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Lucia Martelli Diagnostica microbiologica delle infezioni delle basse vie respiratorie Lucia Martell

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Lucia Martelli

Diagnostica microbiologica delle infezioni delle basse

vie respiratorie

Lucia Martelli

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LA DIAGNOSI MICROBIOLOGICA

• influenza la terapia

che è in funzione di

• permette di individuare cluster epidemici

• permette di individuare patologie causate da patogeni non endemici in quell'area

Infezioni basse vie respiratorie

Presenza di patogeni piu frequentemente isolati oppure di patogeni non comuni

Presenza di patogeni che mostrano

antibiotico resistenza

Presenza di patogeni per i quali le

linee guida non prevedono un

trattamento ottimale

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Perchè una corretta diagnosi eziologica è importante?

• per studiare l’andamento dell’antibiotico resistenza

• Per aumentare l’accuratezza delle raccomandazioni delle linee guida

• Per guidare i comportamenti in caso di patologie particolari come SARS, Influenza,Legionellosi patologie da bioterrorismo

Infezioni basse vie respiratorie

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La diagnosi microbiologica rende possibile una:

• Diagnosi probabile

• Diagnosi definita

Infezioni basse vie respiratorie

quadro clinico compatibile + rilevazione di un patogeno polmonare in quantità medio alta (in modo semiquantitativo)

quadro clinico tipico + agente eziologico probabile

un campione non contaminato

+ probabile patogeno che non colonizza le vie respiratorie

superiori

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nelle cap che necessitano di ricovero

per pazienti ospedalizzati

per pazienti immunocompromessi con infezioni delle basse vie

Infezioni basse vie respiratorie La diagnosi microbiologica gravità

della malattia

nelle bronchiti

nelle cap non

complicate e in assenza

di fattori di rischio

(sono sufficienti le linee

guida)

E’importante ma non sempre efficace

È limitato

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Fattori interferenti con la diagnosi microbiologica

- Adeguatezza del campione( assenza di contaminazione da parte della flora del tratto respiratorio superiore)

- Uso di test diagnostici importanti sono:

rapidi e sensibili esame microscopico

la ricerca di antigeni

tests di biologia molecolare

Infezioni basse vie respiratorie

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Correlazione tra agenti patogeni ed età

età microrganismi più probabili

Neonati(0-1 mo) Escherichia coli, Streptococcus agalactiae

lattanti (1-6 mo) Chlamydia trachomatis , RSV

bambini (6 mo-5 yr) RSV, Parainfluenza

Virusesragazzi (5-15 yr) Mycoplasma pneumoniae , Influenza Virus Tipo A

giovani adulti(16-30) Mycoplasma pneumoniae, Streptococcus pneumoniae

adulti Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae

Infezioni basse vie respiratorie

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Tipo di polmonite patogeni comuni patogeni rari

Acquisita in comunità S. pneumoniae, H. influenzae, Staphylococcus

K. pneumoniae M.catarrhalis N. meningitidis

Primaria atipica Mycoplasma pneumoniae Adenovirus, tosse non produttiva RSV, Clamydia spp. Influenza, Legionella spp., tuberculosis,

polmoniti fungine acute

Polmonite nosocomiale bacilli Gram neg(Enterobacter, legionella Klebsiella, Acinetobacter S. pneumoniae , Pseudomonas), S. aureus, batteri anaerobi

Infezioni basse vie respiratorie

Correlazione tra agenti patogeni e patologia

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Tipo di polmonite patogeni comuni patogeni rari

polmonite ematogena Staphylococcus spp., bacilli Gram negativi Streptococcus spp. polmonite in paz. batteri come nella CAP* Legionella,Listeria immunodepressi Pneumocystis carinii, Histoplasma, Cytomegalovirus, Coccidioides HSV, Nocardia sp.

Funghi opportunisti * Candida

* Mucor * Aspergillus

Polmonite anaerobi

da aspirazione Staphylococcus,

Bacilli Gram negativi aerobi

Infezioni basse vie respiratorie

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Materiale Idoneo

Diagnosi Microbiologica

Germi comuni, Legionella Micobatteri

Nocardia , miceti

+ P.carinii

Escreato

Escreato indottoBronco

Aspirato

LavaggioBroncoalveola

re

LavaggioBronchiale

Idem

Solo per Micobatteri, Legionella,P.carinii e miceti filamentosiIdoneo per tutte le ricerche

batteriologiche,virologiche fungineparassitologiche

Germi comuni,Miceti,AnaerobiMicobatteri,Legionella,Nacardia

Liquido pleurico

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Materiale Idoneo Diagnosi Microbiologica

Sangue

Urina

Siero

Batteri Gram+,Gram-Miceti

Rilevazione antigeni diLegionella, Pneumococco

Per ricerche di anticorpiricerca di antigene di Aspergillus

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La diagnosi Microbiologica

Metodi diretti es batteroscopico su materiali

es colturale respiratori

emocoltura

rilevazione di antigeni

Metodi di amplificazione genica

tecnologie microarray

Metodi indiretti tests sierologici

Infezioni basse vie respiratorie

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Esame microscopico Permette di

Infezioni basse vie respiratorie

Stabilire l'idoneità del materiale

Valutare la quantità di PMN e microrganismi

(processo infiammatorio e infezione batterica)

Fare una diagnosi presuntiva mediante il rilevamento di potenziali patogeni

può indurre ad attuare iter diagnostici diversi da quelli routinari

Metodi diretti

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Inoltre

Infezioni basse vie respiratorie

di avviare una terapia empirica verso patogeni

meno comuni e di abbandonare

terapie inappropriateDi validare i risultati dell'esame

colturaleDi valutare l'azione inibente della

terapia

antibiotica su microrganismi presenti

che non si sviluppano in coltura

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Esame colturale

Esame microscopico

Materiale Biologico Idoneo

Esame Colturale

Isolamento batteri e miceti non esigenti

Infezioni basse vie respiratorie

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Esame colturale dei materiali ottenuti con procedimenti non

invasivi

spesso non è specifico

nè sensibile

Infezioni basse vie respiratorie

• l'eventuale precedente terapia antibiotica

• l'eventuale scarsa idoneità del campione

• difficoltà di interpretazione la presenza di flora delle alte vie che può includere eventuali patogeni (falsi positivi)

o coprire il vero patogeno (falsi negativi)

Per

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Esame colturale di materiali ottenuti con procedimenti

invasivi permette

di attribuire un significato eziologico ai vari isolati se accompagnati da una valutazione numerica

Infezioni basse vie respiratorieMetodi diretti

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Esame colturaleInfezioni basse vie respiratorie

Incubazione a 37° per 24-48hIn atmosfera normale o in Co2

Semina su terreni idonei

LETTURA

IDENTIFICAZIONEANTIBIOGRAMMA(se previsto)

Metodi diretti

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EmocolturaInfezioni basse vie

respiratorie

● E' raccomandata per tutti i pazienti con grave polmonite e se positiva permette di fare diagnosi

● Il più comune isolato è S.pneumoniae

● Si ha positività nel 5-14%

Metodi diretti

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Rilevazione antigeni su materiali respiratori

si basano su

Infezioni basse vie respiratorie

Metodi diretti

● Agglutinazione al lattice

● Immunofluorescenza diretta

● EIA

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Ricerca antigeni su materiali respiratoriVantaggi

• Sono rapidi • Idonei per Virus influenzali A e B

RSV Adenovirus Virus parainfluenza 1,2,3 HCMV HSV1,HSV2

Legionella, Pneumococco

Metodi diretti

Infezioni basse vie respiratorie

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Rivelazione antigeni su urine• Tests immunocromatografici

S. pneumoniae e legionella pneumophila sier 1

Vantaggi • Rapidi• semplici• Positivi anche dopo l'inizio della terapia

Metodi diretti Infezioni basse vie respiratorie

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S.pneumoniaeAntigene (polisaccaride parete)

VantaggiSpecificità >90% < nei bambini portatori sani

Sensibilità 50-80%

Infezioni basse vie respiratorie

Svantaggi

Cross-reattività con S.oralis e S.mitis

Non distingue infezione in atto da infezione pregressa

Il valore diagnostico è maggiore se associato a emocultura

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Antigene urinario di legionella

Il test non rileva tutti i sierotipi

Vantaggi

Sensibilità 70-100%

Specificità 100%

SvantaggiPositività prolungata nel tempo

Infezioni basse vie respiratorie

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Diagnostica molecolare

Si basa

• Ricerca del DNA mediante Ricerca del DNA mediante amplificazione con metodica PCRamplificazione con metodica PCR

• Tecnologia microarrayTecnologia microarray

Infezioni basse vie respiratorie

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Diagnostica molecolare identifica un organismo in base a

sequenze geniche specifiche

• ESTRAZIONE ACIDO NUCLEICO

•AMPLIFICAZIONE CON PRIMER IDONEI A LIMITARE LA SEQUENZA GENICO SPECIFICA

•IDENTIFICAZIONE DNA AMPLIFICATO

IMMUNO CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA SU GEL DI AGAROSIOFLUORESCENZA (REALTIME)

Infezioni basse vie respiratorie

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Diagnostica MolecolareDiagnostica Molecolare

Svantaggi

• Costo elevato• Se qualitativa non indica se infezione

in atto o pregressa• Non consente di procedere alla

determinazione della sensibilità ai chemioterapici

• Richiede esperienza di metodiche molecolari

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Diagnostica MolecolareDiagnostica Molecolare• Nel nostro laboratorio vengono rilevati con

PCR • Virus respiratori Adenovirus VRS Influenza A-B HSV1-2 HCMV

• Batteri atipici Mycoplasma Legionella Chlamydia

• Miceti Aspergillo

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Microarray Rappresenta un potenziale interessante

per il laboratorio di microbiologia

• Un DNA microarray (o DNA chip) è costituito da una collezione di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una superficie solida.

Permette di• Esaminare il profilo di espressione di un gene• Di identificare un gene in una miscela di

migliaia• Sfrutta la tecnica di ibridazione inversa

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MicroarrayVantaggi• Rapido (non necessita di reazioni di

amplificazione)• E' un sistema miniaturizzato• Dotato di alta processività• Permette analisi parallele su larga scala

• Nei laboratori di ricerca è stato utilizzato per

1. Identificare funghi patogeni coinvolti nelle micosi invasive

2. Identificazioni batteriche 3. Per una rapida identificazione da bottiglie di emocolture

positive

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Metodi sierologici• Tests di immunofluorescenza • Tests di FC• Non sono utili per una diagnosi precoce• Sono importanti a scopi epidemilogici• Utili per la diagnosi di infezione dei patogeni atipici • Necessitano di due campioni uno in fase acuta ed

uno in fase di convalescenza (sieroconversione)• Permette di valutare se infezione in atto o infezione

pregressa

Infezioni basse vie respiratorie

Metodi indiretti

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Diagnostica di alcune patologie

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Polmonite da C.pneumoniae• La C.pneumoniae è responsabile

del5%-15% delle polmoniti

• Raramente è necessario il ricovero (anziani con comorbidità, associata ad altri patogeni)

• La reinfezione è comune

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Polmonite da C.pneumoniae Diagnosi microbiologica difficile• La chlamydia è difficilmente coltivabile• La sierologia è problematica e non specifica

Nelle infezioni primarie le IgM possono impiegare anche 3 settimane a manifestarsi

Le IgG 8 settimane: la negatività non esclude la malattia

Nelle reinfezione leIgM rimangono costantiLe IgG salgono rapidamente

• PCR con marchio CE e IVD Recentemente è uscita Real time PCR solo

qualitativa Viene eseguita su materiale respiratorio É specifica per la specie

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Polmonite da M.pneumoniae

Il Mycoplasma è responsabile del10%-20% delle polmoniti nei giovani adulti

Diagnosi• Esame colturale (troppo lento)• Tests sierologici Le agglut a freddo >1.64 supportano

la diagnosi ma sono poco specifiche

La reazione di FC rileva le IgM se il prelievo è precoce

• PCR con marchio CE e IVD

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Legionellosi Diagnosi di laboratorio

metodiche utilizzate:

- esame colturale *

- rilevazione dell’antigene urinario

- test di immunofluorescenza diretta *

- rilevazione di anticorpi

-ibridizzazione degli acidi nucleici *

*E’ IMPOTANTE L’IDONEITA’ DEL MATERIALE

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Esame colturale

Rappresenta il gold standard per la diagnosi

(per un risultato positivo occorrono da 3 a 5 giorni )

Materiali idonei sputo *

campioni broncoscopici

.Terreni idonei BCYE (buffered charcoal yeast

extract)

BCYE con antibiotico

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Esame colturale

Fattori che influnzano la sensibilità

• Scarsa sopravvivenza nelle secrezioni

• Produzione scarsa di secrezioni

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Esame colturale

• E’ importante per

Confermare i risultati positivi dell’antigenemia

Individuare infezioni sostenute da specie e sierogruppi diversi da sier 1

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Identificazione

Vengono valutate le seguenti caratteristicheVengono valutate le seguenti caratteristiche

Capacità di crescita su BCYE

Morfologia tipica delle colonie

Capacità di reagire con antisieri specifici fluorescenti e non

Test di ibridizzazione del DNA

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Ricerca dell’antigene urinario un metodo rapido che produce una diagnosi precoce (1 un metodo rapido che produce una diagnosi precoce (1

giorno dopo l’insorgenza dei sintomi , può permanere giorno dopo l’insorgenza dei sintomi , può permanere per mesi )per mesi )

L’atg è un componente della frazione L’atg è un componente della frazione polisaccaridicadella paretepolisaccaridicadella parete

RIARIAMetodiche EIA ( Metodiche EIA ( per più sierogruppiper più sierogruppi ) ) Immunocromatografiche

(solo per legionella p. sier 1 )

E’ un esame ritenuto sufficiente a fornire un criterio microbiologico di certezza nelle definizione di caso

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Antigene urinario

Data la sua possibile permanenza protratta nelle urine può risultare difficile la distinzione tra

• infezione acuta• fase di convalescenza• infezione pregressa

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Antigene urinario

• Test immunocromatografico ( BIOTEST )

Sensibilità 70-100 % ( dopo centrifugazione aumenta )

Specificità 100 %

Vantaggi semplicità

rapidità

Svantaggi rileva solo la presenza di Lp 1

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Immunofluorescenza diretta

Questa tecnica che utilizza anticorpifluorescenti specifici messi a contatto con

frammenti di tessuto polmonare o secrezioni respiratorie pemette di

• di rilevare le presenza di legionelle nei materiali respiratori

• di identificare eventuali colonie sviluppatesi su terreni selettivi per legionella

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Immunofluorescenza diretta

• L. non pneumophila (specificità e sensibilità di questi reagenti non è stata ancora ben valutata)

• Permette di evidenziare le legionelle anche dopo alcuni giorni dall’inizio della terapia antibiotica

• E’ possibile identificare

L.pneumophila (sensibilità da 25 a 75% specificità sup a 95%)

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Diagnosi sierologica

La rilevazione di anticorpi specifici (IgG, IgM IgA ) può essere fatta con varie metodiche

• Immunofluorescenza indiretta• Metodi immunoenzimatici• Metodi di microagglutinazione

E’ utile per una diagnosi retrospettiva

( E’ significativo un aumento del titolo di almeno 4 volte)

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PCRPCRProduce :

• Diagnosi rapida

• Rileva la presenza di varie specie e sierogruppi di legionella

• E’ applicabile a campioni ambientali

• Ha una sensibilità simile all’esame colturale

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Sindrome polmonare da hantavirus

• Malattia sistemica frequentemente letale

Diagnosi

• Sierologica Rilevazione IgM specifiche

IgG specifiche in aumento

• PCR Rilevazione RNA specifico nei capioni cinici

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Polmonite da P.carinii

In pazienti con deficit dell'immunità cellulo-mediata

diagnosi immunofluorescenza diretta sul BAL

PCR

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Aspergillosi polmonare• Diagnosi• es. microscopico diretto non specifico • Rilevazione del galattomannano su siero

-La positività può precedere di 5-8 gg i sintomi clinici

-Il test dovrebbe essere usato come screening

-La rilevazione di risultati positivi in due campioni successivi supporta la diagnosi

-Può essere usato come follow up della risposta clinica alla terapia

-Il titolo diminuisce in caso di risposta clinica eccetto che per i paz. In terapia con echinocandine

Sensibilita 80%

Specificità 89,2%• PGR