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Lo stato della ricerca a livello internazionale per gli

Indici Globali di contaminazione

Dott.ssa Paola GrenniIstituto di Ricerca sulle Acque – C.N.R.

Roma

Corso di formazione

Metodologie complessive di screening per il monitoraggio delle acque sotterranee

Villa Umbra di Pila, Perugia, 15-16 Settembre 2005

Corso di formazione “Metodologie complessive di screening per il monitoraggio delle acque sotterranee”. Perugia,15-16 Settembre 2005

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INDICI GLOBALI

Cosa sono?

Parametri numerici

forniscono un’ informazione sintetica su un determinato fenomeno

Vengono elaborati a partire da più indicatori ambientali


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INDICI GLOBALIDI CONTAMINAZIONE

• Parametri numerici• derivano da un’analisi (chimica o biologica)• definiscono uno stato qualitativo globale (acque

sotterranee)• Evidenziano situazioni di contaminazione degli

acquiferi dovute alla presenza di inquinanti di svariata origine: industriale, civile od agricola.

• Sulla base dei risultati positivi ottenuti può essere impostata l’attività analitica di dettaglio.


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INDICI GLOBALI DI CONTAMINAZIONE nelle acque sotterranee

Possono essere di due tipi:

Chimici

Biologici

da un’Analisi Chimica dell’Acqua (es. Total Organic Halogen, TOX)

da un’Analisi Biologica:effetto di un inquinante (es. effetto tossico con Vibrio fischeri; ELISA)Analisi quantitativa di molecole biologiche (es. ATP)


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1. TOX - Total Organic Halogen: analisi dei composti organo-clorurati

2. Analisi della contaminazione microbiologica misurata con la concentrazione dell’ATP

3. Test E.L.I.S.A. (Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay): saggio immunoenzimatico

4. Effetto tossico con Vibrio fischeri: valutazione degli effetti tossici di microinquinanti organici ed inorganici


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1. TOX (TOTAL ORGANIC HALOGEN)- Somma di tutti gli alogeni (Cloruri, Bromuri, Ioduri) organici presenti in un campione d’acqua, (μg Cl org/L).- Da 1 analisi chimica in un solo parametro si ha l’insieme dei composti organici alogenati.- Può essere analizzato: strumentalmente o con un Kit (es. Kit LCK 390 del Dr B. Lange, Milano, Italia). Quest’ultimo fornisce una risposta analitica in tempi brevi, in situ.Grøn & Dybdahl, 1996, Environment International, 22: 325-329Gremm & Frimmel, 2000, Acta Hydrochimica et Hydrobiologica, 28: 202-211Wigilius et al., 1988, Chemosphere 17: 1985-1994EPA9020B, 1994EPA (Environmental Protection Agency) 9020B– Total organichalides (TOX). USEPA, 1982 Method 9020, total organic halides (TOX). APHA, 1985 Standard methods for examination of water and wastewater.ISO/DIS, 1988 Water quality determination of total organic halogens. Draft international standard, International Standardization Organization.


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Fonti di contaminazione acque da Cloro-derivati:

•Pratiche agricole: insetticidi ed erbicidi (es. diclorobenzene, atrazina, 2,4D, dieledrin);

•Attività industriale (es. cartaria dai processi di sbiancamentodella cellulosa);

•Trattamento di potabilizzazione delle acque negli acquedotti e negli effluenti domestici

Galassi et al., 1983, Acqua e Aria, 6: 601-606 Canova et al., 1989, Acqua quale futuro. GB (Ed.): 139 ppRicci, 1996, Biologi Italiani, 11: 38-40 Hua-Wu et al., 1997, Water Science and Technology, 35: 77-84Schulz et al.,1998Water Science and Technology, 37: 303-309Sansebastiano et al. 1995 - Water Research, 29: 1207-1209


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Il loro uso diffuso, associato alla potenziale o provata tossicità ha portato, negli ultimi decenni, ad un interesse crescente verso il loro studioJuhler et al., 2001 - Water Research, 35: 1371-137; Viganò et al., 2003 - Water Research, 37: 501-518Wensen et al., 1990 - Ambio, 19: 36-38

Borch et al., 2003 - Chemosphere, 51: 143-152.Alborzfar et al., 2001 - Journal of Environmental Quaity, 30: 200-209.Sansebastiano et al., 1995 - Water Research, 29: 1207-1209.

La loro presenza negli ecosistemi acquatici è dovuta esclusivamente all’attività antropica.

Nelle acque sotterranee vi giungono a causa della loro tendenza ad essere lisciviati dal suolo, come parentali o come prodotti di trasformazione


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Preoccupano perché….

- estremamente tossici (anche a basse concentrazioni) Possono avere effetti mutageni, teratogeni o cancerogeni

- tendono a bioaccumularsi (liposolubili) e ad entrare nella catena alimentare fino ad arrivare agli organismi superiori, uomo compreso - persistenti nell’ambiente e scarsamente biodegradabili: tipica è la presenza di residui alifatici ramificati che rendono queste molecole particolarmente resistenti alla degradazione microbica.

Dodds et al., 1996, Epidemiology, 10: 233-237Goerke et al., 1979, Marine Pollution Bulletin, 10: 127-133


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Es sostanze cloroderivate analizzabili con TOX

DiossinePCB (bifenili policlorurati)Altre sostanzeBeta-HCHAlfa-HCHHCHLindano (Gamma HCH: hexachlorocyclohexane)EndrinDieldrinClordanoAldrinDDT, DDD, DDEinsetticidi

Terbutilazina, Terbutilazina desetilAtrazina, Atrazina desetilAlaclorErbicidiNOMETIPO


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Diossine

PCB ( bifenili policlorurati): X può essere H o Cl.

Alaclor


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DIOSSINE• gruppo di sostanze chimiche etero-aromatiche

polialogenate (es. Diossina Seveso 2,3,7,8-p-tetraclorodibenzodiossina 2,3,7,8-TCDD)

• vengono prodotte solo in piccolissime quantità• la loro presenza nell'ambiente in genere non è dunque

legata alla produzione intenzionale• altamente lipofile, sostanzialmente insolubili in acqua• molto stabili chimicamente e fisicamente • persistenti nell'ambiente


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P C B (Bifenili Poli Clorinati)

• sostanze alogenate provenienti dalla clorurazione del bifenile

• prodotti industrialmente su larga scala e per molti anni; diversi utilizzi: fluido dielettrico (non infiammabili, bassa cond. termica, elevata costante dielettrica), pigmenti, idrorepellenti, plastificanti, gomma, ecc.

• 209 cogeneri, livello di clorinazione da 1 a 10• produzione vietata da anni 80‘• effetti: analoghi diossina ("dioxin-like PCB“), 12 PCB

considerati tossici• contengono come contaminanti le diossine. Le

producono per combustione 1000°C, usati come markers per la ricerca delle diossine.


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• I composti organici clorurati sono i più comuni inquinanti delle acque sotterranee

• il loro numero è elevato• la determinazione delle singole sostanze è piuttosto

complessa, oltre ad essere onerosa• inoltre solo per una parte di essi esistono metodiche

disponibili (analisi cromatografica in fase liquida o gassosa/spettrometro di massa: LC/MS, GC/MS; HPLC) che garantiscono risultati soddisfacenti

• la tossicità di tali sostanze può derivare anche da un’azione sinergica le une con le altre

• l’utilizzo di un indice come il TOX permette di determinare la loro presenza in un “parametro globale”

Tredoux et al., 2004 Water S.A., 30 (Special Edition): 114-119;Pruskin, 1990 Waste Water and Quality Assurance, Vol.2. ASTM STP 1062


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NORMATIVA EUROPEA•Water Framework DirectiveEuropean Parliament and Council Directive 2000/60/EC of 23 Oct. 2000 establishing a framework for Community action in the field of water policy•Priority Substances DecisionEuropean Parliament and Council Decision No. 2455/2001/EC of 20 November 2001 establishing the list of priority substances in the field of water policy•Diversi Stati Europei già tengono conto di tale parametro come indice di inquinamentoil metodo del TOX viene già usato da vari anni come monitoraggiodella qualità delle acque sotterranee

Grøn C., Dybdahl H.P., 1996, Environment International, 22: 325-329Jekel M.R., Roberts P.V., 1980, Environmental Science & Technology, 14: 970-975 (California – acque di scarico)Gremm Th. J., F. H. Frimmel, 2000, Acta Hydrochimica et Hydrobiologica, 28: 202-211 (Germania – acque superficiali)


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NORMATIVA

D.lgs 152/99 All. 4 Tab 21: Parametri addizionali; Tab. A: Scarichi in acque superficiali, concentrazione massima ammissibile di 0.05 mg/L per i pesticidi clorurati e di 1 mg/L per i solventi clorurati.

D.lgs 367/2003 (attuativa del 2000/60/EC e Decision No. 2455/2001/EC) Allegato A

(Accordo Conferenza Stato-Regioni-Province 8 maggio 2003 - Adozione dei Piani nazionali triennali di sorveglianza sanitaria ed ambientale su eventuali effetti derivanti dall'utilizzazione dei prodotti fitosanitari)


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(1) in questo parametro sono compresi tutti i composti organici usati come biocidi (erbici, insetticidi, fungicidi, acaricidi, alghicidi, nematocidi ecc.);(2) si intendono in questa classe i seguenti composti specifici: benzo(b)fluorantene,benzo(k)fluorantene, benzo(ghi)perilene, indeno(1,2,3-cd)pirene

Inquinanti inorganici µg/L Inquinanti organici µg/L

Alluminio ≤ 200 Composti alifatici alogenati totali

10

Antimonio ≤ 5 di cui:Argento ≤ 10 - 1,2-dicloroetano 3Arsenico ≤ 10 Pesticidi totali (1) 0,5

Bario ≤ 2000 di cui:Berillio ≤ 4 - aldrin 0,03Boro ≤ 1000 - dieldrin 0,03

Cadmio ≤ 5 - eptacloro 0,03Cianuri ≤ 50 - eptacloro epossido 0,03

Cromo tot. ≤ 50 Altri pesticidi individuali

0,1

Cromo VI ≤ 5 Acrilamide 0,1Fluoruri ≤ 1500 Benzene 1Mercurio ≤ 1 Cloruro di vinile 0,5Nichel ≤ 20 IPA totali (2) 0,1Nitriti ≤ 500 Benzo (a) pirene 0,01

Piombo ≤ 10Rame ≤ 1000

Selenio ≤ 10Zinco ≤ 3000

PARAMETRI ADDIZIONALI - Tab 21 All.4 D.lgs 152/99


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D.lgs 367/2003

Definisce gli di standard di qualita' nell'ambienteacquatico per le sostanze pericolose (ai sensi del D.lgs. 11 maggio 1999, n. 152).

Elenco di sostanze prioritarie in materia di acque, (implementa la direttiva 2000/60/CE)

Dal 1° gennaio 2021 le concentrazioni delle sostanze individuate con la lettera «PP» nell'allegato A nelle acque superficiali devono tendere ai valori del fondo naturale per le sostanze presenti in natura e, per le sostanze sintetiche antropogeniche, allo zero sulla base anche dei criteri riportati alla parte generale relativa alla matrice acquosa


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D.lgs 367/2003ALLEGATO A

TABELLA 1 Standard delle qualità delle acque

METALLITabella 1.1

ORGANO METALLITabella 1.2

IDROCARBURI POLICICLICI AROMATICITabella 1.3COMPOSTI ORGANICI VOLATILI (VOC)Tabella 1.4 NITROAROMATICITabella 1.5

ALOFENOLITabella 1.6

ANILINE e derivatiTabella 1.7

PESTICIDITabella 1.8COMPOSTI ORGANICI SEMIVOLATILITabella 1.9

ALTRI COMPOSTITabella 1.10


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Fitofarmaci - Accordo 8 maggio 2003

• Il piano riguarda il triennio 2003 – 2005 Obiettivo principale:• valutare l’esposizione (presenza e livello

delle concentrazioni) di residui di prodotti fitosanitari nelle acque superficiali e sotterranee, per una stima del rischio ambientale determinato da queste sostanze.


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Rapporto APAT 2003

• Nelle acque sotterranee sono risultati positivi 346 punti di monitoraggio (19,6% del totale) e 456 campioni (14,2% del totale)

• Nelle acque sotterranee le sostanze più rilevate sono: atrazina, terbutilazina, desetil-atrazina,desetil-terbutilazina, simazina, metolaclor, bentazone, esazinone, oxadiazon, bromacile


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TIPO NOME

2008 2015 % Conc. Max (μg/l)

% Conc. Max (μg/l)

Atrazina, 0.05 0.01 7% 0.85 7-8% 2.2 Atrazina desetil

- - 4% 9% 0.87

Terbutilazina - - 23% 4.09 5.20% 1.1Terbutilazina desetil

- - - 2.1 9% 0.74

ELENCO SOSTANZEPRIORITARIE DECRETO 367/2003(μg/l)

Rapporto 2003 APAT: FREQUENZA DI RILEVAMENTO

Acque superficiali Acque sotterranee

Erbicidi

Alaclor 0.1 0.03 2-3% 1.86 0.50% 0.4


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TIPO NOME

2008 2015 % Conc. Max (μg/l)

% Conc. Max (μg/l)

DDT, 0.00002 0.00002 0.4 0.02 0DDD “ “ DDE “ “ 4.8 0.009 0Aldrin 0.0001 0.00005 0.1 0.01Clordano 0.0006 0.00006 0 0Dieldrin 0.0001 0.00005 0.15 0.04Endrin 0.0006 0.00006 0.09 0Lindano (Gamma HCH: hexachlorocyclohexane)

0.01 0.001 0 0

HCH 0.04 0Alfa-HCH 0.002 0.0002 0 0Beta-HCH 0.002 0.0002 0 0




insetticidi


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TIPO NOME

2008 2015 % Conc. Max (μg/l)

% Conc. Max (μg/l)

PCB (bifenilipoliclorurati)

0.00006

Diossine (neisedimenti) µg/kg 1,5 X 10-3

Altre sostanze





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2. ANALISI della contaminazione batterica tramite misura dell’ ATP in bioluminescenza

•Obiettivo: testare la presenza di batteri patogeni (coliformi totali e fecali) nelle acque•Metodo classico: tecniche di conta su piastra, metodo UFC•Limiti del metodo ufficiale: durata temporale dipendente dai tempi richiesti per la crescita batterica e necessità di strutture di laboratorio (camere di incubazione a temperatura controllata) •Alternativa analisi ATP: saggio biologico• risposta in funzione della carica batterica presente nel campione d’acquaVantaggi:• svolta in situ (strumentazione trasportabile e maneggevole) • tempi brevi di esecuzione


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ATP (adenosina trifosfato) è una molecola che si trova in ogni cellula vivente che degenera rapidamente negli organismi morti.

Tale molecola gioca un ruolo fondamentale nel metabolismo delle cellule, essendo il donatore universale di energia per le reazioni metaboliche.

L’ATP è una molecola organica utilizzata da tutti gli organismi per accumulare energia, ed in ogni organismo esiste una quantità nota di ATP.

La misura dell’ATP indica la quantità di organismi viventi presenti nel campione


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Principio del test di bioluminescenza:

Misura dell'ATP presente nelle cellule metabolicamente attive utilizzando l'enzima luciferasi. L’enzima catalizza la formazione di luce dall'ATP e dalla luciferina secondo la reazione:

Mg2+

E +LH2+ATP E • LH2 • AMP + PP

E • LH2 • AMP + O2 E +ossiluciferina + CO2 + AMP+ luce

E = luciferasi LH = luciferina E • LH2 • AMP = complesso luciferiladenilatoPP = pirofosfato; AMP = adenosin-monofosfato

Strumento di misura: luminometro

L'intensità della luce emessa è correlata linearmente, alla concentrazione di ATP


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• La misura dell’ATP viene espressa come Unità di Luminescenza Relative (RLU), ed è in stretta relazione con le conte classiche su piastra che comunemente vengono effettuate per la determinazione di coliformi totali e fecali

Deninger & Lee, 2001, ATP assay. Field Analytical Chemistry and Technology, 5: 185-189

Delahaye et al., 2003, Water Research, 37: 3689-3696


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L’analisi dell’ATP in bioluminescenza si utilizza da molti anni per la stima della biomassa cellulare fatta in acque naturali

Zoppini A.M., 1990 – Adenosintrifosfato cellulare (ATP). Nova Thalassia, 11: 225-230

IRSA-CNR- APAT, 2003 – Determinazione dell’Adenosinatrifosfato. Metodi analitici per le acque. Istituto di Ricerca Sulle Acque (IRSA)-CNR, Agenzia

per la Protezione dell’Ambiente e per i Servizi Tecnici, APAT Manuali e Guide, 29/2003. Vol.3, sezione 9000: 1143-1147.

Manuale APAT-IRSA “Metodi Analitici per le Acque”Scaricabile dai siti:

http://www.irsa.cnr.it/Metodi

http://www.apat.it/site/it-IT/APAT/Pubblicazioni/Manuali_e_linee_guida


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Esempi di applicazioni pratiche controllo della qualità microbiologica :

valutare il carico biologico totaleHawroskyj & Holah, 1997, Trends in food Science & Technology, 8: 79-84.Deninger & Lee, 2001, Field Analytical Chemistry and Technology, 5: 185-189.

tossicità degli inquinanti nei fanghi attiviChu et al., 2001, Biotechnology and bioengineering, 75: 469-474.Dalzell & Christofi, 2002, Water Research, 36: 1496-1502.

misura della biomassa attiva nei filtri a carbone attivo usati nei trattamenti delle acqueMagic-Knezev & van der Kooij, 2004, Water Research, 38: 3971-3979


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3. E.L.I.S.A.(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Tecnica biologica di analisi immunoenzimatica

Determinazione colorimetrica del complesso antigene-anticorpo mediante enzyme-linked immunoassay (ELISA)


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Principio:• consente di individuare e quantificare un

composto target usando un anticorpo che lega solo o principalmente quella sostanza;

• si basa sulla competizione tra l’erbicida, a concentrazione nota legato ad un enzima (complesso enzima-coniugato) e quello presente nel campione.

• La quantificazione del pesticida presente nel campione d’acqua viene determinato per via colorimetrica, in quanto avviene una reazione colorimetrica tra il pesticida e l’enzima specifico;

• Determinazione delle densità ottiche dei campioni alla lunghezza d’onda di 450 nm con un semplice fotometro


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E.L.I.S.A.


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Vantaggi:adatta alla determinazione degli erbicidi e insetticidi più comunemente utilizzati in agricoltura e dei PAH (idrocarburi policiclici aromatici)particolarmente sensibile, semplice e veloce e selettiva nei confronti delle sostanze targetpermette di rilevare la presenza di pesticidi anche in concentrazione inferiore ai limiti di legge (0,1 µg/L)svolta in situLa selettività evita di effettuare procedure di separazione del pesticida dalla matrice, al fine di togliere le interferenze; la sensibilità del test aumenta se si effettua una pre-concentrazione del campione


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Applicazioni pratiche:

Gascón et al., 1995, Analytica Chimica Acta, 311: 357-364.Thacker & Casale, 1998, Analytica Chimica Acta, 376: 61-65. Touloupakis et al., 2005, Biosensors and Bioelectronics, 20: 1984-1992Banks & Hernandez, 2003 Talanta, 61: 257-265.Gabaldón et al., 2002, Journal of Chromatography A, 963: 125-136.Bartone et al., 1996, Acqua e Aria, 9: 793-799.Cao et al., 2005, Environment International, 31: 33-42Clegg et al., 1999, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47: 5031-5037. Manclús & Montoya, 1996, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44: 4063-4070.Brecht et al., 1998, Analytica Chimica Acta, 362: 69-79. Barceló et al., 1998, Analytica Chimica Acta, 376: 49-53.Nakata et al., 2001, Pest Management Science, 57: 269-277.Marco et al., 1995, Analytica Chimica Acta, 311: 319-329 Aga & Thurman, 1995 New frontier in agrochemical immunoassays. Kurtz D.A., Skerritt J.H., Stanker L (Eds.), Arlington, VA: AOAC International: 123-136.


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E.L.I.S.A.

• Gli erbicidi per i quali attualmente sono disponibili i kit di analisi sono le triazine, alachlor e gli erbicidi ureici


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4. EFFETTO TOSSICO CON Vibrio fischeriObiettivo: valutazione della presenza dei

microinquinanti negli ecosistemi delle acque sotterranee

Test ecotossicologico che utilizza un organismo bioindicatore, che ha la caratteristica di essere sensibile alle sostanze tossiche presenti anche in basse concentrazione.

Misura la risposta del bioindicatore ai composti biologicamente attivi


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Immagine al microscopio di Vibrio fischeri


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La bioluminescenza prodotta dal batterio marino Gram negativo Vibrio fischeri (Photobacterium phosphoreum) èmisurata tramite bioluminometro

La tossicità viene espressa come EC50 (concentrazione di un campione di acqua che causa la riduzione della luminosità al 50%), in un certo tempo di esposizione (5, 10, 15 o 30 min).

• Katsev, 2002, Applied Biochemistry and Microbiology, 38: 189-192


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Vantaggi…

• Il test fornisce informazioni che, oltre ad indicare la presenza di un microinquinante, valutano i suoi effetti negativi sul biota.

• Valuta il danno potenziale relativo agli effetti sinergici ed additivi dovuti alla contemporanea presenza di più sostanze tossiche nella matrice acquosa, anche se non forniscono indicazioni su quale sia specificamente la componente tossica presente.

• Richiede strumentazione relativamente semplice e facilmente trasportabile (anche in laboratori mobili)

• Fornisce indicazioni sulla presenza di sostanze tossiche non generalmente monitorate negli acquiferi (es. farmaci, composti della chimica di base, additivi alimentari ed metaboliti vari)

Keddy et al., 1995; Persoone et al., 2003


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Metodi:

Norm DIN38412, Part 341, 1992

ISO/DIS 11348.2, 1996

IRSA-CNR- APAT, 2003 – Metodo di valutazione della tossicità acuta con batteri bioluminescenti. Metodi analitici per le acque. Istituto di Ricerca Sulle Acque (IRSA)-CNR, Agenzia per la Protezione dell’Ambiente e per i Servizi Tecnici, APAT Manuali e Guide, 29/2003, Vol.3, sezione9000: 1003-1012.


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•Esempi di utilizzo:Screening di sostanze tossiche in diversi ambiti:

Acqua Bulich & Isenberg, 1981; Fernández et al., 1995, Hao et al., 1996; Ultzur et al., 2002; Chun et al., 1996

Sedimenti Svenson et al., 1996; Johnson & Long, 1998, Viganò et al., 2003; Blaise et al., 2004

Suolo

Galli et al., 1994; Brohon & Gourdon, 2000

Monitoraggio in continuo delle acqueChun et al., 1996 Resources, Conservation and Recycling, 18: 25-40


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CONCLUSIONIGli indici globali di contaminazione possono essere uno strumento valido per uno screening della qualità delle acque

TOXVibrio fischeri

Permettono di determinare la presenza di inquinanti non analizzati di routine (es farmaci) o inquinanti presenti in concentrazioni molto basseNon si possono sostituire a tutte analisi previste dal D.lgs ma, affiancate ad esse, danno informazioni integrative per la valutazione della qualità delle acque

In caso di “segnale positivo” suggeriscono che si dovranno effettuare analisi più specifiche anche su inquinanti “non previsti”


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CONCLUSIONI (2)

• Analisi della contaminazione batterica con misura dell’ ATP in bioluminescenza

• Analisi degli erbicidi con E.L.I.S.A.

•potrebbe sostituire in alcuni casi la conta batterica su piastra

•può essere utile quando non esistono tecniche alternative di analisi strumentale o quando è

richiesta una sensibilità di analisi molto alta


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Grazie per la vostra attenzione!

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