2009 Il Progetto Genoma Umano (Shared)

Il progetto genoma umano

Come è cambiato il modo di fare biologiaLuca Gianfranceschi

Cosa è il genoma ?

L’insieme delMATERIALE GENETICO (DNA)

di una cellula o di un organismo

Rappresenta il potenziale della funzionalità di un organismo

Rappresenta il potenziale della funzionalità di un organismo

Il DNA

I nucleotidi►(A) Adenina►(T) Timina►(C) Citosina►(G) Guanina

Genoma umano23 Coppie di cromosomi omologhi

Persone

Sequenza nucleotidica

Città

Gene

Regione

Regione cromosomica

Stato

Cromosoma

Un occhio alle dimensioni

Terra

Cellula

Grandi libri genoma umano

DIVINA COMMEDIA GENOMA UMANOLibri 3 2 Genomi aploidi

Capitoli (Canti) 100 23 Cromosomi

Numero totale di parole 101 698

Numero di lettere 408 826 2 910 000 000 Numero di nucleotidi

Numero di parole diverse 12 831 25-30 000 Numero di geni

ANTICO TESTAMENTOLibri 39

Capitoli 929

Numero totale di parole 812 374

Numero di lettere 3 574 446

Numero di parole diverse 33 030

[ Fonte: http://www.intratext.com/ ]

http://www.intratext.com/

Flusso dell’informazione genetica

Replicazione DNA

FENOTIPO

Trascrizione

RNA

Traduzione

Proteine

Gianfranceschi 20/02/2008 - 8

Le tappe fondamentali della genetica

1859 Charles Darwin pubblica “l’origine delle specie” formulando la teoria dell’evoluzione e come essa agisce attraverso la selezione naturale. 1865 Nasce l’era della genetica quando Gregor Mendel, studiando come vengono ereditati i caratteri di pisello, formula le leggi principali dell’ereditarietà, che sono valide tutt’oggi.

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1975 Walter Gilbert e Allan Maxam dell’università di Harvard e Fred Sanger dell’università di Cambridge sviluppano contemporaneamente due sistemi diversi per sequenziare il DNA. Gilbert e Sanger ricevono il Nobel per chimica nel 1980 (con Paul Berg).

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g i 1953 Scoperta la struttura a doppia elica

del DNA da parte di James Watson and Francis Crick.Inviano un manoscritto di una pagina a Nature che iniziava: “Vorremmo suggerire una struttura per il sale dell’acido desossiribonucleico (DNA)”; e finiva dicendo: “Non ci è sfuggito che l’appaiamento specifico che abbiamo postulato suggerisce immediatamente un possibile meccanismo per copiare il materiale genetico.” Il loro lavoro gli valse il Nobel nel 1962, condiviso con Maurice Wilkins, mentre Rosalind Franklin morì 4 anni prima.

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BICENTENARIODELLA NASCITA

1989 Inizia il progetto genoma umano. Un ambizioso piano per mappare e sequenziare tutti i geni umani entro il 2005

1996 Sviluppo della tecnologia GeneChip®: Il dipartimento di biochimica di Stanford e la ditta Affymetrix introducono una rivoluzionaria tecnica per studiare l’espressione genica e per il sequenziamento.


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1986 Inventata da Kary Mullis la tecnica dell’amplificazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction o PCR).Ha rivoluzionato il modo di fare biologia molecolare. Mullis ha vinto il premio Nobel per la chimica nel 1993.

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1996 Nasce Dolly, il primo mammifero clonato partendo da cellule adulte, scatenando un inferno di critiche.Purtroppo il 14 febbraio 2003 la pecora Dolly muore all’età di 6 anni di una infezione polmonare, comune agli animali cresciuti in stalla.

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1998 Corsa al sequenziamento del genoma: J. Craig Venter fonda e dirige la Celera Genomics con lo scopo di sequenziare l’intero genoma umano entro il 31 dicembre 2001 - 2 anni prima della data prevista dal progetto genoma umano pubblico.Investimento effettuato $300 milioni. La ditta mette insieme una capacità di sequenziamento maggiore di quella esistente all’epoca in tutto il mondo, associata ad una capacità di calcolo (computing) seconda solo a quella del Pentagono.

1999 (Settembre) Celera annuncia di aver completato il sequenziamento del genoma del moscerino della frutta (Drosophila melanogaster), utilizzato come palestra di prova. Inizia immediatamente il sequenziamento del genoma umano.

MA FINALMENTE …

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NATURE 409 (6822) p.860-92115 FEBBRAIO 2001

Il Progetto Genoma Umano

Progetto internazionale di ricerca► Iniziato nel 1990, inizialmente sotto la

guida di James Watson(lo scopritore della struttura a doppia elica del DNA)

► Budget iniziale: $ 3.000.000.000► Principali finanziatori: NIH e DOE

► Durata prevista: 15 anni► Grazie alla collaborazione internazionale e allo sviluppo della

tecnologia, la prima “bozza” del genoma fu terminata nel 2000

► Nazioni coinvolte► U.S.A► Gran Bretagna► Giappone

►Germania

►Francia

►Cina

Istituti partecipanti

► Beijing Genomics Institute/Human Genome Center, Institute of Genetics, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China

► Beijing Genomics Institute/Human Genome Center, Institute of Genetics, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China

► Department of Genome Analysis, Institute of Molecular Biotechnology, Jena, Germany ► Max Planck Institute for Molecular Genetics, Berlin, Germany ► GBF - German Research Centre for Biotechnology, Braunschweig, Germany

► Department of Genome Analysis, Institute of Molecular Biotechnology, Jena, Germany ► Max Planck Institute for Molecular Genetics, Berlin, Germany ► GBF - German Research Centre for Biotechnology, Braunschweig, Germany

► Genoscope and CNRS UMR-8030, Evry, France► Genoscope and CNRS UMR-8030, Evry, France

► RIKEN Genomic Sciences Center, Yokohama, Japan ► Department of Molecular Biology, Keio University School of Medicine, Tokyo, Japan ► RIKEN Genomic Sciences Center, Yokohama, Japan ► Department of Molecular Biology, Keio University School of Medicine, Tokyo, Japan

► The Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, Cambridge, Mass., U.S. ► Washington University School of Medicine Genome Sequencing Center, St. Louis, Mo., U.S. ► United States DOE Joint Genome Institute, Walnut Creek, Calif., U.S. ► Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing Center, Department of Molecular and

Human Genetics, Houston, Tex., U.S. ► GTC Sequencing Center, Genome Therapeutics Corporation, Waltham, Mass., USA ► Multimegabase Sequencing Center, The Institute for Systems Biology, Seattle, Wash. ► Stanford Genome Technology Center, Stanford, Calif., U.S. ► Stanford Human Genome Center and Department of Genetics, Stanford University School of

Medicine, Stanford, Calif., U.S. ► University of Washington Genome Center, Seattle, Wash., U.S. ► University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Dallas, Tex., U.S. ► University of Oklahoma's Advanced Center for Genome Technology, Dept. of Chemistry and

Biochemistry, University of Oklahoma, Norman, Okla., U.S. ► Cold Spring Harbor Laboratory, Lita Annenberg Hazen Genome Center, N.Y., U.S.

► The Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, Cambridge, Mass., U.S. ► Washington University School of Medicine Genome Sequencing Center, St. Louis, Mo., U.S. ► United States DOE Joint Genome Institute, Walnut Creek, Calif., U.S. ► Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing Center, Department of Molecular and

Human Genetics, Houston, Tex., U.S. ► GTC Sequencing Center, Genome Therapeutics Corporation, Waltham, Mass., USA ► Multimegabase Sequencing Center, The Institute for Systems Biology, Seattle, Wash. ► Stanford Genome Technology Center, Stanford, Calif., U.S. ► Stanford Human Genome Center and Department of Genetics, Stanford University School of

Medicine, Stanford, Calif., U.S. ► University of Washington Genome Center, Seattle, Wash., U.S. ► University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Dallas, Tex., U.S. ► University of Oklahoma's Advanced Center for Genome Technology, Dept. of Chemistry and

Biochemistry, University of Oklahoma, Norman, Okla., U.S. ► Cold Spring Harbor Laboratory, Lita Annenberg Hazen Genome Center, N.Y., U.S.

► The Wellcome Trust Sanger Institute, The Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, U. K.► The Wellcome Trust Sanger Institute, The Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, U. K.

Obiettivi del progetto

► Scopo principale: determinare la sequenza completa del DNA umano (più di 3 miliardi di nucleotidi)

► Identificare tutti i geni presenti nel genoma umano

► Sviluppare metodi più efficienti e veloci di sequenziamento del DNA

► Sviluppare software per gestire, assemblare e analizzare l’immensa mole di dati di sequenza prodotti

► Considerare gli aspetti etici, sociali e legali legati all’aver a disposizione dati così “delicati” relativi alle persone

► Ma non solo …

Perché sequenziare l’intero genoma umano?

Conoscere l’intera sequenza del genoma è come avere tutte le pagine del manuale necessario a costruire il corpo umano

►Però ora dobbiamo capire come leggere il contenuto di queste pagine e comprendere come le singole parti funzionano ed interagiscano

►Questo vuol dire cercare di identificare i geni che controllano i vari passaggi di ciascuna via metabolica e di scoprire quali variazioni sono associate a patologie o predispongono a malattie

►L’aver a disposizione l’intera sequenza del genoma permette di sviluppare metodi diagnostici molto efficaci, per inquadrare meglio le necessità sanitarie delle persone basandosi sulla composizione genica dell’individuo, permettendo lo sviluppo di nuovi farmaci più efficaci e mirati

Quali branche possonobeneficiare del PGU ?

► Medicina molecolare ► Miglioramento dei sistemi di diagnosi delle malattie► Identificazione precoce della predisposizione genetica a malattie► Disegno razionale dei farmaci► Terapia genica► Farmaco-genomica “farmaci personalizzati”

► Bio-archeologia, antropologia, evoluzione e migrazione umana► Studio dell’evoluzione umana seguendo la storia delle mutazioni e come queste sono

state ereditate nel corso dell’evoluzione► Studio delle migrazioni dei popoli basata sulla ereditarietà di tipo nucleare o materno ► Studio delle mutazioni a carico del cromosoma Y e ricostruzione della storia evolutiva e

delle migrazioni per via paterna

► Analisi forensi del DNA► Identificazione di sospetti da tracce di DNA lasciate sulla scena del crimine► Esclusione di persone erroneamente accusate di aver commesso crimini► Identificazione di criminali e vittime di catastrofi► Analisi di paternità e di altre relazioni famigliari► Verifica della compatibilità tra donatore e ricevente in programmi di trapianto di organi

► Valutazione del rischio► Determinare i rischi e i danni alla salute causati dalle radiazioni► Determinare i rischi e i danni alla salute causati dall’esposizione a sostanze mutagene

ed a tossine► Ridurre la probabilità di trasmettere mutazioni

Alcuni tra più di 1000 test molecolari possibili

1. Alpha-1-antitrypsin deficiency (AAT; emphysema and liver disease) 2. Amyotrophic lateral sclerosis (ALS; Lou Gehrig's Disease; progressive motor function loss leading to paralysis and death) 3. Alzheimer's disease* (APOE; late-onset variety of senile dementia) 4. Ataxia telangiectasia (AT; progressive brain disorder resulting in loss of muscle control and cancers) 5. Gaucher disease (GD; enlarged liver and spleen, bone degeneration) 6. Inherited breast and ovarian cancer* (BRCA 1 and 2; early-onset tumors of breasts and ovaries) 7. Hereditary nonpolyposis colon cancer* (CA; early-onset tumors of colon and sometimes other organs) 8. Central Core Disease (CCD; mild to severe muscle weakness) 9. Charcot-Marie-Tooth (CMT; loss of feeling in ends of limbs) 10. Congenital adrenal hyperplasia (CAH; hormone deficiency; ambiguous genitalia and male pseudohermaphroditism) 11. Cystic fibrosis (CF; disease of lung and pancreas resulting in thick mucous accumulations and chronic infections) 12. Duchenne muscular dystrophy/Becker muscular dystrophy (DMD; severe to mild muscle wasting, deterioration, weakness) 13. Dystonia (DYT; muscle rigidity, repetitive twisting movements) 14. Emanuel Syndrome (severe mental retardation, abnormal development of the head, heart and kidney problems) 15. Fanconi anemia, group C (FA; anemia, leukemia, skeletal deformities) 16. Factor V-Leiden (FVL; blood-clotting disorder) 17. Fragile X syndrome (FRAX; leading cause of inherited mental retardation) 18. Galactosemia (GALT; metabolic disorder affects ability to metabolize galactose) 19. Hemophilia A and B (HEMA and HEMB; bleeding disorders) 20. Hereditary Hemochromatosis (HFE; excess iron storage disorder) 21. Huntington's disease (HD; usually midlife onset; progressive, lethal, degenerative neurological disease) 22. Marfan Syndrome (FBN1; connective tissue disorder; tissues of ligaments, blood vessel walls, cartilage, heart valves and other

structures abnormally weak) 23. Mucopolysaccharidosis (MPS; deficiency of enzymes needed to break down long chain sugars called glycosaminoglycans;

corneal clouding, joint stiffness, heart disease, mental retardation) 24. Myotonic dystrophy (MD; progressive muscle weakness; most common form of adult muscular dystrophy) 25. Neurofibromatosis type 1 (NF1; multiple benign nervous system tumors that can be disfiguring; cancers) 26. Phenylketonuria (PKU; progressive mental retardation due to missing enzyme; correctable by diet) 27. Polycystic Kidney Disease (PKD1, PKD2; cysts in the kidneys and other organs) 28. Adult Polycystic Kidney Disease (APKD; kidney failure and liver disease) 29. Prader Willi/Angelman syndromes (PW/A; decreased motor skills, cognitive impairment, early death) 30. Sickle cell disease (SS; blood cell disorder; chronic pain and infections) 31. Spinocerebellar ataxia, type 1 (SCA1; involuntary muscle movements, reflex disorders, explosive speech) 32. Spinal muscular atrophy (SMA; severe, usually lethal progressive muscle-wasting disorder in children) 33. Tay-Sachs Disease (TS; fatal neurological disease of early childhood; seizures, paralysis) 34. Thalassemias (THAL; anemias - reduced red blood cell levels) 35. Timothy Syndrome (CACNA1C; severe cardiac arrhythmia, webbing of the fingers and toes called syndactyly, autism)

Geni associati a malattie nell’uomoN

um

ero

di geni ass

oci

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a m

ala

ttie

Fonte: Online Mendelian Inheritance in Man

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Questioni etico-sociali sollevate dal PGU

► Correttezza dell’uso dell’informazione genetica(assicurazioni, datori di lavoro, tribunali, scuole, militari, ecc.)

► Chi dovrebbe avere accesso ai dati genetici personali e in che modo questi possano e debbano essere usati?

► Privacy e confidenzialità delle informazioni genetiche► Chi è il proprietario di queste informazioni e chi le controlla?

► Psicologia e stigmatizzazione delle differenze genetiche individuali► Come l’informazione genetica influenza la percezione dell’individuo e come

questi sia percepito dalla società ► Come l’informazione genetica influenza i membri di una minoranza

► Questioni riguardanti la riproduzione(adeguato consenso informato relativamente a procedure complesse potenzialmente controverse, l’uso delle informazioni genetiche nelle decisioni relative alla riproduzione, ecc.)

► Il personale della sanità consiglia in maniera corretta circa i rischi e le limitazioni dei test genetici?

► Quanto sono affidabili e utili test genetici sul feto?► Quali sono le questioni principali della società sollevate dalle nuove tecniche e

tecnologie della riproduzione? ► Aspetti clinici

(educazione dei medici e del personale addetto alla sanità, dei pazienti e dell’opinione pubblica sulle possibilità offerte dalla genetica, i suoi limiti e i rischi sociali. Implementazione di standard e di controlli qualitativi nelle procedure utilizzate per i test genetici)

► Come saranno valutati e regolati i test genetici per quel che riguarda la loro accuratezza, affidabilità e utilità?

► Come preparare i professionisti della sanità a queste nuova genetica? ► Come preparare il pubblico in modo che possa prendere delle decisioni

informate?► Come possiamo, come società, bilanciare le limitazioni scientifiche attuali e i

rischi sociali con i benefici a lungo termine?

Strategia utilizzata: “Hierarchical shotgun”

DNA genomico

Costruzione di una genoteca (BAC library)

Ordinamento dei cloni BAC

...ACCGCAGTCAGTGACGAT ACGATGACGGACCAGTGACGTG...

Sequenza di ogni frammento

...ACCGCAGTCAGTGACGATCGGACCAGTGACGTG...Assemblaggio della sequenza

Frammentazione di ciascun clone BAC(frammenti di 500-2000bp)

Frammenti di circa 150000 bp

L’automazione per produrrele sequenze

Crescita delle sequenze nella GenBank

Paia

di basi

(in

mili

ard

i)

Num

ero

di se

quenze

(m

ilioni)

CRESCITA DELLA GENBANK

paia di basiN° sequenze

Le cifre del progetto CeleraLunghezza complessiva della sequenza

► 2.91 miliardi di paia di basi (bp)

Strategia utilizzata► whole-genome shotgun sequencing

Lunghezza totale delle sequenze generate► 14.8 miliardi di bp

Tempo impiegato► 9 mesi

Numero di sequenziamenti effettuati► 27.271.853 (pari a circa 5.11 volte il genoma umano)

Fonte del DNA► 5 individui

Sequenziatori automatici utilizzati► 300 sequenziatori ABI PRISM 3700 DNA Analyzer

Computer► 800 computer Compaq Alpha-based 64-bit, interconnessi

Numero di sequenze al giorno► 175.000

Numero di nucleotidi al giorno► ~ 95.000.000

Craig Venter

ABI PRISM 3700 DNA Analyzer

1.Genomica Strutturale• Organizzazione del genoma• Contenuto informativo• Grado di variabilità

2. Genomica Funzionale• Significato funzionale delle sequenze

3. Genomica Comparativa• Studi evolutivi• Significato della variabilità osservata

E’ nata l’era della genomica

Genomics ma non solo …

Oggetto dello studio

Metodo

Genomics Set completo dei geni

Sequenziamento del DNA

Transcriptomics mRNA di una cellula, tessuto

EST, array

Proteomics Set completo delle proteine

2D elettroforesi, spettr. di massa

Metabolomics Se completo dei metaboliti

Risonanza magnetica, spettrometria

DNA mRNA Proteine Prodotto genico

Analisi funzionale

Sequenze genomiche

SequencingSequencing

Genomics

MetabolomicsMetabolomics

Profili metabolici

Functional Genomics

TranscriptomicsTranscriptomics

Profili d’espressione Profili proteici

ProteomicsProteomics

Funzione biologica

Bioinformatics

… omics

11-18µm

Milioni di copie di una specifica sonda oligonucleotidica

Immagine di un array ibridato

Sonda oligonucleotidica

* **

**

1.28cm

Array GeneChipCella di ibridazione

8.000 – 90.000 trascritti

Arrays GeneChip®

www.affymetrix.com

Affymetrix GeneChips

Affymetrix® Genome-Wide Human SNP Array 6.0• 1.8 milioni di marcatori genetici• Inclusi più di 906.600 “single nucleotide polymorphisms” (SNPs)

Photosystem I subuint XI

Photosystem I reaction center subunit II

PM

PM

MM

MM

Risultato dell’ibridazionedi un array GeneChip

Microarray “a-la-carte”

… e l’ I t a l i a ?

Da “la Repubblica” del 14/12/2000

27 settembre 2007 19 dicembre 2007


Articolo per approfondireA vision for the future of genomics researchA blueprint for the genomic era.

Francis S. Collins, Eric D. Green, Alan E. Guttmacher and Mark S. GuyerNature 422, 835-847 (24 April 2003)

http://www.nature.com/uidfinder/10.1038/nature01626

2009 Il Progetto Genoma Umano (Shared)

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