L.S. in Scienze e tecnologie alimentariAnno Accademico 2008/2009

Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli

alimenti (7 CFU)Modulo:

Chimica analitica strumentale (4 CFU)Giorgio Bonaga

GASCROMATOGRAFIA (GC)

(CAS-3a)Giorgio Bonaga

GASCROMATOGRAFIA (GC)fase mobile: gasI composti da separare (liquidi, solidi, gas) devono essere gas o resi gassosi. Lo stato di gas si ottiene riscaldando le sostanze nel momento dell’introduzione nello strumento e mantenendo il sistema a temperatura elevata (solo la temperatura della colonna può essere programmata con gradiente termico).

• CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE GAS-LIQUIDO (GLC) fase stazionaria: liquido su solido inerte o sulle pareti della colonna

• CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO GAS-SOLIDO (GSC) fase stazionaria: solido adsorbente

• CROMATOGRAFIA A FLUIDO SUPERCRITICO (SFC) fase stazionaria: fluido supercritico Giorgio Bonaga

Le soluzioni di campione vengono iniettate in un sistema la cui pressione interna non è molto diversa dalla pressione atmosferica.Nella GC la fase mobile è un gas che non compete con la fase stazionaria, ma che ha semplicemente il compito di “trasportare” (carrier gas) i soluti all’estremità della colonna. La migrazione differenziale di soluti diversi è dovuta alle diverse interazioni soluto/fase stazionaria, ovvero alle diverse costanti di equilibrio termodinamico Kd di soluti differenti.

Lo strumento della gascromatografia è il gascromatografo (Martin e Synge, 1941), le cui parti essenziali sono:1. bombola del gas inerte con riduttore di pressione a due stadi,

regolatore del flusso di gas, rotametro (misuratore del flusso in entrata), separatore di flusso, flussimetro (misuratore del flusso in uscita);

2. iniettore del campione (injector);3. colonna cromatografica alloggiata nel fornetto (oven) dello

strumento;4. rivelatore (detector).

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Carrier gas:He, Ar, N2, H2, CO2

riduttore

regolatoredel flusso

rotametro

B

separatore del flusso

injector

colonna

GASCROMATOGRAFO

detectorflussimetro

OVEN

colonna

Giorgio Bonaga

CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONEGAS-LIQUIDO (GLC o GC)

È ancora oggi la cromatografia più importante perché è quella che consente il maggior numero di applicazioni, specialmente nel settore dell’analisi degli alimenti, con una facile ottimizzazione delle condizioni operative. La separazione dei soluti è dovuta alla loro migrazione differenziale lungo la colonna per effetto delle differenti interazioni con la fase stazionaria (un liquido immobilizzato su un supporto solido inerte o sulle pareti della colonna). La fase mobile è solo un trasportatore (“carrier gas”), essa non partecipa al processo di ripartizione. Ogni fase stazionaria liquida ha caratteristiche chimico-fisiche proprie, tra le quali la pressione (o tensione) di vapore. Nella GC, tenendo conto che la fase mobile non partecipa alla partizione, l’unico parametro che può modificare l’equilibrio (ovvero la costante termodinamica Kd che lo descrive) è la temperatura. Un incremento di temperatura aumenta in modo esponenziale la tensione (pressione) di vapore degli analiti e di conseguenza un loro più rapido passaggio nella fase mobile. L’effetto finale è la riduzione del loro tempo di ritenzione (un incremento di circa 30°C produce il dimezzamento del tR).

Giorgio Bonaga

PRESSIONE DI VAPORE

Tens

ione

di v

apor

e

Pvapore

All’equilibrio è costante il rapporto tra il numero di molecole che dallo stato liquido passano alla stato gassoso e il numero di molecole che dallo stato gassoso passano allo stato liquido

Giorgio Bonaga

RELAZIONE TEMPERATURA/ENERGIA CINETICA

Ecmedia (t1) Ecmedia (t2)Ec > forze intermolecolari del liquido

t1t2

frazio

ne d

i mol

ecol

e

Giorgio Bonaga

liquidoPRESSIONE DI VAPORE (mm/Hg)0°C 20°C 30°C

etere etilico

185 442 647

etanolo 12 44 74acqua 5 18 32

RELAZIONE TEMPERATURA/PRESSIONE DI VAPORE

Tens

ione

di v

apor

e

milli

bar

t (°C) -30 -20 -10 0 10 20 30

48,0

24,0

12,0

6,0 3,0 1,5

Giorgio Bonaga

RELAZIONE TEMPERATURA/TEMPO DI RITENZIONE

tR= 4’

tR= 2’

t

t + 30°C Giorgio Bonaga

ALLARGAMENTO DEI PICCHI IN GCL’allargamento dei picchi è governato dall’altezza equivalente del piatto teorico (HETP), tenuto conto che alcuni termini dell’espressione vanno modificati sulla base delle specificità della GC:

Q U dliq22 dp. l + + +

2 g v

vdp2 HETP = v

Inglobando tutte le costanti caratteristiche di una determinata colonna e di una determinata fase stazionaria (dp, l, g, dc, Q, U, dliq, Dliq) ed anche di un determinato gas (Dgas) nelle costanti A, B e C, l’equazione può essere scritta nella versione di Van Deemter, che correla queste costanti alla velocità lineare media di flusso del gas di trasporto (v):

HETP = A + B + C . v

Verranno discussi più avanti i profili di questa equazione in relazione al tipo di colonna GC utilizzata.

v

DmDgas

DmDgas

dc2W

DliqDs

Giorgio Bonaga

LE VARIABILI DELLA GCNell’analisi gascromatografica, analogamente alle altre tecniche analitiche, si deve operare una scelta delle variabili del sistema, sulla base delle caratteristiche della miscela che bisogna analizzare. Nella gascromatografia di ripartizione le variabili sono:

1. TIPO DI COLONNA (impaccata o capillare)2. FASE STAZIONARIA (supporto solido inerte e liquido di

partizione)3. FASE MOBILE (tipo di gas e velocità di flusso)4. TEMPERATURA (isoterma o programmata)5. INIETTORE (on column, split/splitless)6. RIVELATORE (FID, TCD, ECD, NPD)

Gli argomenti verranno trattati in riferimento alla gascromatografia tradizionale, perchè gli ultimi sviluppi di questa tecnica (“Fast GC”, “Ultra Fast GC” e “2DGC”) verranno illustrati separatamente.

Giorgio Bonaga

1. TIPO DI COLONNALa classificazione fondamentale delle colonne per GC è:1. COLONNE IMPACCATE (“Packed Colum”): sono tubi di acciaio inossidabile, rame o vetro che vengono riempiti con una fase stazionaria costituita da a) supporto solido (di diversa composizione e granulometria, opportunamente trattato) sul quale si deposita b) film del liquido di partizione (liquido alle temperature di esercizio).

2. COLONNE CAPILLARI (“Open Tubular”): sono tubi di vetro o di silice fusa, con a) film di liquido di partizione supportato su b1) parete interna della colonna (WCOT = Wall Coated Open Tubular), b2) strato poroso sulla parete interna della colonna (SCOT = Support Coated Open Tubular), b3) parete interna della colonna resa porosa (PLOT = Porous Layer Open Tubular)

3. COLONNE MEGABORE (“Open Tubular”): la loro efficienza è intermedia tra quella delle impaccate e quella delle capillari. Hanno elevata capacità (quantità iniettabile fino a 3 ml) e compatibilità con tutti i tipi di iniettori GC.

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colonne capillari di silice fusa

capillaryfused silica column

colonne impaccate di vetropacked

glass column

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WCOT SCOT PLOT

IMPACCATA

strato porososilice

liquido di partizione

“Open Tubular”

vetro

fase stazionaria(supporo+liquid

o)

Giorgio Bonaga

GC-impaccata GC-capillare

3,0 mm (i.d.) 0,25-0,53 mm

(i.d.)0,1-25 mm (f.t.)

Giorgio Bonaga

CARATTERISTICHECAPILLARI

MEGABORE IMPACCATEWCOT SCOT PLOT

diametro interno (mm) 0,32-0,53

0,32-0,53

0,32-0,53

0,53 3-6

piatti teorici/m 1000-4000

600-1200

2000-4000

2000 500-1000

lunghezza massima (m) 150 150 150 10 3piatti teorici totali (N) 3000000 150000 450000 20000 3000fase liquida (%) - - - - 5-10spessore fase liquida (mm) 0,1-0,5 0,1-0,5 15-25 1-10 5-10granulometria supporto (mesh)

- - - - 80-120

flusso medio (ml/min) 0,5-5,0 0,5-5,0 5-10 0,3-4,0 20-70velocità lineare media (cm/s) 20-50 20-50 50-100 10-40 10-50

PERCENTUALE DI CARICO E RAPPORTO b

1. COLONNE IMPACCATEIl rapporto tra la massa del liquido di partizione e la massa totale della fase stazionaria (supporto solido + liquido di partizione) espresso in percentuale (ossia la concentrazione percentuale in peso) è la:

% di carico = massa liquido di partizione massa fase stazionaria

ESEMPIOUna colonna è stata impaccata con 1,5 g di liquido di partizione e 48,5 g di supporto solido, la percentuale di carico è 1,5/50 = 3%

2. COLONNE CAPILLARIIl rapporto tra il diametro interno della colonna capillare e lo spessore delliquido di partizione è espresso dall’equazione:

rapporto b = i.d. = i.r. 4 f.t. 2 f.t.

dove: i.d. = diametro interno della colonna (in mm) i.r. = raggio interno della colonna (= i.d./2) f.t. = film thickness (in mm)

Giorgio Bonaga

rapporto b = i.d. = i.r.

4 f.t. 2 f.t.

film thickness in mm (f.t.)

diametro interno in mm (i.d.)

Giorgio Bonaga

b mol wt soluti da separare12-100 16-350 gas, solventi, idrocarburi a bassa massa molecolare,

alogenati volatili100-320 100-700 campo delle applicazioni più comuni

320-1325

350-1500 Idrocarburi ad alta massa molecolare, cere, prodotti petroliferi

Maggiore è il valore del rapporto b minore è la frazione di tempo che i soluti trascorrono nel liquido di partizione, ossia minori sono i loro tR. Il rapporto b è utile: 1. per scegliere la colonna idonea alla soluzione di soluti da

separare;2. per confrontare le separazioni fatte con colonne di differente

diametro (se hanno lo stesso b, le separazioni risulteranno fondamentalmente uguali).

ESEMPIO

0,53 mm i.d./0,1 mm f.t.0,53 mm i.d./0,4 mm f.t.

0,32 mm i.d./7,0 mm f.t.0,32 mm i.d./0,8 mm f.t.

Giorgio Bonaga

EQUAZIONE DI VAN DEEMTERIl trasferimento dell’equazione di Van Deemter alle colonne GC deve tenere conto delle specificità delle colonne:

1. le colonne impaccate sono riempite con un supporto inerte ricoperto dal liquido di partizione. Rispetto l’HETP questo sistema mostra:• un maggior effetto eddy per la tortuosità dei percorsi;• una minore diffusione longitudinale per la resistenza offerta dalle

particelle di fase stazionaria (fattore di ostruzione = 0,6);

• maggiori trasferimenti di massa nella fase mobile per effetto della maggior dimensione delle particelle di fase stazionaria;

• maggiore trasferimento di massa nella fase stazionaria e maggiore resistenza al trasferimento di massa tra le due fasi (elevato “loading”).

2. le colonne capillari sono “open tubular”, con film di liquido di partizione depositato sulle pareti della colonna o su strati porosi aderenti alle pareti della colonna. Rispetto l’HETP questo sistema mostra:• la mancanza dell’effetto eddy;• una maggiore diffusione longitudinale per la minore resistenza offerta

dallo strato di fase stazionaria sulle pareti della colonna (fattore di ostruzione = 1,0);

• minore resistenza al trasferimento di massa tra il film del liquido di partizione e la fase mobile gassosa (basso “loading”).

Giorgio Bonaga

Queste considerazioni spiegano il diverso andamento grafico delle equazioni di Van Deemter:

B / v C . vv

A

C . vB / v

v

HETP = A + B/v + C . v HETP = B/v + C . v

COLONNE IMPACCATE COLONNE CAPILLARI

HETP

HETP

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2. FASE STAZIONARIAa) SUPPORTO INERTE PER COLONNE IMPACCATEHa la funzione di garantire al liquido di partizione la maggior superficie di contatto con la fase mobile. Il supporto ideale è costituito da particelle sferiche uniformi, inerti, con buona resistenza meccanica, con un’area specifica di 1 m2/g. In realtà di impiegano materiali diversi:• gel di silice (da terra di diatomee)• allumina• carbone e carbone grafitato• setacci molecolari (zeoliti)• polimeri e copolimeri organici solidi porosi (resine)

allumina carbone zeoliti resine

diatomee

gel di

silice

Giorgio Bonaga

COMPOSIZIONE CHIMICA DI SUPPORTI A BASE DI SILICATI

COMPONENTE FirebrickC22

Celite545

Chromosorb P

ChromosorbW

SiO2 89,7 89,9 89,2 91,2Al2O3 5,1 3,6 5,1 4,1Fe2O3 1,6 1,7 1,5 1,1TiO2 0,3 0,3 0,3 0,3Cao 1,3 1,8 0,9 0,7Mgo 0,9 0,7 1,0 0,7

COMPOSIZIONE CHIMICA DI SUPPORTI A BASE DI RESINE

RESINA COMPOSIZIONE

Porapak A etilvinilbenzene/divinilbenzene Porapak N polivinilpirrolidone Porapak P stirene/divinilbenzene Porapak T etilenglicoledimetacrilato Chromosorb T politetrafluoroetilene

Gior

gio

Bona

ga

etilvinilbenzene divinilbenzene polivinilpirrolidone stirene divinilbenzene

Porapak A Porapak N Porapak P

CH CH2

CH2CH3

CH CH2

CH CH2

N OCH CH2

C CH3CH2C O

O

CH2 CH2O

CO

CCH3

CH2

CH CH2

CF

FCF

F

CH CH2

CH CH2

etilenglicoldimetacrilato politetrafluoroetilene

Porapak T Chromosorb T

n m

n n

n n m

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TRATTAMENTO DEL SUPPORTO

Il materiale a base di silicati (scheletri di diatomee) viene sottoposto ad una procedura di ottimizzazione (la sua funzione infatti è di alloggiare il liquido di partizione, ma non produrre fenomeni di adsorbimento o di interazione con i soluti) che prevede i seguenti passaggi:• inattivazione (trattamento con HCl a riflusso seguito da

calcinazione per trasformare i “gruppi silanolici” in “gruppi silossanici” e per eliminare sostanze con elevata tensione di vapore);

• fusione con NaCO3 (per garantire una cottura che produca “mattonelle”);

• triturazione (per ottenere materiale polverulento);• setacciamento (per selezionare il supporto in base alla

granulometria)• inerzializzazione (per convertire i gruppi silanolici residui nei

corrispondenti derivati)

Giorgio Bonaga

INATTIVAZIONEIl trattamento con HCl a riflusso trasforma i gruppi silanolici superficiali in gruppi silossanici, mentre con la calcinazione si ottiene la rottura dei ponti silossanici preesistenti con un aumento della porosità del supporto. La superficie porosa del supporto consente una migliore adesione del liquido di partizione. Sono le condizioni del trattamento idrotermico (concentrazione di HCl e temperatura della calcinazione), unitamente alla composizione chimica del silicato, che determinano le proprietà dei supporti (densità libera, densità impaccata, area superficiale, pH).

SiO O

O

Si

SiO

SiO

O Si OO

SiOOO

HH

OSi

OO

H

H

O H

HO

O

H

O

O

gruppo silossanico

gruppo silanolico

SiO

Si

OSi

HCl T (°C)poro

Giorgio Bonaga

OSi

SiO

Si

SETACCIAMENTOSi impiegano dei setacci con un diverso numero di maglie per unità di superficie: l’unità di misura è il mesh = numero di maglie/inch2 ( 1 pollice = 2,54 cm). L’indicazione 60-80 mesh caratterizza quelle particelle che passano attraverso le maglie del setaccio a 60 mesh, ma vengono trattenute dal setaccio a 80 mesh. E così via.

~ 150-170 mm

100 mesh

80mesh

Giorgio Bonaga~ 170-250 mm

80 mesh

60 mesh

INERZIALIZZAZIONE (FUNZIONALIZZAZIONE)Consiste nella silanizzazione dei gruppi silanolici (-Si-OH) residui con agenti sililanti, ovvero in grado di trasformare gli –OH liberi dei gruppi silanolici nei corrispondenti trimetilsilil-derivati (-OTMS).

Cl SiCH3

CH3CH3

OH

O SiCH3

CH3CH3

SiCH3CH3

CH3NH

SiCH3

CH3

CH3Cl SiCH3

CH3CH3

trimetilclorosilano esametildisilazano (TMCS) (HMDSA)

+ + HCl

sito attivo verso sito inerte i soluti (- OTMS)

..

Giorgio Bonaga