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Lucia Martelli
Diagnostica microbiologica delle infezioni delle basse
vie respiratorie
Lucia Martelli
LA DIAGNOSI MICROBIOLOGICA
• influenza la terapia
che è in funzione di
• permette di individuare cluster epidemici
• permette di individuare patologie causate da patogeni non endemici in quell'area
Infezioni basse vie respiratorie
Presenza di patogeni piu frequentemente isolati oppure di patogeni non comuni
Presenza di patogeni che mostrano
antibiotico resistenza
Presenza di patogeni per i quali le
linee guida non prevedono un
trattamento ottimale
Perchè una corretta diagnosi eziologica è importante?
• per studiare l’andamento dell’antibiotico resistenza
• Per aumentare l’accuratezza delle raccomandazioni delle linee guida
• Per guidare i comportamenti in caso di patologie particolari come SARS, Influenza,Legionellosi patologie da bioterrorismo
Infezioni basse vie respiratorie
La diagnosi microbiologica rende possibile una:
• Diagnosi probabile
• Diagnosi definita
Infezioni basse vie respiratorie
quadro clinico compatibile + rilevazione di un patogeno polmonare in quantità medio alta (in modo semiquantitativo)
quadro clinico tipico + agente eziologico probabile
un campione non contaminato
+ probabile patogeno che non colonizza le vie respiratorie
superiori
nelle cap che necessitano di ricovero
per pazienti ospedalizzati
per pazienti immunocompromessi con infezioni delle basse vie
Infezioni basse vie respiratorie La diagnosi microbiologica gravità
della malattia
nelle bronchiti
nelle cap non
complicate e in assenza
di fattori di rischio
(sono sufficienti le linee
guida)
E’importante ma non sempre efficace
È limitato
Fattori interferenti con la diagnosi microbiologica
- Adeguatezza del campione( assenza di contaminazione da parte della flora del tratto respiratorio superiore)
- Uso di test diagnostici importanti sono:
rapidi e sensibili esame microscopico
la ricerca di antigeni
tests di biologia molecolare
Infezioni basse vie respiratorie
Correlazione tra agenti patogeni ed età
età microrganismi più probabili
Neonati(0-1 mo) Escherichia coli, Streptococcus agalactiae
lattanti (1-6 mo) Chlamydia trachomatis , RSV
bambini (6 mo-5 yr) RSV, Parainfluenza
Virusesragazzi (5-15 yr) Mycoplasma pneumoniae , Influenza Virus Tipo A
giovani adulti(16-30) Mycoplasma pneumoniae, Streptococcus pneumoniae
adulti Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae
Infezioni basse vie respiratorie
Tipo di polmonite patogeni comuni patogeni rari
Acquisita in comunità S. pneumoniae, H. influenzae, Staphylococcus
K. pneumoniae M.catarrhalis N. meningitidis
Primaria atipica Mycoplasma pneumoniae Adenovirus, tosse non produttiva RSV, Clamydia spp. Influenza, Legionella spp., tuberculosis,
polmoniti fungine acute
Polmonite nosocomiale bacilli Gram neg(Enterobacter, legionella Klebsiella, Acinetobacter S. pneumoniae , Pseudomonas), S. aureus, batteri anaerobi
Infezioni basse vie respiratorie
Correlazione tra agenti patogeni e patologia
Tipo di polmonite patogeni comuni patogeni rari
polmonite ematogena Staphylococcus spp., bacilli Gram negativi Streptococcus spp. polmonite in paz. batteri come nella CAP* Legionella,Listeria immunodepressi Pneumocystis carinii, Histoplasma, Cytomegalovirus, Coccidioides HSV, Nocardia sp.
Funghi opportunisti * Candida
* Mucor * Aspergillus
Polmonite anaerobi
da aspirazione Staphylococcus,
Bacilli Gram negativi aerobi
Infezioni basse vie respiratorie
Materiale Idoneo
Diagnosi Microbiologica
Germi comuni, Legionella Micobatteri
Nocardia , miceti
+ P.carinii
Escreato
Escreato indottoBronco
Aspirato
LavaggioBroncoalveola
re
LavaggioBronchiale
Idem
Solo per Micobatteri, Legionella,P.carinii e miceti filamentosiIdoneo per tutte le ricerche
batteriologiche,virologiche fungineparassitologiche
Germi comuni,Miceti,AnaerobiMicobatteri,Legionella,Nacardia
Liquido pleurico
Materiale Idoneo Diagnosi Microbiologica
Sangue
Urina
Siero
Batteri Gram+,Gram-Miceti
Rilevazione antigeni diLegionella, Pneumococco
Per ricerche di anticorpiricerca di antigene di Aspergillus
La diagnosi Microbiologica
Metodi diretti es batteroscopico su materiali
es colturale respiratori
emocoltura
rilevazione di antigeni
Metodi di amplificazione genica
tecnologie microarray
Metodi indiretti tests sierologici
Infezioni basse vie respiratorie
Esame microscopico Permette di
Infezioni basse vie respiratorie
Stabilire l'idoneità del materiale
Valutare la quantità di PMN e microrganismi
(processo infiammatorio e infezione batterica)
Fare una diagnosi presuntiva mediante il rilevamento di potenziali patogeni
può indurre ad attuare iter diagnostici diversi da quelli routinari
Metodi diretti
Inoltre
Infezioni basse vie respiratorie
di avviare una terapia empirica verso patogeni
meno comuni e di abbandonare
terapie inappropriateDi validare i risultati dell'esame
colturaleDi valutare l'azione inibente della
terapia
antibiotica su microrganismi presenti
che non si sviluppano in coltura
Esame colturale
Esame microscopico
Materiale Biologico Idoneo
Esame Colturale
Isolamento batteri e miceti non esigenti
Infezioni basse vie respiratorie
Esame colturale dei materiali ottenuti con procedimenti non
invasivi
spesso non è specifico
nè sensibile
Infezioni basse vie respiratorie
• l'eventuale precedente terapia antibiotica
• l'eventuale scarsa idoneità del campione
• difficoltà di interpretazione la presenza di flora delle alte vie che può includere eventuali patogeni (falsi positivi)
o coprire il vero patogeno (falsi negativi)
Per
Esame colturale di materiali ottenuti con procedimenti
invasivi permette
di attribuire un significato eziologico ai vari isolati se accompagnati da una valutazione numerica
Infezioni basse vie respiratorieMetodi diretti
Esame colturaleInfezioni basse vie respiratorie
Incubazione a 37° per 24-48hIn atmosfera normale o in Co2
Semina su terreni idonei
LETTURA
IDENTIFICAZIONEANTIBIOGRAMMA(se previsto)
Metodi diretti
EmocolturaInfezioni basse vie
respiratorie
● E' raccomandata per tutti i pazienti con grave polmonite e se positiva permette di fare diagnosi
● Il più comune isolato è S.pneumoniae
● Si ha positività nel 5-14%
Metodi diretti
Rilevazione antigeni su materiali respiratori
si basano su
Infezioni basse vie respiratorie
Metodi diretti
● Agglutinazione al lattice
● Immunofluorescenza diretta
● EIA
Ricerca antigeni su materiali respiratoriVantaggi
• Sono rapidi • Idonei per Virus influenzali A e B
RSV Adenovirus Virus parainfluenza 1,2,3 HCMV HSV1,HSV2
Legionella, Pneumococco
Metodi diretti
Infezioni basse vie respiratorie
Rivelazione antigeni su urine• Tests immunocromatografici
S. pneumoniae e legionella pneumophila sier 1
Vantaggi • Rapidi• semplici• Positivi anche dopo l'inizio della terapia
Metodi diretti Infezioni basse vie respiratorie
S.pneumoniaeAntigene (polisaccaride parete)
VantaggiSpecificità >90% < nei bambini portatori sani
Sensibilità 50-80%
Infezioni basse vie respiratorie
Svantaggi
Cross-reattività con S.oralis e S.mitis
Non distingue infezione in atto da infezione pregressa
Il valore diagnostico è maggiore se associato a emocultura
Antigene urinario di legionella
Il test non rileva tutti i sierotipi
Vantaggi
Sensibilità 70-100%
Specificità 100%
SvantaggiPositività prolungata nel tempo
Infezioni basse vie respiratorie
Diagnostica molecolare
Si basa
• Ricerca del DNA mediante Ricerca del DNA mediante amplificazione con metodica PCRamplificazione con metodica PCR
• Tecnologia microarrayTecnologia microarray
Infezioni basse vie respiratorie
Diagnostica molecolare identifica un organismo in base a
sequenze geniche specifiche
• ESTRAZIONE ACIDO NUCLEICO
•AMPLIFICAZIONE CON PRIMER IDONEI A LIMITARE LA SEQUENZA GENICO SPECIFICA
•IDENTIFICAZIONE DNA AMPLIFICATO
IMMUNO CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA SU GEL DI AGAROSIOFLUORESCENZA (REALTIME)
Infezioni basse vie respiratorie
Diagnostica MolecolareDiagnostica Molecolare
Svantaggi
• Costo elevato• Se qualitativa non indica se infezione
in atto o pregressa• Non consente di procedere alla
determinazione della sensibilità ai chemioterapici
• Richiede esperienza di metodiche molecolari
Diagnostica MolecolareDiagnostica Molecolare• Nel nostro laboratorio vengono rilevati con
PCR • Virus respiratori Adenovirus VRS Influenza A-B HSV1-2 HCMV
• Batteri atipici Mycoplasma Legionella Chlamydia
• Miceti Aspergillo
Microarray Rappresenta un potenziale interessante
per il laboratorio di microbiologia
• Un DNA microarray (o DNA chip) è costituito da una collezione di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una superficie solida.
Permette di• Esaminare il profilo di espressione di un gene• Di identificare un gene in una miscela di
migliaia• Sfrutta la tecnica di ibridazione inversa
MicroarrayVantaggi• Rapido (non necessita di reazioni di
amplificazione)• E' un sistema miniaturizzato• Dotato di alta processività• Permette analisi parallele su larga scala
• Nei laboratori di ricerca è stato utilizzato per
1. Identificare funghi patogeni coinvolti nelle micosi invasive
2. Identificazioni batteriche 3. Per una rapida identificazione da bottiglie di emocolture
positive
Metodi sierologici• Tests di immunofluorescenza • Tests di FC• Non sono utili per una diagnosi precoce• Sono importanti a scopi epidemilogici• Utili per la diagnosi di infezione dei patogeni atipici • Necessitano di due campioni uno in fase acuta ed
uno in fase di convalescenza (sieroconversione)• Permette di valutare se infezione in atto o infezione
pregressa
Infezioni basse vie respiratorie
Metodi indiretti
Diagnostica di alcune patologie
Polmonite da C.pneumoniae• La C.pneumoniae è responsabile
del5%-15% delle polmoniti
• Raramente è necessario il ricovero (anziani con comorbidità, associata ad altri patogeni)
• La reinfezione è comune
Polmonite da C.pneumoniae Diagnosi microbiologica difficile• La chlamydia è difficilmente coltivabile• La sierologia è problematica e non specifica
Nelle infezioni primarie le IgM possono impiegare anche 3 settimane a manifestarsi
Le IgG 8 settimane: la negatività non esclude la malattia
Nelle reinfezione leIgM rimangono costantiLe IgG salgono rapidamente
• PCR con marchio CE e IVD Recentemente è uscita Real time PCR solo
qualitativa Viene eseguita su materiale respiratorio É specifica per la specie
Polmonite da M.pneumoniae
Il Mycoplasma è responsabile del10%-20% delle polmoniti nei giovani adulti
Diagnosi• Esame colturale (troppo lento)• Tests sierologici Le agglut a freddo >1.64 supportano
la diagnosi ma sono poco specifiche
La reazione di FC rileva le IgM se il prelievo è precoce
• PCR con marchio CE e IVD
Legionellosi Diagnosi di laboratorio
metodiche utilizzate:
- esame colturale *
- rilevazione dell’antigene urinario
- test di immunofluorescenza diretta *
- rilevazione di anticorpi
-ibridizzazione degli acidi nucleici *
*E’ IMPOTANTE L’IDONEITA’ DEL MATERIALE
Esame colturale
Rappresenta il gold standard per la diagnosi
(per un risultato positivo occorrono da 3 a 5 giorni )
Materiali idonei sputo *
campioni broncoscopici
.Terreni idonei BCYE (buffered charcoal yeast
extract)
BCYE con antibiotico
Esame colturale
Fattori che influnzano la sensibilità
• Scarsa sopravvivenza nelle secrezioni
• Produzione scarsa di secrezioni
Esame colturale
• E’ importante per
Confermare i risultati positivi dell’antigenemia
Individuare infezioni sostenute da specie e sierogruppi diversi da sier 1
Identificazione
Vengono valutate le seguenti caratteristicheVengono valutate le seguenti caratteristiche
Capacità di crescita su BCYE
Morfologia tipica delle colonie
Capacità di reagire con antisieri specifici fluorescenti e non
Test di ibridizzazione del DNA
Ricerca dell’antigene urinario un metodo rapido che produce una diagnosi precoce (1 un metodo rapido che produce una diagnosi precoce (1
giorno dopo l’insorgenza dei sintomi , può permanere giorno dopo l’insorgenza dei sintomi , può permanere per mesi )per mesi )
L’atg è un componente della frazione L’atg è un componente della frazione polisaccaridicadella paretepolisaccaridicadella parete
RIARIAMetodiche EIA ( Metodiche EIA ( per più sierogruppiper più sierogruppi ) ) Immunocromatografiche
(solo per legionella p. sier 1 )
E’ un esame ritenuto sufficiente a fornire un criterio microbiologico di certezza nelle definizione di caso
Antigene urinario
Data la sua possibile permanenza protratta nelle urine può risultare difficile la distinzione tra
• infezione acuta• fase di convalescenza• infezione pregressa
Antigene urinario
• Test immunocromatografico ( BIOTEST )
Sensibilità 70-100 % ( dopo centrifugazione aumenta )
Specificità 100 %
Vantaggi semplicità
rapidità
Svantaggi rileva solo la presenza di Lp 1
Immunofluorescenza diretta
Questa tecnica che utilizza anticorpifluorescenti specifici messi a contatto con
frammenti di tessuto polmonare o secrezioni respiratorie pemette di
• di rilevare le presenza di legionelle nei materiali respiratori
• di identificare eventuali colonie sviluppatesi su terreni selettivi per legionella
Immunofluorescenza diretta
• L. non pneumophila (specificità e sensibilità di questi reagenti non è stata ancora ben valutata)
• Permette di evidenziare le legionelle anche dopo alcuni giorni dall’inizio della terapia antibiotica
• E’ possibile identificare
L.pneumophila (sensibilità da 25 a 75% specificità sup a 95%)
Diagnosi sierologica
La rilevazione di anticorpi specifici (IgG, IgM IgA ) può essere fatta con varie metodiche
• Immunofluorescenza indiretta• Metodi immunoenzimatici• Metodi di microagglutinazione
E’ utile per una diagnosi retrospettiva
( E’ significativo un aumento del titolo di almeno 4 volte)
PCRPCRProduce :
• Diagnosi rapida
• Rileva la presenza di varie specie e sierogruppi di legionella
• E’ applicabile a campioni ambientali
• Ha una sensibilità simile all’esame colturale
Sindrome polmonare da hantavirus
• Malattia sistemica frequentemente letale
Diagnosi
• Sierologica Rilevazione IgM specifiche
IgG specifiche in aumento
• PCR Rilevazione RNA specifico nei capioni cinici
Polmonite da P.carinii
In pazienti con deficit dell'immunità cellulo-mediata
diagnosi immunofluorescenza diretta sul BAL
PCR
Aspergillosi polmonare• Diagnosi• es. microscopico diretto non specifico • Rilevazione del galattomannano su siero
-La positività può precedere di 5-8 gg i sintomi clinici
-Il test dovrebbe essere usato come screening
-La rilevazione di risultati positivi in due campioni successivi supporta la diagnosi
-Può essere usato come follow up della risposta clinica alla terapia
-Il titolo diminuisce in caso di risposta clinica eccetto che per i paz. In terapia con echinocandine
Sensibilita 80%
Specificità 89,2%• PGR