

pons

e (%

)

-2.25 -2.00 -1.75 -1.50 -1.25

0

25

50

75

100

125

DMSOethanol

Log [K+] (M)

Res

pons

e (%

)

-2.25 -2.00 -1.75 -1.50 -1.25

0

25

50

75

100

125 DMSO30 µM myricetinethanol10 nM Bay K 8644

Log [K+] (M)

Res

pons

e (%

)