Meccanismi di tossicità

Meccanismi Meccanismi

specifici non specifici

Tossine animali Composti organici Composti

e vegetali di sintesi inorganici

Farmaci

Meccanismi specifici

• Interazione selettiva con specifiche proteine (enzimi, canali ionici, trasportatori ecc.) danneggiamento di funzioni cellulari specifiche tossicità cellulare e/o d’organo.

• In genere legame non covalente. • Razionale biologico?: selezionate sostanze non

tossiche per l’organismo che le produce; a scopo difensivo, l’effetto tossico deve essere intenso e manifestarsi a breve termine.

Meccanismi non specifici

1. La sostanza o un suo metabolita reattivo (es.: radicale libero, elettrofilo), reagiscono in modo aspecifico con diversi componenti cellulari (proteine, lipidi, acidi nucleici).

• Si formano o si rompono legami covalenti (formazione di addotti; ossidazioni; sottrazione di atomi).

• Ciò causa alterato funzionamento o distruzione dei componenti cellulari colpiti tossicità cellulare tossicità di organo/sistema.

• In genere, non è chiaro quali dei numerosi siti di attacco cellulare siano responsabili dell’effetto tossico.

• Questo tipo di meccanismo è dovuti quasi sempre alla formazione di metaboliti reattivi e non alla sostanza tal quale.

• Perché?

2. Alcune sostanze modificano la composizione dei fluidi biologici:

• pH (acidi e basi);

• composizione ionica (sali, chelanti);

• cofattori enzimatici (deplezione, malassorbimento)

• concentrazione di metaboliti intermedi (stimolazione o inibizione di vie metaboliche; es.: porfiria, steatosi)

Queste alterazioni causano tossicità cellulare e/o d’organo.

• N.B.: oltre a tossine che agiscono in modo selettivo, i vegetali contengono anche molti composti che danno tossicità con meccanismo non specifico. Molti farmaci e alcuni altri composti organici di sintesi danno tossicità con meccanismo specifico.

Tipi di tossicità

• Tossicità funzionale: alterazioni delle funzioni di un sistema (nervoso, cardiovascolare, endocrino) possibile danno d’organo.

• Citotossicità: alterazione irreversibile di proteine (enzimi, canali ionici ecc.) o membrane (lipidi); disregolazione del metabolismo necrosi, apoptosi tossicità tissutale e d’organo o sistema (fegato, rene, SNC ecc.).

• Genotossicità: alterazione del DNA mutazioni, alterazioni cromosomiche cancerogenesi, malattie congenite.

• Reazioni allergiche: allergeni, apteni, modificatori degli antigeni cellulari risposta immunitaria.

1. Alterazione delle normali funzioni cellulari senza danno cellulare primario diretto (tossicità ‘funzionale’) tossicità d’organo o sistema (tossicità cellulare secondaria)

Esempi:

• Una sostanza che provochi vasodilatazione (es., alfa1-bloccante, agonista istaminergico) non causa danni diretti ai vasi ma provoca ipotensione e riduzione del flusso ematico danni cerebrali, renali ecc

Una sostanza che causa contrazione della muscolatura vasale (es. agonista adrenergico) non danneggia i vasi ma causa

tossicità cardiaca, cerebrale, renale.

• Una sostanza che stimoli il rilascio di insulina dalle cellule pancreatiche (senza danneggiarle) causa

ipoglicemia e tossicità a carico del sistema nervoso centrale (danno neuronale indiretto)

tossicità riproduttiva senza causare danno diretto alle cellule dell’apparato riproduttivo

•Una sostanza antagonista degli ormoni sessuali può causare

2. Danno cellulare (citotossicità).• L’alterato funzionamento o la distruzione della

macromolecola bersaglio provoca una danno cellulare

• L’entità di tale danno dipende da: importanza della funzione del componente

cellulare colpito capacità di riparazione da parte della cellula

(rimozione dei componenti danneggiati e loro sostituzione )

• Se il danno è irreversibile e/o esteso e/o coinvolge componenti cellulari essenziali, si ha la morte cellulare (necrosi).

• Nella maggior parte dei tessuti, le cellule morte possono essere sostituite da cellule dello stesso tipo (divisione cellulare) riparazione totale del danno. N.B.: i neuroni non possono replicarsi.

• Se l’area necrotica è estesa, si ha infiammazione e formazione di tessuti connettivi di riparazione (tessuti cicatriziali) riparazione parziale del danno (la funzionalità dell’organo è diminuita o alterata).

citotossicitàcitotossicità

• Se l’insulto cellulare non è ‘grave’, si può avere alterazione del metabolismo della cellula senza morte cellulare.

• In questi casi si possono avere alterazioni di:

dimensioni cellulari (atrofia o ipertrofia)

proliferazione e differenziazione cellulare (iperplasia, metaplasia)

accumulo di componenti cellulari (es. steatosi epatica)

citotossicitàcitotossicità

La morte cellulare può avvenire per necrosi o per apoptosi

citotossicitàcitotossicità

  

  Necrosis Apoptosis

Stimuli Pathologic (hypoxia, toxins,etc.). Consequence of irreversible cell injury. Think of necrosis as "cell homicide".

A physiologic, genetically regulated process. Occasionally activated by pathologic stimuli. Think of apoptosis as "cell suicide".

Histology - Typically large numbers of cells affected - Cell swelling. - Cellular acidosis. - Organelle disruption. - Loss of membrane integrity. - Coagulation or liquefaction of cell proteins.

- Usually only a few cells affected. - Cell shrinkage due to hydrolysis and cross-linking of structural proteins within the cytoplasm and nucleus. - Organelles remain normal.

- Cell breaks down into membrane-bound fragments (apoptotic bodies) which are taken up by neighboring cells.

DNA Breakdown Random, diffuse fragmentation and dissolution of the nucleus.

Orderly nuclear condensation and fragmentation.

Tissue Reaction Inflammation with secondary injury to surrounding normal tissues.

No Inflammation or secondary tissue injury.

•

                                                          

        

citotossicitàcitotossicità

Siti di attacco cellulare

1. Membrane: • Lipidi: perossidazione• Proteine: enzimi, canali, pompe, trasportatori:

alterazione della funzionalità

citotossicitàcitotossicità

Perossidazione lipidica

• Avviene ad opera di radicali (liberi): meccanismo non specifico

• Dato che i radicali hanno molti altri punti bersagli cellulari (proteine, DNA), il suo ruolo nel danno cellulare in molti casi non è ben definito (causa o effetto?)

citotossicità: danno alle membrane

citotossicità: danno alle membrane

La perossidazione porta alla distruzione dei lipidi alterazione della struttura della membrana alterazioni della funzionalità. I lipidi ossidati possono a loro volta ossidare le proteine di membrana. La formazione di radicali può danneggiare strutture distanti dal sito iniziale d’attacco.

•Nella perossidazione lipidica si formano prodotti di degradazione;

•questi sono utilizzati per misurare il grado di perossidazione; in genere si misura la formazione della malonildialdeide (dialdeide malonica)

CCl4

Oxidative stress markers Mean renal MDA (malondialdehyde) and GSH-Px (glutathione peroxidase) levels in the control, CCl4 and CCl4+INF groups

GSH-Px(u/mg

protein)

MDA(nmol/mg protein)

Control 45.4±5.9 4.15±0.5

CCl4 34.5±3.1* 5.55±0.7*

CCl4+Interferon 46.5±6.4** 4.27±0.3**

*p<0.01 vs. control, **p>0.05 vs. control.

Esempio; valutazione dell’effetto ossidativo in ratti trattati con CCl4 (s.c.) per 7 settimane

• La cellula ha numerosi sistemi redox, necessari al corretto metabolismo (GSH/GSSG, NAD/NADH, NADP/NADPH, piruvato/lattato ecc.).

• L’attività di molte proteine (enzimi, fattori di trascrizione ecc.) è regolata dallo stato redox della cellula.

Sbilanciamento dei sistemi redox cellulari

citotossicitàcitotossicità

Regolazione dell’attività di una monoossigenasi flavinica da parte dello stato redox (GSH/GSSG)

Figure 1. Diagram of the NF-kB activation pathway indicating the steps where there is evidence for direct modulation by reactive oxygen species (ROS)

• La diminuzione di GSH comporta, tra l’altro, una diminuita protezione nei confronti dell’ossidazione dei tioli proteici alterazioni strutturali e funzionali.

• La detossificazione di ossidanti e radicali comporta un consumo di equivalenti riducenti ed un conseguente sbilanciamento dei sistemi redox alterazioni del metabolismo cellulare.

• L’alterazione dei sistemi redox può anche causare effetti tossici indirettamente.

• Es.: la detossificazione di H2O2 da parte della glutatione perossidasi porta alla formazione di glutatione ossidato (GSSG); la rigenerazione di glutatione ridotto ad opera della glutatione reduttasi comporta il consumo di NADPH alterazione del rapporto NAPD/NADPH alterazione di molte funzioni cellulari (es. efflusso di Ca++ dai mitocondri).

citotossicitàcitotossicità

• Anche lo sbilanciamento verso lo stato ridotto altera il metabolismo.

• Ad esempio, l’etanolo viene ossidato in due stadi ad acetato:

etanolo + NAD acetaldeide + NADH acetaldeide + NAD acetato + NADH• Negli alcolisti si ha quindi una sovrapproduzione

di NADH, che favorisce la riduzione di piruvato a lattato e di ossalacetato a malato, diminuendo così la gluconeogenesi.

• Il risultato finale è una condizione di ipoglicemia.

citotossicitàcitotossicità

Disregolazione metabolica. Principali meccanismi

• Inibizione del metabolismo energetico (produzione di ATP)

• Aumento del Ca++ libero intracellulare

• Alterazione della sintesi di macromolecole (acidi nucleici, proteine)

citotossicitàcitotossicità

• Inibizione della produzione di ATP

• Può avvenire per blocco della glicolisi (es. iodoacetato) o della respirazione mitocondriale (es., cianuro, disaccoppianti)

citotossicitàcitotossicità

Il gradiente di H+ viene utilizzato per generare ATP.

I disaccoppianti provocano un trasporto di H+ passivo attraverso la membrana inibizione della sintesi di ATP.

CN- si lega al Fe+3 del gruppo eme blocco del flusso degli elettroni

• Inibizione totale necrosi cellulare

• Inibizione parziale e/o temporanea riduzione del metabolismo, ridotta capacità rigenerativa, aumentata sensibilità a stimoli tossici

citotossicitàcitotossicità

• Aumento del Ca++ intracellulare• La concentrazione di Ca++ intracellulare libero è

strettamente regolata poiché Ca++ è necessario per l’attività di molti enzimi (proteasi, fosfolipasi, endonucleasi ecc.) e regola molte attività cellulari

• Sostanze che danneggiano i sistemi responsabili del mantenimento della concentrazione di Ca++ provocano un suo aumento con attivazione di molti enzimi litici e conseguente morte cellulare (necrosi o apoptosi).

citotossicitàcitotossicità

proteasi Ca-dipendenti

proteasi lisosomiali

Sinergismo in tossicologia

Molto importante per esposizione contemporanea a molte sostanze diverse.

L’esposizione ad una sostanza, in modalità non tossiche, determina un aumento della tossicità di una seconda sostanza

Acetaminophen Overdose

• Dose related toxicity in low risk patient:• < 125 mg/kg (8.75 g in 70 kg person) - rare liver

toxicity• >250 mg/kg (17.5 g) considered "minimum

hepatotoxic dose" • > 350 mg/kg (24.5 g) -- invariably severe liver

damage • High risk patient:• In chronic ethanol abusers, hepatic necrosis has

been reported with short-term use of paracetamol dosages of 2.5 g/day. Fatalities have occurred.

Reazioni allergiche e autoimmuni indotte da metaboliti reattivi

• Diverse sostanze possono modulare in modo aspecifico il sistema immunitario, determinando immunosoppressione (più comune) o immunostimolazione generalizzata (più raro, es.; silicosi, esaclorobenzene)

• Molte sostanze si comportano da allergeni o apteni, inducendo una risposta immunitaria reazioni allergiche (Tipo I-IV).

• I metaboliti reattivi di alcune sostanze si legano covalentemente ad alcune proteine, modificandone le caratteristiche immunitarie malattia autoimmunitaria (es. epatite da alotano).

Formazione di composti tossici in vivo. Meccanismi di detossificazione

• Formazione di radicali.• Per ossidazione di fenoli, idrochinoni, amine,

idrazine. tioli ecc. da parte di CYP450 o perossidasi: R R.+ + 1e si forma una radicale cationico, che può sottrarre un atomo di idrogeno a lipidi ed altre molecole (proteine, DNA, glutatione ecc.).

• Per scissione omolitica di un legame C-H; es: CCl4 subisce dealogenazione riduttiva ad opera di CYP450; si forma il radicale triclorometilico CCl3

.

• Per riduzione ad opera della CYP450 reduttasi (e altre reduttasi): R + 1e R.- (radicale anionico); es.: doxorubicina, nitrofurantoina.

• I radicali anionici cedono il loro elettrone spaiato all’O2, formando cosi l’anione superossido:

R.- + O2 R + O2 .-

L’anione superossido viene trasformato dalla superossido dismutasi (SOD) in perossido di idrogeno (H2O2);

H2O2 (un ossidante) viene detossificato dalla catalasi:

H2O2 H2O + ½ O2

Tuttavia, la formazione di anione superossido e/o di perossido di idrogeno può superare le capacità detossificanti di SOD e catalasi.

H2O2 può ricevere un elettrone da ioni metallici (Fe++, Cr(V) ecc.), formando il radicale ossidrile (reazione di Fenton):

H2O2 OH. + OH-

Il radicale OH. è estremamente reattivo e non può essere inattivato dagli antiossidanti

Anione superossido, perossido di idrogeno e radicale ossidrile vengono definiti ROS (Reactive Oxygen Species)

• I radicali possono danneggiare anche proteine (principalmente ossidazione dei tioli) e DNA

•I ROS sono prodotti continuamente nel nostro organismo. Ad esempio la reazione:

Hypoxanthine + O2 <=> Xanthine + H2O2

(catalizzata dalla xantina ossidasi) genera perossido di idrogeno

•I ROS prodotti dalle cellule fagocitarie svolgono un ruolo nella difesa dagli agenti infettivi.

Protezione enzimatica

H2O2 + 2 GSH H2O + GSSG

Glutatione ridotto Glutatione ossidato

Glutatione perossidasi

Meccanismi di detossificazione dei ROS

Altri meccanismi di detossificazione dei radicali

Il glutatione ridotto (GSH) reagisce con i radicali, cedendo un elettrone; si forma così il radicale tiilico GS. (relativamente stabile); l’unione di 2 radicali GS. porta alla formazione di glutatione ossidato (GSSG), che viene poi ridotto dalla glutatione reduttasi (NADPH-dipendente)

Antiossidanti

• Vitamina E (alfa-tocoferolo), vitamina C (acido ascorbico) ed altri antiossidanti (es.: ß-carotene) reagiscono con i radicali liberi, cedendo un elettrone e trasformandosi in radicali ‘stabili’ o detossificati dai sistemi enzimatici.

La reazione del radicale perossilico con la Vitamina E è molto più veloce della reazione con un altro lipide (109 vs 106

nmoli/sec)

  Membrane lipid peroxidation. (a) Initiation of the peroxidation process by an oxidizing radical X , by abstraction of a hydrogen atom, thereby forming a pentadienyl radical. (b) Oxygenation to form a peroxyl radical and a conjugated diene. (c) Peroxyl radical moiety partitions to the water-membrane interface where it is poised for repair by tocopherol. (d) Peroxyl radical is converted to a lipid hydroperoxide, and the resulting tocopherol radical can be repaired by ascorbate. (e) Tocopherol has been recycled by ascorbate; the resulting ascorbate radical can be recycled by enzyme systems. The enzymes phospholipase A2 (PLA2), phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PH-GPx), glutathione peroxidase (GPx) and fatty acyl-coenzyme A (FA-CoA) cooperate to detoxify and repair the oxidized fatty acid chain of the phospholipid. (from Buettner 1993).

NEJM, Vol. 334:1150-1155      May 2, 1996      Number 18  

Effects of a Combination of Beta Carotene and Vitamin A on Lung Cancer and Cardiovascular Disease

Gilbert S. Omenn, M.D., Ph.D., Gary E. Goodman, M.D., M.S., Mark D. Thornquist, Ph.D., John Balmes, M.D., Mark R. Cullen, M.D., Andrew Glass, M.D., James P. Keogh, M.D., Frank L. Meyskens, M.D., Barbara Valanis, Dr.P.H., James H.

Williams, M.D., Scott Barnhart, M.D., M.P.H., and Samuel Hammar, M.D.

E’ possibile aumentare la capacità detossificante tramite la somministrazione di antiossidanti?

Methods We conducted a multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled primary prevention trial — the Beta-Carotene and Retinol Efficacy Trial — involving a total of 18,314 smokers, former smokers, and workers exposed to asbestos. The effects of a combination of 30 mg of beta carotene per day and 25,000 IU of retinol (vitamin A) in the form of retinyl palmitate per day on the primary end point, the incidence of lung cancer, were compared with those of placebo.

http://content.nejm.org/content/vol334/issue18/images/large/02t1.jpeg

Formazione di elettrofili

• Si formano direttamente per ossidazione, principalmente da parte di CYP450 (es. epossidi di alcheni o aromatici), o per ossidazione e successivo riarrangiamento (es. N-ossidazione di amine).

Attivazione metabolica: formazione di metaboliti reattivi da parte del CYP450

• L’ossidazione da parte del CYP450 può portare alla formazione di composti elettrofili o radicalici (o loro precursori).

• Epossidi• Chinoni, idrochinoni, chinonimmine• N-idrossi ammine• Radicali alchilici alogenati

• N.B. non tutti i composti di queste classi sono tossici; la loro tossicità dipende dalla loro reattività chimica, che dipende dalla struttura dell’intera molecola.

• N.B. in diversi casi (es. aflatossina B1), il CYP450 catalizza sia l’attivazione sia la detossificazione

• Gli elettrofili ed i radicali cationici si legano covalentemente ai numerosi gruppi nucleofili presenti in macromolecole, proteine ed acidi nucleici.

• La reazione con le proteine può portare ad alterazioni della loro funzionalità (es. inibizione enzimatica) e delle loro caratteristiche antigeniche (patologie autoimmuni da xenobiotici).

• La reazione con il DNA può portare a mutazioni cancerogenesi.

• La reattività degli elettrofili verso i nucleofili è determinata dalla loro natura: elettrofili soft reagiscono preferenzialmente con nucleofi soft, elettrofili hard con nucleofili hard

•Se l’ammina viene N-idrossilata (da CYP450) prima di essere acetilata, la NAT può, in questo caso, catalizzare una O-acetilazione.•Il gruppo acetossi che si forma è un buon ‘gruppo uscente’.•Si può formare uno ione nitrenio, elettrofilo altamente reattivo.

Meccanismi di detossificazione degli elettrofili

Coniugazione con glutatione. Il gruppo tiolico del glutatione è nucleofilo. La reazione può essere spontanea o catalizzata dalla glutatione-S-transferasi (enzima di fase II).

Detossificazione enzimatica: epossido idrolasi; riduzione enzimatica (es. chinoni, DT-diaforasi); ossidazione enzimatica (es. aldeidi, aldeide deidrogenasi)

• ‘Fallimento’ dei meccanismi di detossificazione• Saturazione del potere detossificante: saturazione

enzimatica, consumo dei coenzimi, deplezione delle molecole protettive (glutatione, es. paracetamolo)

• Reversibilità delle reazioni di coniugazione (es. naftilammine; i glucuronidi sono idrolizzati nel rene rilascio del composto ossidato formazione di metaboliti elettrofili tossici)

• In alcune reazioni di detossificazione si possono

formare composti tossici (es. GS.)

Meccanismi di riparazione

• Riparazione molecolare:

• proteine: degradazione e neosintesi; riparazione enzimatica di specifici gruppi (es. riduzione di ponti disolfuro)

• lipidi: idrolisi + riduzione dell’acido grasso perossidato (ossidazione del glutatione); ri-acilazione

Riparazione del DNA

• Il DNA subisce continuamente danni di vario tipo• Esistono diversi meccanismi di riparazione, che sono

essenziali al mantenimento dell’integrità del DNA• I meccanismi di riparazione richiedono tempo• Il danno al DNA determina, tra l’altro, un arresto della

progressione del ciclo cellulare, in modo da consentire la riparazione del danno.

• Se il danno è troppo esteso e non può essere riparato, si può avere apoptosi

• Se il danno non viene riparato e la cellula non va incontro ad apoptosi, il danno del filamento di DNA induce una mutazione nel filamento figlio se la cellula si replica i livelli di mutazione aumentano con la velocità di divisione cellulare

Types and rates of mutation

Type Mechanism Frequency________ Genome chromosome 10-2 per cell division mutation misaggregation

(e.g., aneuploidy)

Chromosome chromosome 6 X 10-4 per cell division mutation rearrangement

(e.g., translocation)

Gene base pair mutation 10-10 per base pair per mutation (e.g., point mutation, cell division or

or small deletion or 10-5 - 10-6 per locus per insertion generation

Mutation

Summary of DNA lesions

Missing base Acid and heat depurination (~104 purinesper day per cell in humans)

Altered base Ionizing radiation; alkylating agents

Incorrect base Spontaneous deaminationscytosine to uraciladenine to hypoxanthine

Deletion-insertion Intercalating reagents (acridines)

Dimer formation UV irradiation

Strand breaks Ionizing radiation; chemicals (bleomycin)

Interstrand cross-links Psoralen derivatives; mitomycin C

(Tautomer formation Spontaneous and transient)

Types of base pair mutations

CATTCACCTGTACCAGTAAGTGGACATGGT

CATGCACCTGTACCAGTACGTGGACATGGT

CATCCACCTGTACCAGTAGGTGGACATGGT

transition (T-A to C-G) transversion (T-A to G-C)

CATCACCTGTACCAGTAGTGGACATGGT

deletionCATGTCACCTGTACCAGTACAGTGGACATGGT

insertion

base pair substitutions transition: pyrimidine to pyrimidine transversion: pyrimidine to purine

normal sequence

deletions and insertions can involve one or more base pairs

Spontaneous mutations can be caused by tautomers

Tautomeric forms of the DNA bases

Adenine

Cytosine

AMINO IMINO

Guanine

Thymine

KETO ENOL

Tautomeric forms of the DNA bases

Mutation caused by tautomer of cytosine

Cytosine

Cytosine

Guanine

Adenine

• cytosine mispairs with adenine resulting in a transition mutation

Normal tautomeric form

Rare imino tautomeric form

Mutation is perpetuated by replication

• replication of C-G should give daughter strands each with C-G

• tautomer formation C during replication will result in mispairing and insertion of an improper A in one of the daughter strands

AC• which could result in a C-G to T-A transition mutation in the next round of replication, or if improperly repaired

C G C G and C G

C G C A and C G

T A

Chemical mutagens

Deamination by nitrous acid

Derivation by hydroxylamine

The formation of a quarternary nitrogen destabilizes thedeoxyriboside bond and the base is released from deoxyribose

Alkylation by dimethyl sulfate causes depurination

Attack by oxygen radicals

Thymine dimer formation by UV light

DNA damage, repair mechanisms and consequences. a, Common DNA damaging agents (top); examples of DNA lesions induced by these agents (middle); and most relevant DNA repair mechanism responsible for the removal of the lesions (bottom). b, Acute effects of DNA damage on cell-cycle progression, leading to transient arrest in the G1, S, G2 and M phases (top), and on DNA metabolism (middle). Long-term consequences of DNA injury (bottom) include permanent changes in the DNA sequence (point mutations affecting single genes or chromosome aberrations which may involve multiple genes) and their biological effects. Abbreviations: cis-Pt and MMC, cisplatin and mitomycin C, respectively (both DNA-crosslinking agents); (6–4)PP and CPD, 6–4 photoproduct and cyclobutane pyrimidine dimer, respectively (both induced by UV light); BER and NER, base- and nucleotide-excision repair, respectively; HR, homologous recombination; EJ, end joining.

Excision repair (base or nucleotide)

ATGCUGCATTGATAGTACGGCGTAACTATC

thymine dimer

AT AGTACGGCGTAACTATC

ATGCCGCATTGATAGTACGGCGTAACTATC

ATGCCGCATTGATAGTACGGCGTAACTATC

excinuclease

DNA polymerase

DNA ligase

(~30 nucleotides)

ATGCUGCATTGATACGGCGTAACT

ATGC GCATTGATACGGCGTAACT

AT GCATTGATACGGCGTAACT

deamination

ATGCCGCATTGATACGGCGTAACT

ATGCCGCATTGATACGGCGTAACT

uracil DNA glycosylase

repair nucleases

DNA polymerase

DNA ligase

Base excision repair Nucleotide excision repair

Mechanism for base-excision repair

Homologous recombination: riparazione di rotture della doppia elica

Identification of a homologous sequence.

After identification of the identical sister chromatid sequence, the intact double-stranded copy is used as a template to properly heal the broken ends by DNA synthesis (III).

Finally, the so-called Holliday-junctions are resolved by resolvases

the 5'–3' exonuclease activity exposes both 3' ends.

Heterodimers of hMSH2/6 recognize single-base or insertion/deletion loops

Heterodimeric complexes interact with MSH complexes and replication factors.

Excision of the new strand past the mismatch and resynthesis

Mismatch (post-replication) repair

N.B. la riparazione post-replicativa è error prone

Mechanisms of Repair

•Mutations that occur spontaneously any time are repaired byexcision repair (base excision or nucleotide excision)

• Mutations that occur during DNA replication are repaired whenpossible by proofreading by the DNA polymerases

• Mutations that are not repaired by proofreading are repairedby mismatched (post-replication) repair followed byexcision repair

Difetti congeniti dei meccanismi di riparazione del DNA predispongono allo sviluppo di tumori.

Defects in DNA repair or replicationAll are associated with a high frequency of chromosome

and gene (base pair) mutations; most are also associated with a predisposition to cancer, particularly leukemia

• Xeroderma pigmentosum• caused by mutations in genes involved in nucleotide excision repair• associated with a 2000-fold increase of sunlight-induced skin cancer and with other types of cancer such as melanoma

• Ataxia telangiectasia• caused by gene that detects DNA damage• increased risk of X-ray• associated with increased breast cancer in carriers

• Fanconi anemia• increased risk of X-ray• sensitivity to sunlight

• Bloom syndrome• caused by mutations in a a DNA helicase gene• increased risk of X-ray• sensitivity to sunlight

• Cockayne syndrome• caused by a defect in transcription-linked DNA repair• sensitivity to sunlight

• Werner’s syndrome• caused by mutations in a DNA helicase gene• premature aging

DNA repair activity

Life

sp

an

1

10

100 human

elephant

cow

hamsterratmouseshrew

Correlation between DNA repair activity in fibroblast cells fromvarious mammalian species and the life span of the organism

There is a direct correlation between DNA repair enzymatic activity and the life span of organisms, suggesting

that DNA repair activity slows down cellular senescence and that cellular senescence is caused by mutations in

DNA.

Defects in DNA repair or replication can lead to a number of abnormalities.

• Se i meccanismi di riparazione del DNA falliscono e la cellula non si attivano i meccanismi dell’apoptosi, la mutazione viene fissata nelle cellule figlie.

• Se la mutazione altera la funzionalità di geni che stimolano (proto-oncogeni) o inibiscono la progressione della cellula nel ciclo cellulare (geni repressori dei tumori; p53 induce anche l’apoptosi), si ha la trasformazione neoplastica della cellula.

The role of p53 in the cell cycle

G1

S

G2M

G0

DNA synthesis

Growth and preparation forcell division

Quiescent cells

phase

phase

phase

phase

Mitosis

apoptosis (cell death)

p53UV irradiation leads

to cell cycle arrest

Normalcolon cell

Increasedcell growth

AdenomaI

AdenomaII

AdenomaIII

Carcinoma

Metastasis

Multistep carcinogenesisStages in the evolution of colon cancer

Chromosome 5q gene loss or mutation

Ras gene mutation

Chromosome 18 loss or mutationDCC tumor suppressor gene

Chromosome 17 loss or mutationp53 tumor suppressor gene

Other chromosome losses

Riparazione tissutale

• Riparazione

1. Morte delle cellule danneggiate

2. Sostituzione delle cellule morte (proliferazione) e della matrice extracellulare

Morte cellulare• Livello di esposizione all’agente necrogenico:basso apoptosi; indotta da danno a DNA, anche

indiretto, se la riparazione del DNA fallisce alto necrosi

L’apoptosi elimina le cellule danneggiate senza reazione infiammatoria; previene inoltre la trasformazione neoplastica.

Proliferazione cellulare• Sono coinvolti vari tipi cellulari• Negli organi parenchimali (fegato, rene, polmoni),

il danno necrotico induce la produzione, da parte di cellule non parenchimali (macrofagi, cellule endoteliali), di fattori che stimolano la divisione cellulare e la sintesi di matrice extracellulare.

The mammalian cell cycle

G1

S

G2M

G0

DNA synthesis and histone synthesis

Growth and preparation forcell division

Rapid growth and preparation forDNA synthesis

Quiescent cells

phase

phase

phase

phase

Mitosis

de-differenziazione

• Il grado di divisione cellulare può essere valutato dalla sintesi di DNA l’incorporazione di 3H-timidina è un indicatore di sintesi di DNA.

Riparazione tissutale e necrosi

• La necrosi di un tessuto, indotta da una sostanza citotossica, avviene quando l’entità del danno è tale da sormontare i meccanismi di riparazione:

riparazione molecolare apoptosi sostituzione delle cellule danneggiate

Ad es., il clordecone (insetticida), blocca la proliferazione cellulare in risposta a CCl4 CCl4 causa necrosi a dosi normalmente non tossiche.

Figure 2. Detection of PrP mRNA expression in rat liver tissue. Untreated ((a, c) ) and CCl4-treated ((b, d–f)) rat

livers were stained with Azan-Mallory stain ((a, b) ) and in situ hybridization for PrP mRNA expression with antisense riboprobe ((c, d, f)) and sense probe ((e)).

Effetti istologici di CCl4 nel fegato

Infiammazione• Il danno tissutale causa il rilascio di citochine

infiammatorie (TNF, IL-1) da parte dei macrofagi residenti (nel fegato le cellule di Kupffer) inizio della reazione infiammatoria.

• I mediatori dell’infiammazione aumentano il danno.

FIG. 1. GdCl3 protects against MCT/LPS-induced liver injury. LPS

(7.4 x 106 EU/kg) or saline vehicle (Veh) was administered, iv, to rats 4 h after ip administration of MCT (100 mg/kg) or saline vehicle. Rats were pretreated with 10 mg GdCl3-6H2O/kg or saline vehicle, iv,

24 h before LPS administration. TNF- concentration (A), ALT (B) and AST (C) activities, and HA concentration (D) were evaluated in plasma 18 h after MCT administration.

N.B.: GdCl3 elimina selettivamente le cellule di Kupffer

•Le citochine rilasciate da macrofagi e cellule endoteliali alterano la sintesi delle proteine epatiche:

proteine di fase acuta (positive): proteina C-reattiva, alfa2-macroglobulina, alfa1-antiproteasi ecc.; oltre a svolgere uno ruolo fisiologico (inibizione proteasi ecc.) hanno valore diagnostico.

proteine di fase acuta negative: albumina, transferrina ecc.

Fibrosi

• Danno cellulare proliferazione cellulare + produzione di matrice extracellulare, mediata principalmente da TGF-.

• La sovrapproduzione di TGF- cessa quando il danno tissutale è riparato. Se ciò non avviene, si sviluppa fibrosi.

Ratti trattati con CCl4 (s.c.) per 9 settimane

Fibrosi misurata come contenuto in idrossiprolina

Enzymatic hydroxylation of procollagen proline residues in the synthesis of collagen

The protein collagen is unusual in its widespread modification of proline to 4-hydroxyproline (also called hydroxyproline).