L.S. in Scienze e tecnologie alimentariAnno Accademico 2008/2009

Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli

alimenti (7 CFU)Modulo di:

Chimica analitica strumentale (4 CFU)Giorgio Bonaga

CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC)

(CAS-4b)Giorgio Bonaga

6. TECNICHE DI SEPARAZIONELe fasi stazionarie in HPLC sono costituite da particelle di silice (più raramente allumina) che funzionano da ADSORBENTI (cromatografia di adsorbimento = LSC) o da SUPPORTO (cromatografia di partizione = LLC).La diffusione della silice è giustificata da alcune sue proprietà specifiche:• è in grado di sopportare pressioni molto elevate (> 1000 atm);• è chimicamente stabile verso tutti i solventi a pH non superiore a 8;• è facilmente funzionalizzabile (derivatizzabile);• è facile ottenerla sottoforma di particelle uniformi;• è disponibile in varie dimensioni e porosità (60-100 Å).

Nella Bonded Phase Chromatography (BPC), che è una cromatografia di partizione, le particelle di supporto sono legate a dei composti organici.Nella Size Exclusion Chromatography (SEC) le particelle di supporto hanno una porosità controllata e separano i soluti in funzione della loro dimensione molecolare (che è cosa diversa dal loro peso molecolare).Nella Ion Exchange Chromatography (IEC) i gruppi ionici (cationici od anionici) sono legati chimicamente alla superficie del supporto.

Giorgio Bonaga

Giorgio Bonaga

acido arachidonicoC24H42O2 mol wt 362

N,N,N-triottilamminaC24H51N mol wt 353

PORO

DIMENSIONE MOLECOLARE (STRUTTURA)E PESO MOLECOLARE

La complessità della correlazione soluto/fase stazionaria/fase mobile rende conto del perché, in generale, in tutte le tecniche di separazione LC si utilizza una grandissima varietà di solventi; la polarità della fase mobile, anche se non è l’unico, è il più importante fattore che produce una migliore solvatazione del soluto e dunque una più veloce eluizione.Questa necessità di variare la composizione della fase mobile per ottimizzare le separazioni dei soluti è alla base della classificazione delle tipologie di eluizione della LC:

a. ELUIZIONE ISOCRATICALa composizione della fase mobile rimane costante per tutto il tempo dell’eluizione. b. ELUIZIONE A GRADIENTE La composizione della fase mobile viene fatta variare durante l’eluizione (con aumento della percentuale del solvente più polare), allo scopo di separare tutti i soluti, anche quelli che hanno fattori di capacità (k’) molto diversi.

Giorgio Bonaga

Cor

so d

i lau

rea

in S

cien

ze e

Tec

nolo

gie

Alim

enta

ri A) CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO

(Liquid Solid Chromatography)FASE MOBILE: liquidoFASE STAZIONARIA: solido adsorbenteLa separazione si basa sull’assorbimento dei soluti sulla superficie della fase stazionaria, dotata di siti attivi che danno luogo a interazioni non specifiche (forze di dispersione di Van der Waals) e specifiche (legami idrogeno, interazioni dipolo-dipolo).Le fasi stazionarie adsorbenti più utilizzate nella LSC sono la silice (SIO2) e l’allumina (Al2O3), anche se la silice è preferita per la sua maggiore capacità di carica, ma anche perché è attiva sia con i gruppi silanolici liberi (fase diretta) che con i gruppi silanolici funzionalizzati (fase inversa). I siti attivi della fase stazionaria sono sempre ricoperti da molecole del solvente (solvatazione della fase stazionaria), così come il solvente circonda le molecole di soluto (solvatazione del soluto). Il soluto proveniente dalla fase mobile “sposta”, per competizione, dalla superficie della fase stazionaria un certo numero di molecole di solvente.

Giorgio Bonaga

particella di fasestazionaria assorbente

(frammento)soluto

solvente

H

H

HH

H

H

O

O

OO

OO

LSC IN FASE DIRETTA

MmMm

Mm

Giorgio Bonaga

Sm

Mm

Ma

Ma

Sa

Sm

Sa

Ponendo:

Sm = soluto nella fase mobile (= 3)

Ma = solvente adsorbito sulla fase stazionaria (= 6)

Sa = soluto adsorbito sulla fase stazionaria (= 2)

Mm = solvente che passa nella fase mobile (= 4)

L’equilibrio : Sm + Ma Sa + Mm

è espresso da: Kads =

Nell’esempio dell’animazione:

Kads = = 0,44

[Sa] . [Mm][Sm] . [Ma]

Giorgio Bonaga

[2] . [4][3] . [6]

Cor

so d

i lau

rea

in S

cien

ze e

Tec

nolo

gie

Alim

enta

ria. FASE STAZIONARIANella cromatografia di adsorbimento la fase stazionaria solida più utilizzata è la silice, con due modalità di impiego:

1. silice tal quale (fase diretta) con i gruppi silanolici liberi: a) i soluti polari sono molto adsorbiti e per eluire con tR

ragionevoli richiedono una fase mobile di polarità intermedia; b) i soluti non polari non sono adsorbitii ed eluiscono con tR

confrontabili con quelli dei solventi (tailing);2. silice funzionalizzata (fase inversa) con gruppi silanolici

derivatizzati: a) i soluti non polari sono molto adsorbiti e per eluire con tR

ragionevoli richiedono una fase mobile a bassa polarità; b) i soluti polari non sono adsorbiti ed eluiscono con tR

confrontabili con quelli dei solventi.

Giorgio Bonaga

soluto non polare solvente

FASE DIRETTA

Le particelle di silice sono di due tipi: particelle irregolari a corpo poroso, con diametro compreso tra

5-60 mm; particelle regolari con strato poroso di 1-2 mm (pellicolare), con

diametro compreso tra 10-40 mm;

40-60 mmirregolare

a corpo poroso

40 mmregolare

pellicolare (2 mm)

5-10 mmirregolare

a corpo poroso

10 mmregolare

pellicolare (1 mm)

Giorgio Bonaga

SiO O

O

Si

SiO

SiO

O Si OO

SiOOO

HH

OSi

OO

H

H

O H

HO

O

H

O

Ogruppo silossanico

gruppo silanolico(pKa 9)

gruppi silanolici geminali

Nella GSC in fase diretta, la silice va attivata per aumentare il numero di gruppi silanolici, normalmente presenti in quantità limitata rispetto i gruppi silossanici. L’attivazione si fa trattando con una soluzione 1M di HCl all’ebollizione per 10-20 ore. I gruppi silosssanici presenti nello strato pellicolare esterno nelle particelle di grandi dimensioni e all’interno dei canalicoli delle particelle di piccole dimensioni si idrolizzano parzialmente in gruppi silanolici. Per eliminare l’acqua di idrolisi, che si lega con legami idrogeno ai gruppi silanolici, si essica in stufa non oltre i 200°C per evitare che i gruppi silanolici si ricondensino in gruppi silossanici.

Giorgio Bonaga

I soluti vengono adsorbiti sui siti attivi della fase stazionaria in funzione della loro polarità ed è il gruppo funzionale più polare che determina il tempo di eluizione (di ritenzione) di un soluto. Un altro elemento strutturale importante è il numero e la posizione dei gruppi funzionali, perché influenza il numero di interazioni soluto/fase stazionaria.

H O

SiO

SiO

SiO

SiO

H

O

H

O

H

O

H O H

O

catecolo

H

O

O

H

idrochinone

COMPETIZIONE

Giorgio Bonaga

ESEMPIOQual’è l’ordine di eluizione dei 3 isomeri di posizione della nitroanilina in una LSC ?Le strutture dei tre isomeri mostrano che l’o-nitroanilina (1) forma legami idrogeno intramolecolari che, impegnando i gruppi funzionali, riduce l’interazione con la fase stazionaria. La m-nitroanilina (2), per motivi di geometria strutturale può interagire con uno soltanto dei suoi gruppi funzionali, mentre la p-nitroanilina (3) può interagire con entrambi. La risposta, in ordine di tempo di ritenzione crescente, è:

NH H

NO

O

NH H

NO

O

NH H

NO O

o m p

+

o

t (sec)

p

m

0 18 36 54

o < m < p

++

-

- -

Giorgio Bonaga

tR

Giorgio Bonaga

TEMPI DI RITENZIONE RELATIVI(silice e allumina)

• idrocarburi paraffinici CnH2n+2

• idrocarburi olefinici CnH2n

• idrocarburi aromatici C6H5-R• alogenuri RX• tioeteri (solfuri) R2S• eteri ROR• nitroderivati RNO2

• esteri ≈ chetoni ≈ aldeidi RCOOR, R2CO, RCHO• ammine primarie ≈ ammine secondarie

RNH2, R2NH

• alcoli ROH• ammidi RCONH2

• acidi carbossilici RCOOH• (acqua)

b. FASE MOBILELa forza del solvente della fase mobile è espressa dal calore che si sviluppa quando quel solvente puro interagisce con la fase stazionaria. Questo parametro è detto forza dell’eluente (e°) ed esprime l’energia di adsorbimento del solvente per area unitaria di superficie adsorbente standard. Tanto maggiore è l’interazione tra il solvente e la fase stazionaria tanto maggiore è l’energia che si sviluppa, tanto più elevata è la polarità del sovente e tanto più alta è la sua forza eluente.L’elenco dei valori di e° si chiama serie eluotropica per una certa fase stazionaria. Un aumento di e° di 0,05 unità produce una diminuzione di tutti i valori di k’ di un fattore compreso tra 3 e 4 . La corretta combinazione tra solventi a differente e° determinerà tempi di ritenzione adeguati alla separazione dei soluti. Sfortunatamente e° non varia linearmente con i rapporti volumetrici e pertanto la scelta della combinazione ottimale dei solventi della fase mobile è un po’ più complessa (sono disponibili diagrammi di correlazione tra e° e la combinazione di un certo numero di fasi mobili binarie di comune impiego).Nel caso di “overlapping” di picchi, se si sostituisce un solvente con un altro, in modo da mantenere più o meno costante il fattore di capacità k’, si ottiene una variazione del fattore di selettività a che consente la risoluzione dei picchi sovrapposti.

Giorgio Bonaga

SOLVENTE e° SOLVENTE e°pentano 0,00 dicloroetilene 0,49etere di petrolio 0,01 butanone 0,51esano 0,01 diossano 0,56cicloesano 0,04 acetone 0,56tetraclorometano 0,18 acetato di etile 0,58xilene 0,26 dimetilsolfossido 0,62toluene 0,29 acetonitrile 0,65clorobenzene 0,30 piridina 0,71benzene 0,32 iso-propanolo 0,82etere etilico 0,38 n-propanolo 0,82cloroformio 0,40 metanolo 0,95diclorometano 0,42 acido acetico 1,00tetraidrofurano 0,45 acqua eleva

ta

SERIE ELUOTROPICA PER ALLUMINA(*)

(*)per la silice i valori della forza eluente (e°) riferiti all’allumina vanno moltiplicati per 0,8.

Gior

gio

Bona

ga

a. ELUIZIONE ISOCRATICALa composizione della fase mobile rimane costante per tutto il tempo dell’eluizione.

b. ELUIZIONE A GRADIENTE La composizione della fase mobile varia durante l’eluizione (con aumento della percentuale del solvente più polare), allo scopo di separare tutti i soluti, anche quelli che hanno fattori di capacità (k’) molto simili.1. con fase mobile debole i soluti che interagiscono debolmente

con la fase stazionaria vengono separati ed eluiscono con tempi di ritenzione normali, ma quelli che interagiscono fortemente eluiscono con tempi di ritenzione eccessivi (con notevole allargamento dei picchi);

2. con fase mobile forte i soluti che interagiscono debolmente eluiscono rapidamente con tempi di ritenzione troppo ridotti (nel “tailing” del solvente), mentre quelli che interagiscono fortemente vengono separati ed eluiscono con tempi di ritenzione normali.

3. con fase mobile a gradiente di polarità si ottiene l’eluizione con i tempi di ritenzione ottimali per tutti i soluti.

Giorgio Bonaga

GRADIENTEDI SOLVENTE

SOLVENTEINTERMEDIO

SOLVENTEFORTE

SOLVENTEDEBOLE

1

1

1

1+2

2

2

2

3

3

3

3

4

4

4

4

5

5

5

6

6

6

EFFETTI DELLA FORZA DEL SOLVENTE SULLA SEPARAZIONE

Giorgio Bonaga

La LSC è una tecnica adatta per separare:• soluti con mol. wt < 5000• soluti solubili in solventi non polari• soluti omologhi• soluti isomeri

Attualmente la LSC viene molto utilizzata nei processi di estrazione (SPE = Solid Phase Extraction) di microcomponenti da matrici complesse di mezzi acquosi, anche grazie alla vasta gamma di adsorbenti solidi a base di silice funzionalizzata (fase inversa, fase diretta, scambio ionico), piuttosto che nei processi di separazione.

Giorgio Bonaga

HRR R

H HRH

cis trans

t (min)

• COLONNA: 1000 mm x 3,0 mm i.d.• FASE STAZIONARIA: silice pellicolare 10 mm• ELUIZIONE ISOCRATICA: CH2Cl2/iso-C8H18=50/50• DETECTOR: UV 254 mm

1

32

0 10 20 30

1trans-3,4 difenil-3-acetil-

pirazolina

2 cis-3,4 difenil-3-acetil-pirazolina

SEPARAZIONE DI ISOMERI GEOMETRICI

NN

COOCH3

NN

COOCH3

Giorgio Bonaga

SEPARAZIONE DI XANTINE ESTRATTE DA SIERO DI SANGUE

1

t (min)

3

2

0 5 10

4

• COLONNA: 50 mm x 4,6 mm i.d.• FASE STAZIONARIA: silice 5 mm• ELUIZIONE ISOCRATICA: CHCl3/C7H16/C2H5OH/CH3COOH=56,3/37,6/6,0/0,1• DETECTOR: UV 254 mm

1 2caffeina teofillina

3 4teobromina N-idrossietil-teofillina

N

N N

NO

O

H3CCH3

CH3

N

N N

NO

O

H3CH

CH3

N

N N

NO

O

HCH3

CH3

N

N N

NO

O

H3CCH2CH2OH

CH3

Gior

gio

Bona

ga

B) CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE(Liquid Liquid Chromatography)

FASE MOBILE: liquidoFASE STAZIONARIA: liquido (su supporto solido inerte o a fase legata)

La separazione si basa sulla ripartizione del soluto tra la fase mobile liquida e la fase stazionaria (liquido su supporto solido inerte o film di gruppi organici legati chimicamente al supporto solido inerte). Questa distinzione comporta una prima classificazione della LC di partizione:

a fase legata (BPC = Bonded Phase Chromatography) a fase non legata (LLC = Liquid Liquid Chromatography)

Giorgio Bonaga

CROMATOGRAFIA A FASE LEGATA (BPC)Ha quasi completamente sostituito la più tradizionale cromatografia liquido-liquido (con la quale si ha perdita di fase stazionaria ed è difficile operare con eluizioni a gradiente). I gruppi organici che si fissano chimicamente sulla superficie del supporto possiedono una certa mobilità conformazionale che conferisce loro un comportamento simile a quello di un liquido (stato pseudo-liquido).La BPC può essere:

FASE MOBILE: polare (H2O, CH3OH, CH3CN)

1. IN FASE INVERSA FASE STAZIONARIA: non polare ( Si-O-SiR3) SOLUTI: non polari

FASE MOBILE: non polare (nC6H14, Et2O, CHCl3)

2. IN FASE DIRETTA FASE STAZIONARIA: polare ( Si-OH) SOLUTI: polari Giorgio Bonaga

fase mobile(polare)

fase stazionaria(non polare)

CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSAReverse Phase Chromatography (RPC)

Si

Giorgio Bonaga

Si

Si

SiSi

Si

Si

fase mobile(non polare)

CROMATOGRAFIA IN FASE DIRETTANormal Phase Chromatography (NPC)

fase stazionaria(polare)

Giorgio Bonaga

Si

Si

Si

A BC

A B C

ABC

ABC

CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA CROMATOGRAFIA IN FASE DIRETTA

POLARITA’ DEI SOLUTI: A >B > C

FASE MOBILE: elevata polarità FASE MOBILE: bassa polarità

FASE MOBILE: media polarità FASE MOBILE: media polarità

Giorgio Bonaga

1. CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA(Reverse Phase Chromatography)

a. FASE STAZIONARIASi utilizzano materiali diversi:• silice• allumina• carbone pirolitico• polimeri (polietilene) e copolimeri (stirene/divinilbenzene)La silice è il materiale più utilizzato perché la tecnologia attuale consente di ottenere particelle di dimensioni e porosità controllate, oppure particelle con uno strato pellicolare poroso. Inoltre è il materiale che può essere più facilmente funzionalizzato.

silice allumina carbone pirolitico resine

Gior

gio

Bona

ga

FUNZIONALIZZAZIONE DELLA SILICE Il trattamento con HCl a riflusso produce l’idrolisi dei gruppi silossanici superficiali con formazione di gruppi silanolici, mentre con il riscaldamento a 200°C si elimina l’acqua di idrolisi senza produrre la ricondensazione dei gruppi silanolici in gruppi silossanici. La superficie porosa del supporto consente una migliore adesione della fase legata.

Ai gruppi silanolici così ottenuti si possono legare composti organici diversi, con quattro meccanismi di reazione differenti (funzionalizzazione).

SiO O

O

Si

SiO

SiO

O Si OO

SiOOO

HH

OSi

OO

H

H

O H

HO

O

H

O

O

silice al microscopioelettronico

gruppo silanolico poro

gruppo silossanico

Giorgio Bonaga

+

Si OH HO CH3 Si O CH3

+ HCl + SO2

1. Esterificazione (fase etere)La silice viene riscaldata a riflusso in sospensione con alcoli alifatici (decanolo) anche se, essendo una reazione di equilibrio, si forma solo parzialmente il decanossi-silicato (peraltro instabile).

2. Dialchilamminazione (fase dialchilammina)La silice viene riscaldata a riflusso in sospensione con cloruro di tionile e il cloro-silicato che si forma viene fatto reagire con un’ammina secondaria. Il dialchilammino-silicato che si forma è più stabile de decanossi-silicato, ma in ambiente acido si ha la protonazione dell’ammina con scissione del legame Si-N.

Si OHCl

SCl

O+

Si Cl

Si Cl +

HNR

RSi N

R

R+ HCl

Giorgio Bonaga

3. Alchilazione (fase idrocarburica)Il cloro-silicato ottenuto in condizioni anidre viene fatto reagire in condizioni anidre con reattivo di Grignard; seppure con una resa bassa si forma un alchil-silicato.

4. Silanizzazione (fase silossanica)La silice, in sospensione con un solvente non polare anidro (esano o toluene), viene fatta reagire a riflusso con un agente silanizzante, mantenendo la miscela in ebollizione.

L’agente silanizzante, in realtà, può essere un trialchilclorosilano (R3SiCl), un dialchildiclorosilano (R2SiCl2) o un alchiltriclorosilano (RSiCl3). Il primo agente silanizzante produce una funzionalizzazione a fase monomerica (i sostituenti alchilici sono sullo stesso atomo di silicio), con una resa del 50% circa. Il secondo e terzo agente silanizzante producono una funzionalizzazione a fase polimerica (i sostituenti alchilici sono su atomi di silicio vicinali), con un resa rispettivamente del 100% e del 50% circa. La funzionalizzazione a fase monomerica conferisce una maggior mobilità conformazionale alla catena idrocarburica e dunque un più spiccato carattere [pseudo]liquido alla fase legata.

+

+ HCl

Si Cl + R-Mg-Br

+ Cl-Mg-BrSi R

SiClRR

RSi O Si

R

R RSi OH

Si OH

Si OH

Si OH

Si OH

TRIALCHILCLOROSILANO(fase monomerica)

Giorgio Bonaga

R

ClSi R

R

R

ClSi R

R

R

ClSi R

R

Si OH

Si OH

Si OH

Si OH

RSi

RR

RSi

RR

DIALCHILDICLOROSILANO(fase polimerica)

Giorgio Bonaga

Si OH

Si OH

Si OH

Si OH

RCl

SiRCl

RCl

SiRCl

Si OH

Si OH

Si OH

Si OH RSi

R

RSi

R

Si OH

Si OH

Si OH

Si OH

ALCHILTRICLOROSILANO(fase polimerica)

Giorgio Bonaga

R

ClSi

Cl

Cl

R

ClSi

Cl

Cl

Si OH

Si OH

Si OH

Si OH

RSi

Cl

RSi

ClOH

OH

idrolisi

La funzionalizzazione della superficie di silice conferisce proprietà caratteristiche alla fase stazionaria, ma la grande polarità dei gruppi silanolici residui (da 8 mmoli/m2 la silanizzazione li riduce a 4 mmoli/m2, con una resa di circa il 50%) può perturbare queste proprietà acquisite. È il motivo per cui si opera una definitiva silanizzazione (“end-capping” o “capping off”) con trimetilclorosilano (TMS), che funzionalizza tutti i gruppi silanolici residui con un agente a fase monomerica.

EsempioLa prima silanizzazione con ottadecildimetilclorosilano e l’end-capping con trimetilclorosilano producono una silice funzionalizzata:

50% da silanizzazione

50% da “end capping”

I materiali alternativi alla silice (carbone attivo, polietilene, copolimeri stirene/divinilbenzene) sono non polari e dunque non consentono le reazioni di funzionalizzazione.

Si O SiCH3

CH3CH3

Si O SiCH3

CH3CH3

I gruppi legati alla silice che più frequentemente vengono utilizzati sono:

CH2CH2

CH2CH2

CH2CH2

CH2CH2

CH2CH2

CH2CH2

CH2CH2

CH2CH2

CH2CH3

CH2CH2

C N

CH2CH2

OH

CH2CH2

CH2CH2

CH2CH2

CH2CH3

CH2CH2

NH2

CH3CH2

ottadecil -

ottil -

etil -

fenil -

cianoetil -

idrossietil -

amminoetil -

A FASE DIRETTA

POLARITA’

La conformazione delle catene dei gruppi legati può essere a palizzata, a pelliccia ed irregolare. La più efficiente è quella a pelliccia, ma in realtà la disposizione dipende dalla fase mobile impiegata. Ad esempio, con C18 e fase mobile non polare si ottiene quella a pelliccia , mentre con fase mobile polare si ottiene quella a palizzata. Ovviamente con fase mobile fatta di solventi non polari/polari si passa da una conformazione all’altra.

CH2

CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH3

CH2

CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH3

CH2

CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH3

CH2

CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH3

CH2

CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH3

CH2

CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH3

CH2

CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH3

CH2

CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH3

CH2 CH

2CH2 CH

2CH2 CH

2CH2 CH

2CH2 CH

2CH2 CH

2CH2 CH

2CH2 CH

2CH2 CH

3

CH2 CH

2CH2 CH

2CH2 CH

2CH2 CH

2CH2 CH

2CH2 CH

2CH2 CH

2CH2 CH

2CH2 CH

3

CH2

CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH3

CH2

CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH2CH

2 CH3

a palizzata a pelliccia irregolare

La fase stazionaria a base di silice nella cromatografia di ripartizione deve essere meno polare dei soluti, ma se la fase è legata dev’essere simile ai soluti.

La ripartizione è un fenomeno complesso di competizioni tra le interazioni soluto/fase stazionaria e soluto/fase mobile, il cui bilancio finale (unitamente alla temperatura e alla pressione di esercizio) determinano i tempi di ritenzione dei soluti e, in definitiva, la possibilità di separare i componenti di una miscela.

SOLUTI FASE STAZIONARIAcomposti aromatici silice fenilica

dioli e zuccheri silice cianoetilicasilice amminoetilica

alcoli a basso peso molecolare

silice-C8silice-C2

acidi grassi silice-C18

INTERAZIONI SOLUTO/SOLVENTEI tre soggetti attivi nel processo di separazione sono il soluto, la fase mobile e la fase stazionaria. Le interazioni tra soluto/solvente sono preliminari alla comprensione dei principi che governano la scelta della composizione ottimale della fase mobile per separare i componenti di una miscela.1. interazioni dipolo istantaneo/dipolo istantaneo: dovute

all’induzione tra solventi non polari (es.: cloroformio) e soluti non polari (es.: decano).

2. interazioni dipolo permanente/dipolo permanente: dovute all’induzione tra solventi polari (es.: acetonitrile) e soluti polari (es.: aldeide).

CHCl3d+ d-

CH3-(CH2)8-CH3

d+ d-

CH3-C Nd-d+

d+

d-CH O

R

=

Giorgio Bonaga

3. legami idrogeno: dovuti all’interazione tra un solvente (es.: acqua) contenente un atomo di idrogeno legato a un atomo ad elevata elettronegatività (N, O, F) e un soluto (es.: ammina secondaria) contenente un atomo ad elevata elettronegatività (N, O, F) con una coppia di elettroni di non legame.

4. interazioni dielettriche: dovute all’interazione tra solventi ad elevata costante dielettrica (e) e soluti elettricamente carichi (ioni positivi e negativi).

O H N..d- d+

d+

H

RH

R

d-

+

d+

d-

d+d-d+ d-

d+d-

d+d-

Giorgio Bonaga

b. FASE MOBILENella LC di ripartizione è il fattore di capacità k’ quello più facile da modificare perché k’ dipende essenzialmente dalla composizione della fase mobile. Il “range” ideale del k’ è compreso tra 2 e 10, ma per miscele molto complesse l’intervallo può estendersi da 0,5 a 20. Solo dopo aver ottimizzato il k’ si può agire sul fattore di selettività a (a questo punto modificando la sola fase stazionaria) e, infine, sul fattore di efficienza N (utilizzando una colonna di lunghezza maggiore o di diametro interno minore).Nella cromatografia liquida di ripartizione oggi più utilizzata, la RPC (fase stazionaria non polare, fase mobile polare, soluti non polari) l’equilibrio che determina la ritenzione dei soluti è basato sulla “teoria solvofobica”, secondo la quale i soluti “idrofobici” si ripartiscono tra la fase stazionaria e la fase mobile non per effetto delle interazioni attrattive con la fase stazionaria, ma per le interazioni repulsive con la fase mobile. Più precisamente, i soluti poco polari che hanno una repulsione verso la fase mobile occupano lo spazio minimo disponibile nella fase mobile e conseguentemente tenderanno a trasferirsi nella fase stazionaria. Meno polare è il soluto e più polare è la fase mobile tanto maggiore è il trasferimento del soluto nella fase stazionaria e tanto maggiore sarà il suo tempo di ritenzione.

Giorgio Bonaga

Giorgio Bonaga

fase mobile polare RPC: TEORIA SOLVOFOBICA

fase stazionaria non polare

soluto poco polare (IDROFOBICO)

repulsione soluto/fase mobile

I solventi della fase mobile che interagiscono in modo rilevante con i soluti sono detti “forti” (in termini di maggiore polarità). Nella cromatografia di partizione la “forza” del sovente (che è definita “forza dell’eluente” o e°) nella SLC - è detta indice di polarità (P’). Snyder definisce questo indice come:“la solubilità di una sostanza in tre solventi: diossano (accettore di protoni con basso momento dipolare), nitrometano (accettore di protoni con elevato momento dipolare) e alcol etilico (donatore di protoni con elevato momento dipolare)”

Giorgio Bonaga

O

OH+

O

OH

+

+

CH3 NO-O+

+ H++

CH3 NOH

O

CH3 CH2 OH CH3 CH2 O-H++

m = 0,45 D

m = 1,69 D

m = 3,50 D

La fase mobile deve, idealmente, possedere 3 requisiti:1. bassa viscosità, per evitare pressioni di esercizio troppo elevate;2. punto di ebollizione sufficientemente elevato, che ne eviti la

volatilizzazione;3. polarità maggiore dei soluti, per evitare dei tR troppo elevati

La serie eluotropa dei solventi e le loro principali proprietà chimico-fisiche sono riportate nella tabella successiva (in rosso i solventi più utilizzati nella LC di partizione).

SOLVENTE INDICE DI RIFRAZIONE

VISCOSITA’(cP)

PUNTO DI EBOLLIZIONE

(°C)

INDICE DI POLARITA’

(P’)fluoroalcani 1,27-1,29 0,4-2,6 50-174 < - 2n-esano 1,372 0,30 69 0,1cicloesano 1,423 0,90 81 0,21-clorobutano 1,400 0,42 78 1,0tetraclorometano 1,457 0,90 77 1,6i-propiletere 1,365 0,38 68 2,4toluene 1,494 0,55 110 2,4etere etilico 1,350 0,24 35 2,8tetraidrofurano 1,405 0,46 66 4,0cloroformio 1,443 0,53 61 4,1etanolo 1,359 2,08 78 4,3acetato di etile 1,370 0,43 77 4,4diossano 1,420 1,20 101 4,8metanolo 1,326 0,54 65 5,1acetonitrile 1,341 0,34 82 5,8nitrometano 1,380 0,61 101 6,0glicole dietilenico 1,431 16,5 182 6,9acqua 1,333 0,89 100 10,2

Considerando che l’indice di polarità varia da – 2 (fluoroalcani) a 10,2 (acqua), si può ottenere qualunque indice di polarità entro questi due estremi, miscelando solventi diversi.Per una fase mobile binaria (A e B) l’indice di polarità è espresso dalla formula:

dove: P’A = indice di polarità del solvente A P’B = indice di polarità del solvente B % = percentuali in volume di A e B nella miscela

Per ottimizzare il fattore di capacità k’ si agisce sull’indice di polarità P’ della fase mobile: una variazione di 2 unità di P’ produce approssimativamente la decuplicazione di k’, come si deduce dalla relazione:

Dove e sono i valori iniziali e finali di k’ di un dato soluto e e sono i corrispondenti valori di P’. Si può facilmente verificare che se - = 2, il fattore di capacità = 10 . Infatti:

Giorgio Bonaga

Se la polarità della fase mobile è troppo prossima a quella dei soluti (oppure se le interazioni tra i soluti e la fase stazionaria sono troppo deboli), si avranno dei k’ prossimi a 1 ed i soluti eluiranno in modo così veloce da penalizzare la separazione.

Se la polarità della fase mobile è troppo diversa da quella dei soluti (oppure se le interazioni tra i soluti e la fase stazionaria sono troppo forti), si avranno dei K’ > 10 ed i soluti eluiranno così lentamente da produrre un allargamento ed abbassamento dei picchi che penalizza la sensibilità.La conclusione ovvia è che la polarità dei soluti deve essere

intermedia tra quella della fase stazionaria e quella della fase mobile. Infatti:

• se polarità soluti > polarità fase mobile la affinità per fase mobile > affinità per fase stazioanria (tR= t0)

• se polarità soluti < polarità fase mobile la affinità per fase stazionaria > affinità per fase mobile (tR )

Con l’eluizione a gradiente, piccole variazioni della composizione della fase mobile possono produrre grandi variazioni dei tR dei soluti e questo è il motivo principale per formulare una prima considerazione: la straordinaria influenza della polarità della fase mobile sul risultato del processo separativo rende la LC la tecnica di separazione più complessa e sempre suscettibile di continue ottimizzazioni.

Giorgio Bonaga

SELETTIVITA’ DELLA FASE MOBILESe si diagramma il valore del logaritmo di k’ in funzione della percentuale di solvente organico presente nella fase mobile (es.: acqua/metanolo), si ottiene una retta il cui andamento dimostra che all’aumento della percentuale di metanolo diminuisce il valore di k’ e pertanto diminuisce il tempo di ritenzione di un generico soluto A. L’intercetta sull’asse y è il logaritmo di k’ in acqua pura, quella sull’asse x il logaritmo di k’ in metanolo puro.

Un altro soluto B darà origine ad una retta di diversa pendenza, in relazione all’intensità delle interazioni soluto/solvente. Giorgio Bonaga

% CH3OH

ln k’

soluto A

soluto B

x

y

L’espressione che correla i fattori di capacità k’ della fase mobile e dell’acqua è:

k’ fase mobile = k’acqua . e S (%)

Con: e = costante di Nepero (= 2,718) S = costante di selettività della fase mobile per un dato

soluto

In forma logaritmica l’espressione diventa:

ln k’ fase mobile = ln k’acqua - S (%)

ESEMPIOSe la k’ dell’acqua è 10, qual’è la k’ del metanolo ?

ln k’met = ln 10 – 4 /100 = 2,303 – 0,04 = 2,253 da cui k’met = 9,52

Giorgio Bonaga

SOLVENTE Smetanolo 3-4acetonitrile 5-6tetraidrofurano 8-9

Maggiore è S maggiore è la differenza di polarità tra il solvente organico e l’acqua. In una miscela binaria, a parità di composizione percentuale del solvente organico, quello con S maggiore determina tR minori. Giorgio Bonaga

k’10

S

9,5

H2O CH3OH CH3CN THF

9,529,42

9,15

1,00

ESEMPIOtR (H2O/CH3OH, 50% v/v) > tR (H2O/CH3CN, 50% v/v) > tR(H2O/THF, 50% v/v)

È anche possibile stabilire quale composizione devono avere due fasi mobili diverse, costituite da acqua e solvente organico, per avere lo stesso k’.

% solvente organico A = %solvente organico B . SA/SB

ESEMPIOPer avere lo stesso k’ di una soluzione al 10% di THF in acqua, quale deve essere la percentuale di metanolo in acqua ?

% metanolo = 10% . 9/4 = 22,5 %

Utilizzando le differenze di selettività S per soluti diversi è possibile ottimizzare la separazione dei costituenti una miscela.Una grande selettività S indica anche che ad una piccola variazione della composizione percentuale di quel solvente corrisponde una grande variazione del fattore di capacità k’.

Giorgio Bonaga

ESEMPIOSupponiamo di operare con una colonna riempita con fase stazionaria a fase legata C18 (non polare) e che la miscela da separare sia costituta dai seguenti soluti (in ordine di polarità crescente):

• eluendo con acqua:metanolo = 76:24 (P’ 9) si ottiene il tracciato 1, nel quale è evidente l’eccessiva separazione dei picchi e i tR troppo elevati, a causa di una percentuale troppo alta di acqua.

• eluendo con acqua:metanolo = 37:63 (P’ 6) o acqua:metanolo = 18:82 (P’ 7) si ottengono i tracciati 2 e 3 nei quali è altrettanto evidente la scarsa separazione dei picchi e i tR troppo bassi, a causa di una percentuale troppo elevata di metanolo.

• Eluendo con acqua:metanolo = 57:43 (P’ 8) si ottiene il tracciato 4, dal quale si desume che il rapporto percentuale dei due solventi è ottimale, sia per la separazione dei soluti che per i loro tR.

N

NH

O

OH

CO OCH3NO2C

HOOH

1 2 3 4 5 uracile fenolo benzaldeide nitrobenzene benzoato di metile

Giorgio Bonaga

1

12345

2 3 4 5

10

0 10 20

30 40 50 60 70

acqua:metanolo = 76:24

(P’ = 9,078)

acqua:metanolo = 57:43

(P’ = 8,007)

acqua:metanolo = 37:63

(P’ = 6,987)

acqua:metanolo = 18:82

(P’ = 6,018)

1

1 2 3 4 5

4

12345

2

3

10

10 20

P’ TEMPI DI RITENZIONE1 2 3 4 5

9

1,6

9,8

23,0

37,0

68,0

6

1,7

1,8

1,9

2,0

2,1

7

1,4

2,3

3,0

3,8

5,0

8

1,3

4,2

7,0

12,0

18,0

Giorgio Bonaga

c. TEMPERATURAIn generale la temperatura ha scarsa influenza sulle separazioni nella cromatografia liquida. Pur tuttavia un aumento di T produce una diminuzione dei tR perché diminuisce l’affinità con la fase stazionaria.

L’aumento di temperatura determina anche la riduzione della viscosità della fase mobile e dunque, a parità di flusso, occorre meno pressione delle pompe.

Giorgio Bonaga

tR

(min)

20 40 60 80

T (°C)

3,6

3,0

2,4

Infine l’aumento di temperatura incrementa la velocità della diffusione e dei trasferimenti di massa; la prevalenza di questi ultimi produce un non trascurabile aumento del numero di piatti teorici della colonna.

Giorgio Bonaga

N

20 40 60 80

T (°C)

12000

8000

4000