Lezione 4

• Le costanti di accoppiamento• Il rilassamento• Accoppiamento dipolare

Accoppiamento dipolareA differenza dell’accoppiamento scalare, l’accoppiamento dipolare altera la popolazione dei livelli del sistema e non i valori di energia

Da un punto di vista fisico, é l’accoppiamento tra due “magneti” che

sono vicino nello spazio

Accoppiamento dipolareL’accoppiamento dipolare si ha tra due spin che sono vicini nello spazio

Si tratta della interazione tra due dipoli magnetici, tra i quali, quando essi sono vicini nello spazio, si ha uno scambio di energia

L’entità dell’effetto dipende dal campo magnetico e dalle dimensioni della molecola. Nel caso di spin 1H, l’accoppiamento dipolare si trasferisce per spin che si trovano a distanze inferiori ai 5 A.

NON si osservano doppietti

L’accoppiamento dipolare da luogo ad un trasferimento di magnetizzazione da uno spin all’altro. Questo effetto va sotto il nome di effetto NOE

Nuclear Overhauser Effect

Perturbo A Aumenta la intensità di B

Accoppiamento dipolare

L’accoppiamento dipolare è “indipendente dall’accoppiamento scalare2 spin possono essere accoppiati :-Scalarmente E dipolarmente se sono vicini nello spazio e legati da legami chimici-scalarmente ma non dipolarmente se sono legati da legami chimici ma non vicini nello spazio-dipolarmente ma non scalarmente se sono spazialmente vicini ma non legati da legamei chimici

Pensate a degli esempi, per favore

L’effetto NOE è osservabile in un esperimento NMR bidimensionale , detto NOESY(in realtà si puo’ anche osservare in esperimenti monodimensionle (1D NOE) di cui pero’ non parleremo

Distance constraints

NOESY volumes are proportional to the sixth power of the interproton distance and to the correlation time for the dipolar coupling

BB00

II

JJ

rr

6IJ

cIJ r

Accoppiamento scalare ed accoppiamento dipolare

L’accoppiamento scalare è l’accoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono legati da legami chimici (THROUGH BOND)E’ l’accoppiamento tra spin determinato dagli orbitali molecolari, ovvero le energie dei livelli di spin nucleari sono interdipendentiPorta alla formazione di doppietti e multipletti. Puo’ essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, sfruttando il trasferimento atraverso legami chimici

L’accoppiamento dipolare è l’accoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono vicini nella spazio (THROUGH SPACE)E’ l’accoppiamento tra due dipoli magnetici che sono vicini tra di loroPuo’ essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, in funzione della loro prossimità spaziale

Through space AND throuhg bonds

Through space

Through bond

1D experiment

Could be nice but...

..Too crowded..

What do we learn?

Chemical shifts relaxation rates

Not enough to get a structure

The need for multidimensional NMR

The need for multidimensional NMR

Cosa è un esperimento bidimensionale ?

Dopo un impulsi il segnale è pronto per essere acquisito

Facciamo l’acquisizione ma NON terminiamo l’esperimento ed applichiamo ancora uno o piu’ impulsi in modo da perturbare ulterioremente il sistema

Attraverso una combinazione di impulsi e delays noi facciamo in modo che ci sia uno scambio di magnetizzazione tra spin accoppiati

SUCCESSIVAMENTE, acquisiamo il segnale una seconda volta

A 2D!• An FID is a series of data points, each data point being

separated by a sampling time (dwell time)

A computer will consider an FID as a one dimensional array of data points.Each point has a different intensityF(t)

We will now repeat the experiment a second time, just changing another delay previous to acquisition.

F(t2)

F(t1)

3

F(t)

3

33

3n

0, ,2 ,3 ,4 …….…n

3+3+2

3+3

We repeat the same experiment n times

We obtain a two dimensional array of data points in which rows and columns represent INDEPENDENT TIME DOMAINS. EACH POINT will be a function of both t1 and t2

The overall signal is an F(t1,t2)

We collect a second F(t) which will be identical but for such delay. We store it in this way.

Fourier transformation

F(t1,t2)

F(1,t2) F(t1,2)

F(1,2)

Fourier transformati

on (t1)

Fourier transformati

on (t2)

Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2)

Se la perturbazione non ha effetto e se non c’è trasferimento di alcun tipo,Io ottengo lo stesso spettro in ciascuna delle 2 dimensioni tempo (t1 e t2)Dopo la trasformate di Fourier io otterro’ uno spettro dove i segnali appaiono su una diagonale di una matrice quadrata

Se durante la perturbazione una parte della magnetizzazione si traferisce da un nucleo ad un altro, per esempio per effetto di accoppiamento scalare, allora lo spettro della dimensione t2 sarà diverso da quello della dimensione t1.

Il risultato è che avro’ dei segnali fuori dalla diagonale. Ciascun segnale fuori dalla diagonale darà la informazione sugli accoppiamenti scalari attivi nel sistema

M (I t1) (St2)

Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2)

EXAMPLEN

H H

CC

O

We make a 1H experiment and we acquire.

Then all signals transfer the information because of scalar coupling

N

H H

C

Then I observe Hc

I observe Hn

I consider the first and the second acquisition as two indpendent dimensions

Spectrum afterThe J coupling

Spectrum beforeThe J coupling

EXAMPLEN

H H

CC

O

N

H H

C

Spectrum afterThe J coupling

Spectrum beforeThe J coupling4 ppm9 ppm

Signal!This indicates that there is a scalar coupling

between Hn and Hc

EXAMPLEN

H H

CC

O

N

H H

C

Spectrum afterThe J coupling

Spectrum beforeThe J coupling4 ppm9 ppm

Signal!This indicates that there is a scalar coupling

between Hn and Hc

Hn Hn

Hc

J-coupling

EXAMPLEN

H H

CC

O

Spectrum afterThe J coupling

Spectrum beforeThe J couplingHc Hc

Hn

J-coupling

If you begin from Hc , the situation is the same !

EXAMPLEN

H H

CC

O

Spectrum afterThe J coupling

Spectrum beforeThe J coupling

Hc Hc

Hn

J-coupling

Therefore, if I consider only this system

Hn Hn

Hc

J-coupling

The first dimension = t1

The second dimension = t2

the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE

example

t1 t2

t1 dimensionOr F1

t2 dimensionOr F2

Usually t1 is also defined as indirect dimension

t2 is also defined as direct dimension

the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE

example

t1 t2

t1 dimensionOr F1

t2 dimensionOr F2

F1

F2

Definitions

Cross peak Two different frequencies are observed in the two dimensions

Diagonal peakThe same frequency is observed in both dimensions

CROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies

Accoppiamento scalare

L’accoppiamento scalare puo’ comunque essere osservato attraverso esperimenti NMR bidimensionali, quali il COSY

Example: COSY

Through-bond connectivities

COSY= COrrelation SpectroscopY

H4-H5

H4’-H5’

Example: COSY

Through-bond connectivities

COSY= COrrelation SpectroscopY

H4-H5

H4’-H5’

1

2

3

4

5

6

Beyond COSYCOSY is not the only 2D experiment

It is possible to transfer the information from spin A to spin B via several possible mechanisms

The most important routes, which is COMPLEMENTARY

TO J-couplingIs THROUGH SPACE

COUPLING

The “old times” approachNOESYNOESY

CCOOSYSY

Identify through space connectivitiesIdentify through space connectivitiesHN(i)-Ha(i) and HN(i)Ha(i-1)HN(i)-Ha(i) and HN(i)Ha(i-1)

Identify through bond connectivitiesIdentify through bond connectivitiesHN(i)-Ha(i)HN(i)-Ha(i)

NOESY conn.NOESY conn.

COSCOSY connY conn

Through space AND throuhg bonds

Through space

Through bond

Troppi segnali 1H ?

Isotope labelingFor biomolecules, tipically, 15N or 13C and 15N, or 13C, 15N, 2H

15N Only

A more effective fingerprint-characterization-folding-dynamics

protein size >10000Homonuclear 2D experiments donot have enough resolution

HSQC or HMQC HSQC-NOESY or HSQC TOCSY

Isotope labelingFor biomolecules, tipically, 15N or 13C and 15N, or 13C, 15N, 2H

15N and 13C

Scalar couplings through 13C atoms-triple resonance-assignment-structure

protein size >20000

1J couplings for

backbone resonances

The HSQC experiment

Heteronuclear cases

The scheme of 1J scalar couplings

Heteronuclear NMROBSERVE 13C during t1

Transfer the information to all 1H coupledObserve 1H during t2

1H

13C

No more diagonal

Each peak indicate A differen H-C pair

Heteronuclear NMROBSERVE 13C during t1

Transfer the information to all 1H coupledObserve 1H during t2

1H

13C

No more diagonal

Two protons are bound to the same carbon

CH2

The HSQC experiment

The HSQC experiment

In 5 minutes you may know….if your protein is properly foldedif all aminoacids gives rise to an

observable peak

Each amide NH group gives rise to one peak

Detect H-N couplings

Same sensitivity of a 1H experiment (although you are

observing 15N)but much larger resolution

if you can do the job (whatever is your job)

STRUTTURE IN SOLUZIONE VIA NMR

Rappresentazione alternativa di una struttura in Rappresentazione alternativa di una struttura in soluzione, ovvero di una famiglia di strutturesoluzione, ovvero di una famiglia di strutture

Cyt c oxidized Cyt c reduced

Banci, Bertini, Bren, Gray, Sompornpisut, Turano, Biochemistry, 1997

Baistrocchi, Banci, Bertini, Turano, Bren, Gray, Biochemistry, 1996

Solution structure of oxidized and Solution structure of oxidized and reduced Cytochrome creduced Cytochrome c

Active site channel of Reduced Monomeric Active site channel of Reduced Monomeric Q133 Copper Zinc Superoxide dismutaseQ133 Copper Zinc Superoxide dismutase

Reduced Reduced Q133M2SODQ133M2SOD

Oxidized human Oxidized human SODSOD

0 20 40 60 800.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.02.22.42.6

Paramagnetic structureDiamagnetic structure

RMSD

bac

kbon

e

Residue Number

Bertini, Donaire, Jiménez, Luchinat, Parigi, Piccioli, Poggi, J.Biomol. NMR, 2001,21,85-98

Structure of CeStructure of Ce3+3+ substituted Calbindin D substituted Calbindin D9k9k

The solution structure of a human The solution structure of a human SOD mutant SOD mutant

The HSQC experiment

In 5 minutes you may know….if your protein is properly foldedif all aminoacids gives rise to an

observable peak

Each amide NH group gives rise to one peak

Detect H-N couplings

Same sensitivity of a 1H experiment (although you are

observing 15N)but much larger resolution

if you can do the job (whatever is your job)

Screening in silicoScreening in silico + NMR + NMR

Identificazioni dei siti di interazione:

Analisi delle superfici in silico

Analisi delle superfici via NMR (HSQC)

15N HSQC del CytC con Cloroamina T

ppm

ppm

Ca2+

Apo Cb @ 3.3 M GdmCl

Loss of secondary structure elements: unfolded protein

Refolding

Ca2Cb @ 3.3 M GdmCl

The role of metal cofactor in protein unfolding

Metal triggered protein folding

Structure-Activity Relationship by NMR

Screening via NMRScreening via NMR

Libreria di ProtEra

14 serie da 26 composti

Proteina standard

CytC da lievito

Via Water LOGSY è stata analizzata l’interazione del CytC con 3 serie di composti (78)

NMR time per inibitore: 45’x 2

Conc. del CytC non marcato: 8 M

Conc. dell’inibitore: 800 M

Dall’analisi risultano interagire 12 composti

Water LOGSY del CytC con Cloroamina T

700MHz 303K