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La valutazione rischio-beneficio di xenobiotici negli alimenti: principi,(in)certezze,approcci innovativi

STEFANO LORENZETTI

[email protected]

Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare

Istituto Superiore di Sanità (ISS), Roma

Rischio e beneficio degli alimenti: la ricerca di un equilibrioBologna - 25 marzo 2010 - Golden Tulip Aemilia Hotel

Risk assessment is a step in a risk management process.

Risk management is the ongoingprocess of identifying these risks and implementing plans to address them

La valutazione rischio-beneficio di xenobiotici negli alimenti: principi, (in)certezze, approcci innovativi


La valutazione rischio-beneficio (Risk assessment): i principi

EFSA is the EU risk assessment body for food and feed safety.

Since 1995 a generic risk (safety) assessment model for food standards issues had been agreed upon FAO/WHO Expert Consultation, 1995.

In short, risk assessment is a systematic means to evaluate the probability of the occurrence of adverse health effects in humans due to (excess) exposure and can be divided into several steps, i.e.

hazard identification (identificazione degli effetti avversi),

hazard characterization (relazione dose-risposta),

exposure assessment (valutazione dell’esposizione),

risk characterization (caratterizzazione del rischio).

INTERFERENTI ENDOCRINI o endocrine disrupters (EDCs)“ …any plant substance or metabolite that induces biological responses in vertebrates

and can mimic or modulate the actions of endogenous oestrogensusually by binding to estrogen receptors.”

(COT Report 2003 on Phytoestrogens and Health - UK Food Standard Agency)FITO-ESTROGENI. Molecole derivanti da piante che, strutturalmente e/o funzionalmente, assomigliano agli estrogeni di mammifero.Il loro ruolo naturale è di proteggere le piante dallo stress e di agire come parte del meccanismo di difesa delle piante.Le classi principali sono 3 (flavonoidi, lignani e coumestani) e più di 4000 sostanze vengono considerate PEs.

Binding to the estrogen receptor (ER)Induction of specific estrogen responsive gene products

Stimulation of ER-positive breast cancer cell growth

FLAVONOIDI

Isoflavoni: Genisteina, DaidzeinaFlavonoli: QuercetinaFlavanoli: Luteolina e ApigeninaFlavanones: Naringenina


XENO-ESTROGENI. Sostanze di origine sintetica prodotte dall‘industria agro-alimentare e chimica, la cui introduzione nell‘ambiente sarebbe responsabile di notevoli alterazioni dei meccanismi riproduttivi delle specie viventi (nell‘uomo, TDS/testicular dysgenesis syndrome).

Esempi: plasticizzanti: bispenol A / BPA; ftalati (DBP, DEHP) ERs, AR; PPARsinsetticidi, fungicidi: linuron, lindano, vinclozolina AR, ERsdiossine: TCDD AhR

La loro azione in realtà è spesso mediata da uno o più recettori nucleari (NRs),non necessariamente o non solo dai recettori per gli estrogeni !

bis(2-ethylhexyl) ftalatoDEHP

bisfenolo A / BPA lindano: γ-esaclorocicloesano / γ-HCH

di-n-butyl ftalatoDBP

vinclozolina

INTERFERENTI ENDOCRINI o endocrine disrupters (EDCs)


hazard identification (identificazione degli effetti avversi)

Aspetto QualitativoChe effetti induce la sostanza ?

Che tessuti/organi colpisce ?Con quale modo e/o meccanismo d’azione ?

Protocolli sperimentali dati epidemiologici e tossicologicimodelli animali e in vitrotossico- e nutri-genomicaproteomica e metabolomica

FAO/WHO Expert Consultation, 1995

Le sostanze di origine naturale vengono attualmente valutate mediante studi di diversa durata di tossicità animale seguendo specifiche linee guida nazionali e internazionali (OECD, EPA-US, etc.)

Per ogni sostanza BIOATTIVA è necessario utilizzare migliaia di animali esposti a diversi livelli di dose, per diversi periodi di esposizione (dal breve-termine al cronico)…

… la valutazione della tossicità della sostanza richiede l’analisi dei pesi degli organi e l’esame microscopico di tutti gli organi e dei tessuti così come l’uso di test funzionali per verificare la funzione riproduttiva, del sistema nervoso, etc…

NOAEL nell’animale modello più suscettibile è la base per le decisioni delle autorità

Tossicologia in vivo – complessitàLa valutazione rischio-beneficio di xenobiotici negli alimenti: principi, (in)certezze, approcci innovativi

hazard identification (identificazione degli effetti avversi)

Aspetto QualitativoChe effetti induce la sostanza ?

Che tessuti/organi colpisce ?Con quale modo e/o meccanismo d’azione ?

Protocolli sperimentali dati epidemiologici e tossicologicimodelli animali e in vitrotossico- e nutri-genomicaproteomica e metabolomica


SIAMO IN GRADO DI IDENTIFICARE IN MANIERAAPPROPRIATA

GLI ORGANI / TESSUTI BERSAGLIO ?

L’esempio dell’erbicida glufosinato (Glufosinate ammonium)

GA inhibits glutamine synthetase (GS) in all speciesinvestigated, including the rat, in which high doses of GA

led to toxicity to the early conceptus (loss during preimplantation and implantation), and in humans.

Regulatory Toxicology and Pharmacology 44 (2006) S1–S76

Analysis of reproductive toxicity and classification of glufosinate-ammoniumRolf Schulte-Hermann, Gerald N. Wogan, Sir Colin Berry, Nigel A. Brown, Andrew Czeizel, Erminio Giavini, Lewis B. Holmes, Robert

Kroes, Heinz Nau, Diether Neubert, Franz Oesch, Tilmann Ott, Olavi Pelkonen, Elisabeth Robert-Gnansia, Frank M. Sullivan


Proposal for classification26. On the basis of the evaluation of the animal data, and taking human exposure under normal handling and care into consideration, is classification of GA justified?• NO. After considering all the information available, the Science Partners Evaluation Group concludes that there is, under normal handling and use, no hazard for humans that would justify classification of GA.


Glufosinate ammonium: identificazione degli effetti avversi

Aspetto Qualitativo

Che effetti induce la sostanza ?Aumento della secrezione di PSA nella linea cellulare di prostata umana LNCaP

(0.01-0.1 mg/ml)

Che tessuti/organi colpisce ?Prostata

Con quale modo e/o meccanismo d’azione ?Androgen receptor (AR)-mediato o indipendente?

Lorenzetti et al. 2010, Reproductive Toxicology, submitted


hazard characterization (relazione dose-risposta)

Aspetto Quantitativo

A che livelli di esposizione si osserva un dato effetto ?Qual’è l’effetto critico (che si vede a livelli di esposizione minori) ?se proteggo dall’effetto critico proteggo anche dagli altri effetti ?

Philippus Aureolus TheophrastusBombastus von Honenheimdetto PARACELSO (1493-1541)

“Dosis sola facit venenum”

molte sostanze presenti naturalmenteo come contaminanti negli alimentipossiedono attività ormone-simile epresentano curve dose-rispostaU-shaped… p.es. il bisfenolo A

per un tossicologo… per un endocrinologo…

NMDR curves observed in mammary gland morphological parameters after administration of E2to OVX females.The left y-axis is the number of terminal end buds (TEBs), and the right y-axis is total area of all TEBs; the TEB is an estrogen-dependent structure.

In the threshold model, treatment with increasing doses of a drug has no effect until the “threshold” dose is reached, at which point anincrease in response is observed.

In the linear nonthreshold model, aresponse occurs even at the lowest treatment dose, and thereforeeffects at high doses can be used to predict responses at low doses.

With a non monotonic dose-response (NMDR) curve, an increase in dose does not necessarily correspond to an increase in response, such that, in this example, dosesfrom 10-12-10-3 M result in an increase in response, and doses from10-3-107 M result in a decrease in response. These curves are common for endocrine endpoints.

Vandenberg, et al. 2009, Endocrine Reviews 30(1):75–95


Quale relazione dose-risposta !?


exposure assessment (valutazione dell’esposizione)

Quanta sostanza rischio di assumere ?

Per quali vie? (inalatoria, cutanea, orale..)In quali situazioni? Lavoro, ambiente indoor/outdoor, alimentazione…

Quale sostanza e Qual’è la esposizione interna ?Assorbimento/metabolismobiomarcatori di esposizione

--------------------------specificità della salute riproduttivadipendenza dall’organismo materno, quindipassaggio transplacentarepassaggio nel latte materno (sostanze che bioaccumulano nei grassi)

“Fase-specificità”Identificare la popolazione esposta nella reale fase di suscettibilita’

Rider et al. Toxicol.Pathol. 2009


Rider et al. Toxicol.Pathol. 2009


In this example of “mixture toxicology” with different antiandrogensa cumulative, dose addictive effects

were shown by all binary combinations on androgen-dependent tissues .

The results also suggest that a modification of the approach for cumulative risk assessments from one based upon “common mechanism of toxicity” to one that includes the cumulative assessment of chemicals that disrupt development of the same reproductive tissues during sexual differentiation would result in target organ- and timingbased approach rather than on a narrow mechanism of toxicity.We propose that the primary focus should be on the biological system (e.g., androgen signaling pathway) rather than the mechanism of toxicity and that a cumulative risk assessment could potentially include all chemicals that target that system during the same critical developmental period.

risk characterization (caratterizzazione del rischio).

Quale popolazione e’ più esposta ? e/o Quale popolazione è più suscettibile ?

se proteggo questa/e popolazione/i proteggo anche la popolazione generale

ADI (Acceptable Daily Intake): RfD orale, cronica, per additivi/pesticidi

TD(W)I (Tolerable Daily/Weekly Intake): RfD orale, cronica, per contaminanti Concentrazioni Massime Ammissibili

(es. Limiti Massimi di Residui, per pesticidi, additivi e farmaci zootecnici) - garantire esposizione al di sotto della RfD


Direttiva 86/609 (sperimentazione animale):Il principio delle “3 R”: Reduction, Replacement, Refinement

Tossicologia in vitro – riduzione dell’uso degli animali

Necessità di sostituire la sperimentazione animale con quella in vitro

Direttiva 1999/45/CE :REACH (Registration, Evaluation and Authorisation of Chemicals)

approvata recentemente dal Parlamento europeo

Il processo di registrazione, per circa 30.000 sostanze, dovrebbe essere completato entro 11 anni dall’entrata in vigore del sistema REACH (2009 – 2020).Entro tre anni dovranno essere registrate le sostanze prodotte in maggiore quantità (oltre 1000 tonnellate all’anno); entro sei anni, le produzioni comprese tra 100 e 1000 tonnellate;entro 11 anni, le sostanze che si producono in quantità inferiori alle 100 tonnellate.

Chi produce e chi importa una determinata sostanza in quantità uguale o superiore ad una tonnellata all’anno ha l’obbligo di registrarla presso l’Agenzia Europea per le Sostanze Chimiche.La registrazione prevede la redazione di un dossier tecnico e di un rapporto sulla sicurezza dell’agente chimico in esame.

Il sistema REACH non distingue più tra sostanze esistenti e nuove.


Tossicologia sperimentale – Vecchi e nuovi metodi disponibili

Le -OMICS tools permettono l’analisi e l’integrazione di numerosi parametri biologici e aiutano a:Ridurre i tempi sperimentali per generare dati rilevanti per la sicurezzaRidurre il numero di animali necessari per generare dati sulla sicurezzaComprendere il meccanismo di azione nel tessuto bersaglio per estrapolare nell’uomo con maggior

“confidenza” i dati ottenuti sugli animali

-OMICS tools


“Strategies for in vitro test batteries in reproductive/developmental toxicity:a toxicogenomic approach involving expression / regulation of androgen receptor genes”ISS - ReProTect Working Group - Alberto Mantovani (WP4 coordinator)

Tossicologia in vitro – un approccio tossicogenomico alla tossicità riproduttiva


Identificare, in linee cellulari umane di prostata, una (o più) “AR-dedicated gene expression signature(s)” specifica per:

Identificare possibili composti interferenti con il recettore per gli androgeni (AR) mediante il confronto dei profili di espressione genica ottenuti quelli di AR-(anti)agonisti noti.

Creazione di un microchip dedicato(a bassa densità)

per lo screening di interferenti androgenici

ReProTect: perché il recettore per gli androgeni (AR), perché la prostata ?Gli androgeni T e 5α-DHT sono essenziali nello sviluppo e nella crescita del sistema riproduttivo maschile

(e non solo).

L’azione biologica degli androgeni è mediata da AR (un membro della super-famiglia dei recettori nucleari):la sua alterazione profonda può dar origine a gravi anomalie nello sviluppo sessuale,

mentre modificazioni più lievi sembrano essere la causa dell’infertilità maschile.

BERSAGLIO DELL’ INTERFERENZA ENDOCRINA

Sindrome della Disgenesi Testicolare o Testicular Dysgenesis Syndrome (TDS):nei paesi dell’Europa occidentale e negli USA, durante la vita fetale,

fattori genetici e/o ambientalisono responsabili dell’ infertilità maschile e di malattie / disfunzioni associate

Prostate epithelial cells (prostatic fluid)

Adapted from Skakkebaek NE et al., 2001, Human Reproduction 16: 972–8


Strategy to identify gene expression signatures of AR-(anti)agonists

Cytotoxicity assays

MTS assay

SOP_CYT_004

Microarray experimentsPreparation of dye-labeled samples

SOP_MIC_002

Microarray hybridization& data collection and analysis

SOP_MIC_003

For each tested compound,SELECTION of NOAECto be used in microarrays

Comparison of GENE EXPRESSION PROFILING&

Individuation and selection ofGENES DIFFERENTIALLY MODULATED

by AR-(ANTI)AGONISTS and/or AR STATUS

Validation of microarray results by

real time RT-PCR (qPCR)

SOP_PCR_002

Cell line quality control

RNA extraction & purification+ AR status

by real time RT-PCR (qPCR)

SOP_MIC_001 & SOP_PCR_001

Selected PCLCs treatmentsfor microarrays

SOP_CYT_006

Manipulation ofProstate Cell Line Cultures (PCLCs)

SOP_CYT_001

PCLCs plating,starvation & treatments

for cytotoxicity assays

SOP_CYT_002

RNA extraction & purificationSOP_MIC_001

PHENOTYPIC ANCHORINGlinking toxicogenomics to clinical chemistry

SOP_ANC_001

MT

L3

MT

L2

MT

L4

MT

L1

2OH

-FTA

L4 2O

H-F

TAL2 2O

H-F

TA

L1 2OH

-FTA

L3 D

HT

L4

DH

T L2

DH

T L1

DH

T L3

Node1Node2

Node3

Node4Node5Node6Node7Node8Node9

Node10


MT L3

DHT L2

2OH-FTA L2

2OH-FTA L1

2OH-FTA L3

DHT L1

2OH-FTA L4

MT L4

DHT L4

MT L2

MT L1

DHT L3

LIN L1

LIN L3

LIN L2

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