Laboratorio di Metodologie Biomolecolari

Modulo di Biologia Molecolare

Claudia Binda

claudia.binda@unipv.it

Cristallizzazione del lisozima

La funzione delle proteine è strettamente

correlata alla loro struttura tridimensionale

Risolvere (cioé scoprire) la struttura di una macromolecola

per studiarne la funzione e i meccanismi molecolari

alla base dei processi biologici in cui essa è coinvolta

Studiare la struttura per il “drug design”

Molti farmaci agiscono legandosi ad

un “target” proteico (per es. un

enzima) e alterandone l’attività

Il sito di legame è in genere formato da

una cavità o una tasca

Meccanismo di legame “lock-and-key”

Studiare la struttura del target e il meccanismo di legame del

farmaco permette di migliorarne le proprietà

“Vedere” gli oggetti

i nostri occhi utilizzano la luce(parte del visibile dello spettro elettromagnetico)

mm µm

…attraverso le lenti del microscopio ottico nel

caso di microbi o cellule

1 Å = 0.1 nm = 10-7 mm = 10-10 m

nm Å

“Vedere” gli oggetti

Cristallografia a raggi X

il campione da esaminare (la molecola) deve essere in forma cristallina

Un cristallo è un solido in cui le molecole sono disposte

in modo ordinato (periodico) lungo le tre dimensioni

raggi X

calcolo della

mappa della

densità

elettronica

diffraction

patterncampione

(cristallo di macromolecola)

Crystallization

Solubilization

Come si cristallizza una macromolecola?

Diagramma di fase di una proteina

Salt

Agenti precipitanti per la cristallizzazione di macromolecole:

SALI: ammonio solfato, sodio cloruro ecc.

POLIMERI: polyethylene glycol (PEG).

L’enzima lisozima

Enzima di 15 kDa

Attività battericida (lisi della parete batterica)

Descritto da Fleming nel 1922

Struttura nel 1965 (prima struttura di un enzima)

• tipo di precipitante

• concentrazione di precipitante

• concentrazione proteina

• pH (vari tamponi)

• additivi

• temperatura

• tecniche di cristallizzazione

Fattori importanti nella cristallizzazione di una macromolecola:

• purezza

• omogeneità

• stabilità

• regioni disordinate

Automatizzazione: il robot per cristallizzare

Buone regole per il lavoro sperimentale in laboratorio:

• attività in gruppo, attività in singolo (lavorare in team)

• scrivere sul quaderno (riproducibilità dei risultati) e sulle provette

• utilizzo del waste (normale e Alipak)

• utilizzo delle pipette

1. Maneggiare con cura (pericolo di scalibrazione)

Utilizzo delle pipette automatiche

2. Impostare il volumeN.B.: quando il volume viene portato da un valore superiore a uno inferiore,

è sufficiente ridurre l’impostazione fino a ottenere il volume desiderato.

Per aumentare l’impostazione del volume, ruotare la manopola di selezione

portandola leggermente al di sopra del volume desiderato,

quindi ruotarla lentamente fino al valore corretto. Questa operazione eviterà errori di trascinamento.

Utilizzo delle pipette automatiche

3. Immergere il puntale

Volume pipetta Profondità di immersione

2 e 10ul 1mm

20 e 100ul 2-3mm

200 e 1000ul 3-6mm

5000ul e 10ML 6-10mm

4. Riempire il puntaleSebbene i puntali possano avere un intervallo (nominale) consigliato

del 10%-100% del volume massimo (volume nominale), la precisione

migliore può essere raggiunta con un intervallo più limitato e ottimizzato,

pari al 35%-100%.

Premere e rilasciare lo stantuffo in modo lento e graduale

Fare le diluizioni

Esempio:

Preparare 100 ml di una soluzione 3 M del reagente X partendo

da una soluzione stock 5 M

C1 x V1 = C2 x V2

C1 = concentrazione di partenza (= stock a disposizione)

V1 = volume dello stock a disposizione da cui partire

C2 = concentrazione finale

V2 = volume finale

5 x V1 = 3 x 100

V1 = 60 ml

Prendere 60 ml di soluzione stock 5 M e aggiungere 40 ml

di solvente (es. acqua)

Interpretare i risultati: osservazione delle

gocce di cristallizzazione al microscopio

clear drop

Interpretare i risultati: osservazione delle

gocce di cristallizzazione al microscopio

light

precipitate

brown

amorphous

precipitate

Interpretare i risultati: osservazione delle

gocce di cristallizzazione al microscopio

crystalline

precipitate

crystal

grown from

amorphous

precipitate

skin

(denatured

protein)

spherulites

Interpretare i risultati: osservazione delle

gocce di cristallizzazione al microscopio

plates

needles

crystal

«sea urchin»