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Messa in evidenza tramite Real-Time PCR del gene della tossina

Panton-Valentine leucocidina in ceppi di

Staphylococcus aureus meticillino resistenti di acquisizione ospedaliera ed extra ospedaliera

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Lavoro di Diploma Ardia Claudia

SSMT 2005/2006

Ricerca eseguita presso: Istituto Cantonale di Microbiologia

Responsabile:

D.ssa Martinetti Lucchini Gladys

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RIASSUNTO L�aumento dei ceppi batterici multi-resistenti, dovuto all�esposizione continua agli antibiotici per lungo tempo e all�abuso di quest�ultimi, sta diventando un grosso problema ospedaliero a livello mondiale. Fanno parte di queste famiglie multi-resistenti gli Staphylococcus aureus meticillino resistenti (MRSA).Oltre agli Staphylococcus aureus MRSA d�origine nosocomiale, ci sono anche famiglie di Staphylococcus aureus MRSA d�origine ambientale, la cui resistenza alla meticillina è già geneticamente predisposta dal battere e non acquisita come succede nei ceppi ospedalieri. Alcuni studi, non ancora definitivi, stanno mettendo in evidenza la presenza del gene della tossina Panton-Valentine leucocidina (PVL) negli Staphylococcus aureus MRSA di origine ambientale piuttosto che negli Staphylococcus aureus MRSA di origine ospedaliera. La teoria ipotizzata da questi studi è la possibilità che il gene PVL diventi un marcatore che ci permetta di differenziare l�origine degli Staphylococcus aureus MRSA. Qui è nata l�idea e l�esigenza di questo lavoro di diploma. L�obiettivo di questo lavoro di diploma è mettere in evidenza, tra tutti i campioni presi in considerazione, i ceppi che possiedono il gene PVL e valutare se i miei risultati concordano con le nuove teorie. L�obiettivo di questo lavoro di diploma è stato quello di assemblare 300 campioni di Staphylococcus aureus MRSA di origine nosocomiale e 100 campioni di Staphylococcus aureus MRSA di origine comunitaria dalla collezione dell�Istituto Cantonale di Microbiologia e amplificarli tramite la tecnica in Real�Time PCR per mettere in evidenza l�eventuale gene PVL. Le varie amplificazioni hanno messo in evidenza il gene PVL nel 11% dei ceppi MRSA di origine comunitaria rispetto al 1.3% dei ceppi ospedalieri. La maggior parte dei ceppi PVL positivi sono stati isolati soprattutto da strisci ferita di varia gravità e sono stati coinvolti maggiormente i bambini e gli adulti. In conclusione i risultati ottenuti sono stati interessanti e concordanti con i nuovi studi pubblicati

ABSTRACT The increase of multiresistant bacterial strains in the hospital environment in due to the selection pressare of antibiotic use. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a major cause of hospital-acquired infection worldwide. Recently, however, there have been reports indicating an increased incidence of MRSA infections afflicting individuals with no apparent risk for hospital acquisition. These community-acquired MRSA strains possess several features that distinguish them from nosocomial MRSA. In particular they carry thes genes for Panton-Valentine leucocidin (PVL), a bicomponent cytotoxin virulence factor associated with skin and soft-tissue infections. The aim of my diploma work is ha detect PVL gene in nosocomial and community acquired MRSA strains. Using Real-Time PCR, a fragment of the PVL gene is amplified with specific primers. A melting curve analysis was performed; this enables an assessment of the specificity of the amplication reaction. The Istituto Cantonale di Microbiologia is collecting MRSA isolates since 1992. Two different collections were included in this study. The first collection of 300 strains was isolated from hospitalized patients from 1997-2006, the second from private patients from 1997-2006. Those collections were investigated for the presence of the genes coding for PVL. Results of the study indicate a prevalence of PVL positive isolates in the community-acquired MRSA strains. The incidence was 11% comparing to 1.3% of the nosocomial isolates. The majority of strains were isolated from wound swabs, the patients were especially in children and young adults. My results are interesting and in complete agreement with studies published recently.

INDICE Pagina

Introduzione …………………………………………………………………… 1-5 Le forme dei batteri ������������������������ 1 Struttura generale di un battere �������������������.. 2-3 • Parete cellulare ������������������������� 2 • Membrana citoplasmatica �������������������� 2-3 • Citoplasma ��������������������������... 3 • Nucleoide/Plasmide �����������������������. 3 • Ribosomi ���������������������������.. 3 • Capsula ���������������������������� 3 • Flagelli ����������������������������. 3 • Pili �����������������.������........................... 3 • Fimbrie �������������������������..�....... 3 La colorazione di Gram �����������������������. 4 Lo Staphylococcus aureus ����������������������. 4 Lo Staphylococcus aureus MRSA e il gene PVL �������������. 5 Obiettivi del lavoro ������������������������. 6

Materiale e metodi …………………………………………………………….. 7-12 Criteri di selezione ������������������������� 7 Test MRSA-Screen ������������������������ 8-9 L�estrazione del DNA batterico ��������������������. 9 Real-Time PCR ������������������������� 9-12 • LightCycler 2.0 �����������������������.. 9-10 • MasterMix ��������������������������. 10 • Programma Staph. PVL ��������������������. 11-12 • Controllo positivo �����������������������.. 12

Risultati/Discussione …………………………………………………………. 13-14 Conclusione ………………………………………………………………………. 15 Bibliografia ……………………………………………………………..………... 16

Ringraziamenti ………………………………………………………………….. 17

Allegati ……………………………………………………………………..… 18-26 • Metodica MRSA-Screen �������������������. 19-20 • Metodica estrazione DNA �������������������� 21 • Metodica estrazione controllo positivo ��������������� 22 • Lotto dei Kit utilizzati ��������������������. 23-26

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INTRODUZIONE LE FORME DEI BATTERI

I batteri sono microrganismi procarioti di piccole dimensioni, che possono variare tra lo 0.3-5 µm, e di differenti forme. Le forme principali sono i cocchi, di forma sferica, i bacilli diritti, che hanno una forma a bastoncello e i bacilli spiraliforme, di forma bastoncellare ma più ricurva. I cocchi possiamo trovarli disposti in modo singolo, a coppie (diplococchi), raggruppati a forma di grappolo (stafilococchi) o in fila come una catena (streptococchi), i bacilli diritti, generalmente, sono disposti singolarmente (piccoli, lunghi, tozzi,..) in modo casuale, a forma di clava (Corinebatteri) o con le estremità appuntite (Fusobatteri), mentre i bacilli spiraliforme possono essere incurvati (Vibrioni) o incurvati a spirale (Spirilli, Spirochete) [1,2].

Figura 1:

Figura 1 L�immagine mostra la possibile morfologia delle tre classi batteriche, i cocchi, i bacilli diritti e i bacilli spiraliforme; la posizione delle varie spore e dei flagelli [1].

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STRUTTURA GENERALE DI UN BATTERE Un battere è formato da una parete cellulare e dalla membrana citoplasmatica, dette strutture esterne, e da strutture interne quali il citoplasma, il nucleoide ed i ribosomi. Inoltre alcune specie batteriche possono avere anche delle strutture facoltative come la capsula, i flagelli, i pili e le fimbrie.

Parete cellulare: È composta da sostanze chimiche presenti solo nei batteri come l�acido diamminopimelico, l�acido muramico, l�acido teicoico, degli amminoacidi, come ad esempio gli amminozuccheri, dei carboidrati e dei lipidi. Unendosi tra di loro formano delle sostanze polimeriche, di cui una molto importante: la mureina. La mureina, o peptoglicano, è indispensabile perché fornisce alla parete cellulare la sua struttura rigida che conferisce al battere la sua forma. La parete cellulare dei batteri gram negativi ha una struttura più ricca di amminoacidi e lipidi rispetto ai batteri gram positivi, che però contengono una maggiore quantità di mureina. Le funzioni della parete cellulare sono: evitare la lisi osmotica del battere, protezione della cellula batterica dall�esterno e riconoscimento di batteri o virus nelle vicinanze. Membrana citoplasmatica: La membrana citoplasmatica, si trova subito dopo la parete cellulare ed è formata da un doppio strato di fosfolipidi con intercalate delle proteine. Soprattutto nei batteri gram positivi, in alcuni punti, la membrana forma dei prolungamenti chiamati mesosomi (che svolgono funzioni analoghe alla membrana citoplasmatica). La membrana batterica è molto simile alla membrana cellulare delle cellule eucariote, ma non contiene colesterolo che, negli eucarioti, funge da protezione per le variazioni osmotiche, infatti, i batteri hanno la parete cellulare che svolge anche questa funzione di protezione osmotica. La membrana citoplasmatica ha una funzione: selettiva, grazie alla proteina permeasi che regola l�entrata delle sostanze nutritive dall�esterno all�interno della cellula; di trasporto (proteine di

Figura 2 L�immagine rappresenta il modello di un battere con le strutture interne e facoltative [2].

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trasporto) per le sostanze che devono entrare o uscire dalla cellula; secretoria, cioè che secerne esoenzimi (che servono alla digestione di molecole grandi fuori dalla cellula) ed esotossine. Inoltre, sulla membrana, troviamo delle proteine che servono: alla regolazione e separazione del DNA durante la divisione cellulare, da enzimi che prendono parte al processo di produzione di energia (catena respiratoria), da enzimi necessari alla sintesi della parete cellulare (durante la divisione cellulare) e presenza di proteine sensoriali, cui scopo è ricevere informazioni dall�esterno. Citoplasma: Il citoplasma è il luogo dove avvengono tutte le reazioni chimiche del battere, esso è formato soprattutto d�acqua, dai ribosomi, enzimi, polisaccaridi come l�amido e il glicogeno, ed altre piccole molecole organiche. Nel citoplasma è contenuto anche il nucleoide. Nucleoide/Plasmide: Il nucleoide è formato da un lungo filamento di DNA a doppia elica, cioè il cromosoma batterico, libero nel citoplasma e senza un nucleo attorno. Il cromosoma batterico contiene tutte le informazioni che servono al battere per riprodursi e vivere. Il plasmide è una piccola sequenza di DNA di forma circolare, indipendente dal nucleoide, presente in quasi tutti i batteri, che contiene informazioni supplementari. Le informazioni più importanti che possono essere trasmesse da battere a battere tramite il plasmide sono le resistenze agli antibiotici. Ribosomi: I ribosomi sono degli organelli situati in gruppo vicino alla membrana cellulare e hanno il compito, di sintetizzare le proteine partendo dal RNA messaggero. Capsula: La capsula è uno strato, più o meno spesso, di polipeptidi che avvolge il battere e che lo rende più virulento, cioè più resistente agli attacchi del sistema immunitario rendendo più difficile la sua fagocitosi. Questi polipeptidi sono del materiale di scarto che il battere produce quando si trova in un ambiente favorevole. Flagelli: I flagelli sono delle appendici composte da una proteina elastica, la flagellina, che ruotando su se stessi, permettono il movimento attivo del battere. Sono ancorati alla parete cellulare e possono disporsi in unità singole, monotrichi, diverse unità disposte in un area precisa, lofotrichi, o sparse su tutta la superficie batterica, peritriche. I batteri sprovvisti di flagelli, possono spostarsi solo passivamente tramite peristalsi, per inerzia, con una corrente o tramite l�organismo ospite. Pili: I pili sono dei piccoli tubi cavi che partono dalla parete cellulare, e servono allo scambio di materiale genetico (p. esempio i geni della resistenza ad un antibiotico) tra batteri. Fimbrie: Le fimbrie sono dei tubi simili ai pili, ma non sono cavi, e servono al battere per aderire meglio alle superfici delle cellule, aumentando così la sua patogenicità [1,2].

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LA COLORAZIONE DI GRAM La colorazione di Gram fu inventata dal fisico danese Hans Christian Gram [3], ed è una tecnica semplice, veloce, a basso costo, che permette di dividere i batteri in gram positivi (color viola) e negativi (color rosa), col vantaggio di poter inoltre distinguere la morfologia di quest�ultimi [4]. Principio della colorazione: Inizialmente il materiale viene strisciato su un vetrino e poi fissato con metanolo puro, una volta asciutto si copre il materiale con una soluzione di violetto di genziana (primo colorante), che entra all�interno della parete cellulare; in seguito il materiale viene ricoperto con un'altra soluzione chiamata Lugol (mordente), che forma un complesso col violetto di genziana. Per la fase di decolorazione viene utilizzato l�alcool-acetone, che serve ad asportare fuori dalla cellula il complesso violetto di genziana-Lugol. L�asportazione del complesso dipende dalla permeabilità della parete cellulare del battere, quindi più la parete cellulare è permeabile, più il battere tenderà a decolorarsi eliminando il colore viola (violetto di genziana); viceversa se la parete cellulare è poco permeabile il battere avrà una colorazione viola. Questa fase è abbastanza delicata, perché se decoloriamo troppo rischiamo di togliere a tutti i batteri la colorazione viola, mentre se decoloriamo troppo poco vedremo solo batteri viola; alterando così l�interpretazione del preparato. Comunque l�occhio esperto non si basa solo sulla colorazione, ma anche sulla morfologia, il modo in cui si dispone il battere e prende in considerazione anche il tipo di materiale che sta guardando. Dopo la fase di decolorazione, bisogna dare un colore ai batteri decolorati in modo da metterli in evidenza, e per fare ciò viene usata la fucsina, che dà un colore rosa [5]. LO STAPHYLOCOCCUS AUREUS Lo Staphylococcus aureus fa parte dei cocchi gram positivi, anaerobio facoltativo ed è visibile nei preparati con la colorazione di Gram, dove appare in gruppi a forma di grappolo. Sulle piastre di coltura, a occhio nudo, la sua colonia appare �bombata�, di colore panna-oro e, ma non di regola, su piastra agar-sangue intorno alla colonia può formarsi un alone di emolisi totale (β-emolisi). Tutti gli stafilococchi sono catalasi positivi, mentre solo lo Staphylococcus aureus è anche coagulasi positivo. Le principali patologie provocate da enzimi e tossine prodotte dallo Staphylococcus aureus sono: Affezioni cutanee: foruncoli, ascessi, acne, impetigine, infezioni di ferite. Tossinfezioni alimentari: gastroenteriti (nausea, vomito, diarrea) senza febbre, dopo 1-10 ore dall�ingestione di alimenti (carne, creme, latticini, gelati..) contaminati da enterotossine. Infezioni respiratorie: sinusiti, broncopolmoniti, pleuriti. Infezioni ematogene: setticemie, meningiti. L�habitat principale dello Staph. aureus sono la cute e le mucose, soprattutto le narici del naso. La trasmissione da un individuo all�altro, avviene soprattutto in maniera diretta tramite le mani o indirettamente tramite l�aria, ad esempio con uno starnuto [1,2,6].

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LO STHAPYLOCOCCUS AUREUS MRSA E IL GENE PVL A livello ospedaliero esistono dei ceppi batterici che, grazie ad una continua esposizione agli stessi medicamenti, alla loro mutazione e selezione, e ad uno scambio di informazioni genetiche, sviluppano una resistenza ad uno o più antibiotici. Questi batteri vengono chiamati multi-resistenti. Lo Staphylococcus aureus meticillino resistente (MRSA) è un battere che fa parte dei ceppi multi-resistenti che a livello ospedaliero sta creando grossi problemi, sia per la sua resistenza alla meticillina, un antibiotico creato per inibire la crescita dei batteri gram positivi resistenti all�antibiotico penicillina, per la presenza di penicillinasi, sia per la sua facile diffusione. Questi ceppi batterici, inoltre, risultano resistenti anche a tutti i β-lattamici e alle cefalosporine. La presenza di ceppi MRSA in un ospedale è fortemente correlata ad un aumento delle batteriemie causate da questo microrganismo, questo fenomeno comporta un aumento sia dei costi che della lunghezza della degenza ospedaliera. Malgrado lo Staphylococcus aureus MRSA è considerato un battere di origine ospedaliera, ci sono alcuni ceppi di origine comunitaria. Questi ceppi comunitari di Staphylococcus aureus MRSA non hanno acquisito la resistenza alla meticillina tramite una continua selezione degli antibiotici. Alcuni studi stanno lavorando sugli Staphylococcus aureus MRSA di origine comunitaria e stanno mettendo in evidenza un gene che la maggior parte di questi ceppi hanno: il gene della tossina Panton-Valentine leucocidina (PVL). Questo gene da origine ad una tossina, la tossina Panton-Valentine leucocidina. Tutti i ceppi di Staphylococus aureus producono più di 30 tipi di prodotti extracellulari. Quasi tutti i ceppi secernono un gruppo di enzimi e citotossine tra le quali diversi tipi di emolisine, nucelasi, proteasi, lipasi e collagenasi. PVL e ,γ emolisine sono considerate appartenenti alla stessa famiglia, infatti agiscono entrambe sulla membrana cellulare per sinergia di due proteine che formano un poro. Lo Staphylococcus aureus MRSA con il gene PVL può causare gravi lesioni a dipendenza del luogo infettato, ma soprattutto lesioni cutanee e complicazioni con possibilità di necrosi del tessuto polmonare. Per tutte queste ragioni, in tutto il mondo, sono stati formati dei gruppi di monitoraggio e di studi per questo battere che sta diventando sempre più di grande importanza clinica L�obiettivo finale di questo studio è quello di testare la diffusione del gene PVL nella collezione di ceppi d�origine nosocomiale e comunitaria tra gli anni 1997-2006 dell�Istituto Cantonale di Microbiologia di Bellinzona [7,8,9].

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OBIETTIVI DEL LAVORO

• Testare 400 campioni di Staphylococcus aureus MRSA di origine nosocomiale e comunitaria con la tecnica in Real-Time PCR, con l�apparecchio LightCycler 2.0 della ditta Roche, per mettere in evidenza un eventuale presenza del gene della tossina Panton Valentine leucocidina (PVL).

• Dopo aver testato i 400 campioni, valutare la percentuale dei ceppi batterici con il gene PVL

positivo, la provenienza del campione e il tipo di materiale da cui è stato preso il ceppo.

OBIETTIVO PERSONALE

• Approfondire e migliorare, durante la stesura di questo lavoro, le mie conoscenze sulla tecnica in RT-PCR e sull�apparecchio LightCycler 2.0 della ditta Roche.

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MATERIALE E METODI Il mio lavoro di ricerca, è cominciato selezionando 400 campioni di Staphylococcus aureus MRSA dalle liste tra il 1997-2006 dell�Istituto Cantonale di Microbiologia, dove sono contenute tutte le informazioni riguardanti il paziente, la provenienza del materiale (ospedaliero, da medico privato o da cliniche) e che tipo di materiale è stato inviato. A questo punto è stata fatta una scelta fra i vari campioni e con la mia responsabile, D.ssa Gladys Martinetti Lucchini, abbiamo deciso i criteri di selezione:

• I campioni devono essere scelti negli anni 1997-2006, e ogni anno deve essere rappresentato.

• Ogni prelievo di materiale deve essere unico, cioè sono stati scartati tutti i materiali che avevano come provenienza lo stesso paziente.

• I 300 campioni di origine ospedaliera devono provenire da reparti di degenza e sono stati presi in considerazione tre tipi di materiale di partenza, 200 strisci ferita di vario tipo (superficiali, profondi, strisci ascessi, necrosi, decubiti..), 70 espettorati e 30 uricult.

• Per i 100 campioni di origine extra ospedaliera (medici privati), sono stati presi in considerazione tutti i tipi di materiale d�origine (strisci orecchio, naso, emocolture, strisci ferita, espettorati..), semplicemente perché altrimenti non era possibile avere un numero sufficiente di campioni.

• Sono stati scartati i campioni inviati da cliniche private perché ci siamo concentrati strettamente sui materiali inviati dagli ospedali.

La decisione di prendere in considerazione soprattutto gli strisci ferita, gli espettorati e gli uricult è dovuta al fatto che si è riscontrato un aumento degli Staphylococcus aureus MRSA con il gene PVL in particolar modo in questi materiali. Dopo aver creato delle nuove liste di lavoro, ho cercato ogni ceppo di Staphylococcus aureus MRSA (tramite il loro numero di archiviazione), conservati in appositi terreni per la congelazione (Skim Milk), nei congelatori a -80°C e, una volta individuati i vari ceppi, inseminarli con la tecnica dei tre settori su piastre Agar-sangue (terreno di arricchimento, arricchito con sangue di montone, dove è ben visibile l�emolisi dello Staphylococcus aureus). La tecnica dei tre settori consiste nello spatolare con l�ansa il materiale da analizzare su una placca in tre settori ben distinti in modo da diminuire la concentrazione del battere nel materiale, ottenendo delle colonie ben separate nel terzo settore. Quest�ultime verranno poi utilizzate per altri test d�identificazione.

Figura 3 In questa figura sono stati messi in evidenza i tre settori di una placca. 1) primo settore (troviamo una patina dove il battere è fortemente concentrato; 2) secondo settore e 3) terzo settore (troviamo le colonie batteriche isolate)[6].

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In seguito alla messa su placca del battere, viene posizionato sul primo settore un dischetto dell�antibiotico cefoxitina (dove il battere è più concentrato), in modo che le colonie batteriche che si svilupperanno in prossimità del dischetto, serviranno per il test MRSA-Screen. In seguito le piastre sono incubate 24 ore nel termostato a 35°C in CO2 , permettendo una crescita ottimale del battere. La cefoxitina è un antibiotico simile e della stessa famiglia dell�antibiotico meticillina, solo che ha il vantaggio di far esprimere meglio al battere la proteina PBP2� (Penicillin Binding Protein 2�), che è responsabile della resistenza da parte del battere alla meticillina. In seguito la piastra viene tolta dall�incubatore e controllata per verificare che sia pura, quindi viene eseguito MRSA-Screen.

TEST MRSA-SCREEN Il kit MRSA-Screen, della ditta DENKA SEIKEN CO LTD di Tokyo, è un test qualitativo ad agglutinazione finale per la ricerca del prodotto del gene mecA, la PBP2� (Penicillin Bilding Protein 2�), che è responsabile della resistenza alla meticillina da parte degli Staphylococcus aureus (Staph. aureus MRSA). Il test MRSA-Screen è eseguito per verificare che la proteina PBP2� non si sia degradata con la conservazione del ceppo batterico. Principio del test: Il test è composto principalmente da due parti, inizialmente il materiale batterico (prelevato con un ansa di platino dall�alone, massimo di 13 mm, attorno alla cefoxitina) viene incubato a 95°C per 3 min con il primo enzima di estrazione, in seguito viene aggiunto un secondo enzima di estrazione e il tutto viene poi centrifugato. Il primo enzima di estrazione, crea un pH alcalino che viene poi neutralizzato dal secondo enzima di estrazione. Il cambiamento di pH, permette di staccare la PBP2� che si trova sulla membrana cellulare del battere, per poi ritrovarla nel sopranatante. La positività del test, cioè la presenza della proteina PBP2�, viene messa in evidenza tramite l�agglutinazione del sopranatante batterico con degli anticorpi monoclonali specifici per la proteina presa in questione.

Figura 4 Questa fotografia rappresenta la crescita di uno Staph. aureus MRSA su placca Agar-sangue, con il dischetto di cefoxitina nel primo settore [14].

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Solo i ceppi positivi al MRSA-Screen vengono utilizzati per l�estrazione del DNA batterico, nella quale si usa un protocollo rapido. L’ESTRAZIONE DEL DNA BATTERICO L�estrazione viene eseguita sotto cappa per evitare contaminazioni. Prima di tutto sono risospese 3-5 colonie isolate di materiale batterico in 200 µl di IstaGene� Matrix (precedentemente aliquotata nelle Eppendorf safe-look) con dei movimenti rotatori dell�ansa di plastica, poi il tube viene vortexato. Questo passaggio è molto importante perché nell�Istagene� Matrix è contenuto un solvente che si lega gli organelli e alle particelle che vengono rilasciate durante la lisi delle cellule batteriche. Dopo di ciò, l�Eppendorf è incubata nel termoblocco a 95°C per 10 minuti; per favorire la lisi batterica. Le cellule lisate vengono centrifugate per 10 minuti a 10000 rpm per far scendere sul fondo tutte le particelle pesanti (organelli legati al solvente), così che nel sopranatante rimane solo il DNA purificato pronto per l�amplificazione. Il DNA così estratto è conservato a 2-8°C. Una volta fatto l�MRSA-Screen, confermando la resistenza alla meticillina, ed estratto il DNA da ogni ceppo di Staphylococcus aureus, bisogna amplificare tramite la Real-Time PCR il DNA del battere per la ricerca della tossina PVL. REAL-TIME PCR La Polymerase Chain Reaction (PCR) è una reazione che permette di amplificare in modo esponenziale il DNA. Per il mio lavoro viene utilizzata la Real-Time PCR che, oltre ad amplificare il DNA, permette di monitorare in tempo reale il prodotto amplificato tramite l�utilizzo della molecola fluorescente SYBR Green 1. Questa tecnica in Real-Time PCR è utilizzata sull�apparecchio LightCycler 2.0 della ditta Roche Diagnostics. LightCycler 2.0 Il LightCycler 2.0 della ditta Roche Diagnostics è un apparecchio che permette di effettuare la tecnica in Real-Time PCR in tempi brevi, circa 1 ora, grazie alla sua velocità nello scambio termico (20°C /secondo). L�apparecchio è formato essenzialmente da due unità: il sistema thermocycler e un unità ottica di rilevamento. Il sistema thermocycler è composto da una camera di riscaldamento, controllata da un sistema di riscaldamento posto nel coperchio dell�apparecchio, che riscalda o raffredda l�aria prelevata dall�ambiente esterno in base ai bisogni dalla reazione, mentre l�unità di rilevamento è formata da un fluorimetro a microvolume che serve a emettere energia ad una particolare lunghezza d�onda che eccita le molecole fluorescenti (SYBR Green 1) nel campione, e a rilevare la fluorescenza emessa a sua volta dal campione. Un'altra parte fondamentale del LightCycler 2.0 sono i capillari in borosilicio. Il sistema thermocycler e il materiale di costruzione dei capillari permettono uno scambio termico molto veloce, che consentono di effettuare la Real-Time PCR in tempi brevi. L�apparecchio può amplificare un massimo di 32 campioni per run [11].

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MasterMix Per effettuare la reazione in Real-Time PCR il DNA è incorporato in una soluzione di tutti i componenti necessari per l�amplificazione del campione. Il MasterMix che utilizzato, è costruito dalle componenti del kit LightCycler® FastStart DNA Master SYBR Green della ditta Roche Diagnostics, e contiene:

• La molecola SYBR Green 1 (responsabile della fluorescenza) • Taq DNA polymerase (enzima che permette l�amplificazione) • Reaction buffer (soluzione tampone) • dNTP (nucleotidi: dATP, dGTP, dCTP e dUTP al posto del dTTP)

Al MasterMix della ditta Roche Diagnostics si aggiunto i due primers PV 1 e PV 2 (sintetizzati dalla ditta Microsynth GmbH di Balgach), l�acqua, il cloruro di magnesio (MgCl2 ) e l�UNG alle concentrazioni specificate sotto. I primer sono oligonucleotidi omologhi alle sequenze d�inizio e finali del frammento.

• Primer Staph PV 1 (5� GTA AAA TGT CTG GAC ATG ATC CA 3�) • Primer Staph PV 2 (5� CAA S1TG TAT TGG ATA GCA AAA GC 3�)

L�efficienza dell�amplificazione è stata ottimalizzata variando la concentrazione dei primers, del cloruro di magnesio e della temperatura di ibridazione dei primers. Il mix finale è così composto [11]:

Componenti : Conc. Finale 1 reazione

H2O PCR-grade 8.1 µl Master Mix SYBR Green 1 1x 2.0 µl MgCl2 4 mM 2.4 µl Primer STAPH PV 1 0.7 µM 1.4 µl Primer STAPH PV 2 0.5 µM 1.0 µl UNG 0.1 U 0.1 µl

Totale 15.0 µl

1 S = C/G

Figura 5 LightCycler 2.0 system della ditta Roche Diagnostics [12].

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Programma Staph. PVL Lo Staph. PVL è il programma specifico per amplificare il DNA e determinare se il ceppo batterico preso in questione ha il gene PVL. Il programma è diviso in 4 parti: UNG, Denaturation, Amplification e la curva di Fusione.

CYCLES TARGET (°C)

HOLD (hh:mm:ss)

RAMP RATE (°C)

UNG 1 37 00:05:00 DENATURATION 1 95 00:10:00 20 AMPLIFICATION 95 00:00:10 20 52 00:00:05 20

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72 00:00:18 20 MELTING 95 00:00:10 20 65 00:00:05 20

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95 00:00:00 0.1 COOLING Questa parte del programma serve unicamente a raffreddare i

componenti dell�apparecchio in modo da renderli maneggiabili. Il primo step (10 min a 37°C) serve ad attivare l�UNG (Uracil-DNA N-Glycosilase), l�enzima che elimina le eventuali contaminazioni da DNA già amplificato, chiamate carry-over. Durante l�amplificazione, nel mix, si sostituisce il nucleotide dTTP con il nucleotide dUTP, creando così un DNA �artificiale�. Nel caso di una contaminazione da DNA già amplificato, l�UNG si lega in modo specifico alla sequenza in corrispondenza del nucleotide dUTP spezzando la catena nucleotidica. Nel secondo step c�è la denaturazione totale del DNA, la disattivazione dell�UNG e l�attivazione della Hot Start DNA Polymerase. Questo genere di polymerase aumenta la specificità del prodotto, riducendo la formazione di primer dimers. Con denaturazione s�intende il cambiamento della conformazione del DNA, cioè la sua struttura a doppia elica viene aperta e si creano due filamenti ben distinti. Nel terzo step avviene l�amplificazione del materiale genetico. Nel protocollo del programma Staph PVL l�amplificazione dura 35 cicli composti ognuno da tre temperature diverse. Nella prima parte si denatura il DNA ad una temperatura di 95°C. Nella seconda parte la temperatura scende a 52°C permettendo l�ibridazione dei primers alle sequenze omologhe. Durante la terza parte la temperatura sale a 72°C e la Taq DNA polymerase riconosce i primer e inizia la sua attività duplicativa utilizzando i nucleotidi dATP (A), dGTP (G), dCTP (C) e dUTP (U) a sua disposizione appaiandoli in modo complementare, A-U(Adenina-Uracile) e C-G (Citosina-Guanina). In questo caso al posto della Timina (dTTP) utilizzo l�Uracile (dUTP), che è una molecola simile alla Timina , per i motivi che riguardano l�UNG. In questa fase la molecola SYBR Green 1 si intercala tra, e solo, tra le basi del DNA amplificato emettendo fluorescenza.

Figura 6 Nella tabella è riportato il programma Staph PVL con i dettegli dei vari step.

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La fluorescenza emanata dalla SYBR Green 1 è proporzionale al DNA amplificato. Il quarto step è rappresentato dalla curva di Melting, che è specifica per ogni prodotto amplificato, in quanto è correlata alla sequenza del frammento. Durante questa fase, composta da un solo ciclo, la temperatura si eleva da 65°C a 95°C in modo molto lento, provocando una graduale denaturazione del DNA e una diminuzione costante della fluorescenza. Quest�ultima viene misurata in modo continuo, visibile graficamente come una curva discendente. Il software del computer tramite calcolo informatico riesce a ricostruire un grafico dove viene messa meglio in evidenza la temperatura di fusione.

Controllo positivo Ogni volta che si amplificano dei campioni si utilizzano un controllo negativo e di un controllo positivo. Come controllo negativo utilizzo H2O PCR-grade che serve a vedere come si comporta il grafico di un campione senza la sequenza bersaglio e per mettere in evidenza eventuali reagenti contaminati. Il controllo positivo è formato da DNA batterico isolato da un ceppo di Staphylococcus aureus MRSA contenente il gene PVL, con il QIAamp DNA Mini Kit con la sua metodica per l�estrazione del DNA, della ditta QIAGEN AG. Il controllo positivo serve a monitorare l�efficienza dell�amplificazione, cioè in tutte le serie l�andamento della fluorescenza dovrà essere simile. Dopo l�estrazione il DNA viene diluito a 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 e poi amplificato. Verrà scelta la diluizione di DNA che presenta nel grafico una temperatura di fusione idonea, cioè che si situa tra 79-81°C. La diluizione idonea verrà aliquotata e conservata a -20°C.

Figura 7 Questa figura rappresenta i due grafici che si ottengono come risultato alla fine di ogni run d�analisi. Il primo grafico in alto mostra al curva di Melting, mentre il grafico in basso è il risultato del calcolo informatico del software per mettere meglio in evidenza la temperatura in cui il DNA è completamente denaturato [13].

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RISULTATI / DISCUSSIONE Osservando la tabella sottostante, che riassume i risultati ottenuti dalle amplificazioni dei 400 ceppi di Staphylococcus aureus MRSA, possiamo osservare che c�è una positività maggiore al gene Panton Valentine Leucocidina nei ceppi di origine comunitaria rispetto ai ceppi di origine nosocomiale. In particolare possiamo dire che su 300 campioni di Staphylococcus aureus MRSA di origine nosocomiale solo 4 ceppi sono risultati positivi al gene PVL, cioè l�1.3%; mentre dei 100 ceppi di Staphylococcus aureus MRSA di origine comunitaria sono risultati positivi al gene PVL 11 ceppi, ovvero l�11%. Questi dati dimostrano che non tutti gli Staphylococcus aureus MRSA di origine comunitaria hanno il gene Panton-Valentine leucocidina, ma una buona parte sì, e questo va a conferma dei risultati dei nuovi studi sul gene PVL.

Campioni analizzati N° Gene PVL Pos Totale %

Ospedalieri 300 4 1.3 Comunitari 100 11 11 Totale 400

Un altro obiettivo di questo lavoro di diploma è mettere in evidenza il tipo di materiale da cui sono stati isolati gli Staphylococcus aureus MRSA. Nei campioni di origine ospedalieri tutti i ceppi positivi al gene PVL sono stati isolati da strisci ferita, in particolar modo da due strisci ascesso, uno striscio ferita profonda e uno striscio ferita di cui non è stata specificata la gravità. Nessun ceppo PVL positivo è stato isolato dai materiali espettorati ed uricult. Per quanto riguarda i ceppi batterici positivi al gene PVL di origine comunitaria, i materiali d�origine sono stati più variati, ma la maggior parte rimangono strisci ferita e più dettagliatamente i materiali sono: uno striscio orecchio, uno striscio naso, tre strisci ferita non specificati, due strisci ferita superficiali, uno striscio ferita profonda, due strisci coscia e uno striscio pus. Riassumendo, il materiale più frequente dove sono stati trovati i ceppi di Staphylococcus aureus MRSA con gene PVL positivo, indipendentemente dall�origine del materiale, sono in generale gli strisci ferita; interessante è però notare la gravità di alcuni materiali come gli strisci ascesso e pus. Questa osservazione fa riferimento alla sinergia tra la tossina prodotta dal gene Panton-Valentine leucocidina e la tossina γ-hemolisina, che rendono l�attacco batterico più aggressivo. Per esaminare in modo più approfondito i dati di questa ricerca sarebbe stato interessante conoscere la storia clinica del paziente (come si è procurato la ferita?, da quanto dura l�infezione?, è peggiorata col tempo?...).

Tipo di materiale Totale ceppi PVL Pos Strisci ferita 9 Strisci ascesso 2 Striscio pus 1 Striscio orecchio 1 Striscio naso 1

Figura 8 Riassunto dei dati dei ceppi amplificati.

Figura 9 Riassunto dei materiali con ceppi PVL positivi

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Un altro aspetto dei dati da evidenziare, è che la fascia d�età dei pazienti a cui sono stati isolati gli Staphylococcus aureus MRSA con il gene PVL. È interessante notare come tutte le classi d�età vengano colpite, ma soprattutto i bambini e gli adulti come descritto da alcuni studi [10].

Classe d'età dove sono stati riscontrati i ceppi PVL positivi

1940

1950

1960

1970

1980 1990

2000

0

1

2

3

4

5

Classe d'età

Qua

ntità

Purtroppo anche in questo caso sarebbe stato interessante avere più informazioni cliniche del paziente riguardante il suo stato di salute, questo ci permetterebbe di capire il grado di aggressività del battere, cioè se il peggioramento dell�infezione si è sviluppato su un individuo sano o gia indebolito per altri motivi. Un'altra osservazione è che nella collezione di ceppi analizzati dell�Istituto Cantonale di Microbiologia non sono stati riscontrati ceppi di Staphylococcus aureus PVL positivi prima del 1999, il che dimostrerebbe la novità del problema.

ANNO N° CEPPI ANALIZZATI

1997 7 1998 16 1999 27 2000 36 2001 50 2002 64 2003 60 2004 68 2005 64 2006 8

Numero di ceppi PVL positivi per ogni anno

1997 19981999

2000

2001

20022003 2004

2005

2006012345678

Anno

Qua

ntità

Figura 10 Rappresentazione grafica della quantità dei ceppi PVL positivi nelle varie classi d�età.

Figura 11 Il grafico sulla sinistra mostra come sono stati divisi per anno i 400 ceppi di Staph. aureus MRSA analizzati. Il grafico a destra rappresenta la quantità di ceppi con il gene PVL positivi riscontrati per ogni ano.

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CONCLUSIONI Riassumendo le conclusioni principali posso dire che il gene Panton-Valentine leucocidina è riscontrato in modo maggiore nei ceppi di Staphylococcus aureus MRSA di origine comunitaria (11%), e soprattutto in materiali come strisci ferita di varia gravità, strisci ascesso e pus. Questi tipi di materiali mettono in evidenza l�aggressività del battere che tende a peggiorare l�infezione. Confrontando le date di nascita dei pazienti, risultano interessate tutte le classi d�età, ma in particolar modo, i bambini e gli adulti. Inoltre, non sono stati riscontrati ceppi PVL positivi prima del 1999, il che dimostra la novità del problema. In conclusione credo di aver raggiunto tutti gli obiettivi iniziali, sia quelli del lavoro che quelli personali. Per quel che riguarda una possibile continuità di questo lavoro, credo che sarebbe interessante poter fare una ricerca del gene PVL su tutta la collezione dell�Istituto e fare la tipizzazione di ogni ceppo di Staphylococcus aureus MRSA con il gene Panton-Valentine leucocidina positivo, per essere in grado di determinare se si tratta di un clone oppure se sono ceppi differenti. Come riportato dalla letteratura anche ceppi di Staphylococcus aureus sensibili alla meticillina (MSSA) possono produrre la tossina PVL. I ceppi MSSA provenienti da pazienti con ferite che presentano delle complicazioni dovrebbero essere testati per la presenza del gene PVL. Purtroppo l�Istituto di microbiologia conserva i ceppi MSSA solo se provenienti da materiali considerati sterili e perciò uno studio retrospettivo non è possibile. In più credo che sarebbe interessante estendere la ricerca del gene Panton-Valentine leucocidina per ogni ceppo di Staphylococcus aureus MRSA isolato dalla routine per fare un monitoraggio costante, questo permetterebbe una visione della situazione in Ticino.

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BIBLIOGRAFIA

1. Fritz H.Kayser � Kurt A.Bienz � Johannes Eckert � Jean Lindenmann, Handboock di Microbiologia Medica (Immunologia, Batteriologia, Micologia, Virologia, Parassitologia), Mediserve 1996

2. Microbiologia, Atlanti scientifici Gunti, Giunti 1999

3. D:\LDD SSMT\Publicazioni\Loyola Univ_ Health Univ_ Health Sys- Microbiology

& Immunology GRAM STAIN TECHNIQUE.htm

4. Manuale di Batteriologia clinica. Dalla teoria alla pratica in laboratorio, Rossetti Roberto, Firenze University Press 2005

5. Dispense varie dell�Istituto Cantonale di Microbiologia, Bellinzona

6. Dispense scolastiche del corso di Batteriologia medica 2003-2004 tenuto da Claudia

Pelli

7. Eurosurveillance, www.eurosurveillance.org/em/v11n01/1101-226.asp, 30.01.2006

8. Henry F. Chambers, Community-Associated MRSA- Resistance and Virulence Converge, N ENGL J MED 2005; 352: 1485-1487

9. D. Johnsson, P. Mölling, K. Stalin and B. Söderquist, Detection of Panton-Valentine Leukocidin gene in Staphylococcus aureus by LightCycler PCR: clinical and epidemiological aspects, European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 2004

10. Vandenesch F, Naimi T, Enright MC, Lina G, Nimmo G, Hefferman H e al.

Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus carryng the Panton-Valentine leukocidin genes: worldwide emergence. Emerg Infect Dis.2003 Aug ; 9(8):978-84

11. Blanca M.Fernandez Rodriguez, LightCycler Roche Diagnostics, ricerca scolastica

di chimica clinica, 2005/2006 12. https://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/lightcycler/system.jsp 13. Grafici LightCycler 2.0 della ditta Roche Diagnostics

14. Foto scattata da Claudia Ardia

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RINGRAZIAMENTI In primo luogo i miei ringraziamenti vanno al Dr. Raffaele Peduzzi, direttore dell�Istituto Cantonale di Microbiologia, che mi ha permesso di svolgere questo lavoro di diploma presso il suo Istituto e mi ha concesso il materiale per eseguirlo. In particolare vorrei ringraziare la mia responsabile D.ssa Gladys Martinetti Lucchini e il team della batteriologia e della sierologia per la loro grande disponibilità e pazienza. Vorrei ringraziare anche la D.ssa Valeria Gaia che ha conservato i ceppi più vecchi di Staphylococcus aureus MRSA, che ho potuto utilizzare per questo lavoro di diploma. Inoltre ringrazio il mio docente di metodologia, nonché direttore ad interim, Andrea Boffini per i consigli e il supporto morale di questi anni tre anni ma soprattutto in quest�ultimo. Infine ringrazio le docenti Daniela Marcacci, Sonia Marci e Susan Gilbert per l�aiuto e interessamento al mio lavoro.

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ALLEGATI

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METODICA: ISOLAZIONE DEL DNA PER IL CONTROLLO POSITIVO (QIAamp® DNA Mini Kit; Handbook September 2001)

• Accendere il termoblocco a 56°C

• Protocollo: 1. Preparare un eppendorf con 300-400 µl di H2O PCR Grade 2. Prendere materiale batterico a sufficienza per creare una sospensione abbastanza torbida (ma

non troppo) 3. Pipettare 20 µl di Proteinase K in un vial (eppendorf) da 1.5 ml 4. Aggiungere 200 µl di sospensione batterica 5. Aggiungere 200 µl di AL Buffer 6. Vortexare 15� e centrifugare brevemente (short) 7. Incubare 10� a 56°C 8. Incubare 10� a 95°C 9. Centrifugare brevemente 10. Aggiungere 200 µl di etanolo (96-100%) 11. Vortexare 15� e centrifugare brevemente 12. Pipettare tutto in una colonnina Qiagen 13. Centrifugare 1� a 8�000 rpm 14. Collocare la colonnina in un nuovo tube e pipettare 500 µl AW1 15. Centrifugare 1� a 8�000 rpm 16. Collocare la colonnina in un nuovo tube e pipettare 500 µl AW2 17. Centrifugare 3� a 14'000 rpm 18. Collocare la colonnina in un nuovo tube e centrifugare 1� a 14'000 rpm 19. Collocare la colonnina in un nuovo vial da 1.5 ml e pipettare 80 µl di Buffer AE 20. Incubare 5� a temperatura ambiente e centrifugare 1� a 8'000 rpm

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MATERIALE: MRSA-SCREEN

Kit: MRSA-Screen

Ditta: DENKA SEIKEN CO., LTD 3-4-2 Nihonbashikayaba-cho, Chuo-ku, Tokyo, Japan

Ref: 230782

Lotto: 125051 Exp: 05.2006

Lotto: 230782 Exp: 11.2006

Lotto: 335111 Exp: 11.2006 Conservazione del Kit: in frigorifero tra 2-8°C.

MATERIALE: bioDiscs CEFOXITINA Kit: Dischetti di Cefoxitina (Fox) 30 µg

Ditta: bioMérieux Suisse s.a 51, avenue Blanc 1211 Genève 2

Ref: 54 152

Lotto: 794891201 Exp: 30.09.2007

Lotto: 79528801 Exp: 30.112007

Lotto: 798381901 Exp: 30.11.2007 Conservazione del Kit: in frigorifero tra 2-8°C.

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MATERIALE: ESTRAZIONE DNA

Kit: IstaGene� Matrix

Ditta: BIO-RAD-Laboratoires AG Nemzlingerweg 2 4153 Reinach

Ref: 732-6030

Lotto: 310000044 Exp: 21.11.2007

Lotto: 310000264 Exp: 01.03.2008

Conservazione del Kit: in frigorifero tra 2-8°C.

MATERIALE: ENTRAZIONE DEL DNA PER IL CONTROLLO POSITIVO

Kit: QIAamp® DNA Mini Kit (250) Ditta: QIAGEN AG Auf dem Wolf 39 CH-4052 Basel

Ref: 51306

Lotto: 124102770 Conservazione Kit: 15-25°C

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MATERIALE: MASTERMIX PER PCR

Kit: LightCycler® FastStart DNA Master SYBR Green Ι

Ditta: Roche Diagnostics GmbH

Mannheim, Germany 480 reaction

Ref: 12 239 264 001

Lotto: 11969327 Exp: 10.2006

Lotto: 11748430 Exp: 11.2006

Conservazione del Kit integro: in congelatore tra i -15°C e i -25°C Conservazione dei componenti aperti del Kit: H2O PCR Grade: in frigorifero tra 2-8°C MasterMix: in frigorifero tra 2-8°C per un massimo di 2 settimane. MgCl2: in frigorifero tra 2-8°C

MATERILE: PRIMERS Ditta: Microsynth GmbH 9436 Balgach Ref PV 1: 413735 Ref PV 2: 413736 Stabilità: a -20°C fino a 2 anni. Concentrazione iniziale dei Primer ST PV1/ ST PV2: 100 uM Concentrazione d’utilizzo dei Primer ST PV1/ ST PV2: 10 uM

Conservazione Primer ST PV1/ ST PV2: 100 uM: tenere sempre in congelatore tra i -15°C e i -25°C 10 uM: in frigorifero a 4°C

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MATERIALE: UNG Ditta: Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Germany

Concentrazione UNG: 1 U/µl Conservazione UNG: tenere sempre in congelatore tra i -15°C e i -25°C