LEZIONE 8

Ingegneria cellulare:Metodi di manipolazione del genoma cellulare

Valeria Benedusi

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2011-12

Titolare del corso: Adriana Maggi

Ingegneria Cellulare

Modificazione del genoma di cellule in coltura mediante mutazioni del genoma

stesso o

integrazione di DNA esogeno

Finalità dell’ingegneria cellulare applicate alla

farmacologia

• Identificazione di bersagli di farmaci

• Screening di farmaci

•Produzione di proteine terapeutiche

• Terapia cellulare

Metodo ideale:

alta efficienza di trasferimento del

materiale geneticobassa tossicità per le celluleriproducibilità in diversi

esperimenti

TRANSFEZIONE II

Applicazioni

• Studio di struttura e funzione di geni

• Studio dei meccanismi di regolazione dell'espressione genica

• Produzione di proteine su larga scala

• Produzione di modelli animali per ricerca

• Terapia genica

La scelta del sistema cellulare 1.

• coltura primaria

• cellula immortalizzata

• linea tumorale

Scelta del sistema cellulare 2.

2. Efficienza di transfezione

3. Modificazioni post-traduzionali

4. Espressione di fattori di regolazione dell’espressione genica

5. Facilità di analisi immunologica o di purificazione della proteina (espressione di proteine omologhe)

1. Facilità di coltura e stabilità

Scelta del vettore per ingegneria cellulare

La scelta del vettore

Determinata dal tipo di sistema che si vuole generare:

1. iperespressione proteica

2. espressione regolata per lo studio della funzione del gene, per produzione limitata nel tempo

3. studio della regolazione della espressione di un gene

VETTORE IDEALE

• Tropismo di espressione: per garantire la localizzazione del transgene sia a livello trasduzionale (il vettore raggiunge cellule specifiche) che a livello trascrizionale (il gene viene espresso solo in alcune cellule).

• Durata di espressione: per far sì che la terapia duri nel tempo.

• Livello di espressione: possibilmente regolabile.

• Efficacia clinica: test funzionali su modelli animali.

• Scarsa tossicità.

• Adenovirus• Retrovirus• Virus adeno-associati• Lentivirus (derivati da HIV)• Herpesvirus

• Plasmidi nudi• Elettroporazione in vivo• Liposomi• Ammine, proteine cariche

positivamente

VETTORI PER TERAPIA GENICA Vettori virali:

Vettori non virali:

Vettori per ingegneria cellulare

sequenze per la replicazione in procariote

Cassetta di espressione

Polylinker

Promotore (virale, tess. specifico,inducibile , ecc.)

Modificazioni posttrascrizionali (Siti di: terminazione della trascrizione;

poliadenilazione; segnali di splicing )

Marcatori di selezione

Vettori di espressione: il vettore pCI-neo Promotore

virale

Introne chimerico

Polylinker

Poliadenilazione

Promotore T7 pol

Promotore T3 pol

Origine di replicazione del fago f1

Neo resistenzaPromotore virale

Poliadenilazione

Amp resistenza

E.Coli ori

T-antigen e cellule COS.

L’uso di cellule COS consente di ottenere alti livelli di espressione di proteine

esogene senza l’utilizzo di promotori virali forti. Il gene è

clonato in un plasmide che include l’origine di

replicazione virale di SV40. Le cellule Cos contengono, nel

loro genoma, il gene codificante per il T-antigen, una proteina che riconosce l’origine di replicazione di

SV40 e stimola una massiccia replicazione del plasmide.

Promotori inducibili: il sistema Tet-on/Tet-off

Utilizzando il sistema di regolazione trascrizionale dell’operone responsabile della tetraciclina-resistenza di E. coli è possibile regolare l’espressione di un transgene.

Il sistema è composto da un transattivatore chimerico che lega il tet-responsive-element TRE espresso in modo costitutivo (promotore virale o tessuto-specifico)

Il gene la cui trascrizione deve venire regolata è sotto il controllo di un promotore contenente TRE

E’ necessario cotransfettare un plasmide contenente il fattore di regolazione ed un plasmide contenente il

transgene sotto il controllo trascrizionale di un promotore responsivo alla tetraciclina.

Il sistema Tet-on/Tet-off

pCMV

tetR VP16 Tet-OFF

pCMV

rtetR VP16 Tet-ON

TRE Pmin CV Gene of interest

Transcription

Plasmidi codificanti

per l’elemento

di regolazione

Plasmide contenente

il transgene

Il sistema Tet-off basato sulla produzione della proteina transattivante tTA

(tetracycline-controlled transactivator protein)è represso in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina

In presenza di tetraciclina tTA si stacca da TRE e il gene non è più trascritto

In presenza di tetraciclina rtTA si lega a TRE e il gene viene più trascritto

Il sistema Tet-On basato sulla produzione della proteina transattivante rtTA

(reverse tetracycline-controlled transactivator protein)è indotto in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina

Metodi biochimiciCoprecipitazione con calcio fosfato

Adsorbimento mediante DEAE-destranoLipofezione

Metodi fisiciElettroporazioneMicroiniezione

Infezione con vettori virali

Scelta della tecnica di transfezione

Coprecipitazione con calcio fosfato

La coprecipitazione di aggregati calcio

fosfato-DNA sulla superficie cellulare favorisce

l’internalizzazione dell’acido nucleicoVantaggi: Molto semplice

Buona efficienza (5-40%)Piuttosto riproducibileEconomico

Svantaggi: Tossicità cellulare

Tecnicamente delicato, sono determinanti:Taglia e dimensioni del precipitatoVariazioni anche minime del pHNon funziona con alcuni tipi cellulari

DEAE-destranoPrimo metodo utilizzato per l’introduzione massiva di DNA

in un cellula eucariotica

Destrano: polisaccaride costituito da unità di D-glucosio che

associato a gruppi carichi positivamente DEAE (dietilamminoetile)

è in grado di legare i gruppi fosfato carichi negativamente del DNA e di mediarne l’ingresso

attraverso le membrane (endocitosi). Le cellule vengono preparate mediante shock osmotico con

glicerolo o DMSO Vantaggi: molto sempliceSvantaggi: poco efficiente

(elevata degradazione DNA, scarsa penetrazione nel nucleo)

solo trasfezioni transientiutilizzato in cellule ad elevata attività endocitotica

Lipofezione

Trasferimento di DNA mediato da liposomi

In particolari condizioni è possibile ottenere liposomi contenenti DNA

La struttura del doppio strato fosfolipidico facilita la fusione con la membrana cellulare ed il rilascio del DNA nel citosol

Buona efficienza

Scarsa citotossicità

Riproducibilità

DNADNA

Metodica vantaggiosa :• il DNA viene rilasciato efficientemente in diversi tipi cellulari• i liposomi sono semplici da utilizzare in quanto non richiedono

apparati o accorgimenti particolari

Lipofezione

Lipofezione con reagenti lipidici neutri

I liposomi sono delle sfere di membrane sintetiche che

possono essere riempite con DNA. Esse fondono

spontaneamente con le membrane cellulari

rilasciando il loro contenuto nel citoplasma. Sono

disponibile commercialmente dei kit per la semplice

preparazione dei liposomi.

Lipofezione con reagenti lipidici cationici

(LipofectamineTM, OligofectamineTM, CellfectinTM)Reagenti lipidici cationici in soluzione acquosa formano piccoli (100-400 nm) liposomi unilamellari. La superficie carica positivamente attrae il DNA (-). Il DNA non è propriamente “incapsulato” nel liposoma ma piuttosto legato alle sue superfici. Ogni plasmide si lega a 2-4 liposomi.

L’internalizzazione del costrutto è via endosomi e lisosomi.

Lipofezione con reagenti dendrimerici attivati

Particolari reagenti commerciali, definiti dendrimerici, possiedono un’architettura sferica, che si ramifica

radialmente da un core centrale e termina con gruppi amminici ionizzati.

Tali reagenti complessano il DNA in strutture compatte ottimizzando l’internalizzazione del DNA nella cellula.

Il complesso DNA-dendrimero possiede una carica netta di segno positivo, che favorisce il legame a recettori con carica negativa (ex. Glicoproteine

sialilate). Una volta all’interno della cellula, il reagente tampona il pH del lisosoma riducendo la degradazione

del vettore.

Transfezione con PEIMacromolecola organica con elevata capacità di cariche positive:ogni tre atomi c’è un gruppo amminico che può essere protonato

Il complesso PEI-DNA all’interno dell’endosoma si lega ai protoni stimolando l’ingresso degli ioni cloro, questo porta alla rottura dell’endosoma con conseguente rilascio del complesso nel citoplasma

Vantaggi: Favorisce il passaggio nucleo-citoplasmaEconomico

Svantaggi: Tossicità cellulareEfficienza non sempre elevata

ElettroporazioneLe cellule vengono concentrate,

miscelate con il DNA da transfettare e collocate in una

cella collegata a degli elettrodi. Un breve impulso elettrico apre in

maniera reversibile dei “buchi” nelle membrane cellulari. Il DNA entra nelle cellule che vengono

piastrate in terreno fresco.Vantaggi: Minore esposizione a endonucleasi

Svantaggi: Alta % di cellule che non sopravvi--vono al trattamentoAdatta a cellule con membrane particolarmente resistentiAdatta a cellule in sospensione

Microiniezione

Elevata efficienza (iniezione diretta nel nucleo)

Impossibile applicazione su larga scala

Grande manualità dell’operatoreApplicazioni particolari (topi transgenici, espressione di mRNA in cellule di Xenopus laevis)

Microiniezione

Esempio: generazione di topi transgenici mediante microiniezione di DNA nei pronuclei maschili

Iniezione di costrutti di espressione lineari, che si integrano sotto forma di concatameri a partire dai

primissimi stadi di sviluppo.

ATG *

Promotore Introne

1 2 3 4 5

Poly-ACDS

• Dopo la microiniezione gli embrioni vengono reimpiantati in femmine pseudogravide

• Gli animali nati da questi esperimenti devono essere analizzati per mezzo di Southern blotting o PCR per valutare se il transgene si è integrato e in quante copie.

• Gli animali transgenici (founders e/o loro discendenza) vengono successivamente analizzati per valutare se il transgene si esprime in tutte le cellule, ed eventualmente gli effetti fenotipici della sua espressione