Era noto da lungo tempo che attraverso la membrana

plasmatica è possibile un rapido scambio di ioni. Tuttavia,

Neher e Sakmann a cavallo tra gli anni ’70 e ’80 furono i

primi a mostrare l’esistenza di canali ionici specifici

La tecnica del patch clamp

Erwin Neher & Bert Sakmann Premi Nobel

per la medicina nel 1991 per lo sviluppo della

tecnica del patch-clamp rendendo possibile la

caratterizzazione di singoli canali ionici

La tecnica del PATCH CLAMP

Impiega un solo microelettrodo in intimo contatto con la membrana

cellulare

Lo stesso elettrodo è impiegato sia per variare il potenziale che per

misurare direttamente la corrente della membrana.

E’ possibile caratterizzare, a secondo della configurazione usata, sia i

canali ionici sottostanti l’orifizio dell’elettrodo, che quelli presenti in una parte

o in tutta la membrana

L "idea di base del PATCH CLAMP fu sviluppata da Neher e Sakmann tra il 1976 e il

1981. Il principio è riassunto nella figura seguente.

Il setup per il patch-clamp

computer

oscilloscopio

amplificatore

microelettrodo

micromanipolatore

preparato

microscopio

gabbia di Faraday

La configurazione di cell-attached

Registrazione di una corrente elettrica che fluisce attraverso un singolo canale ionico

Elettrodo di registrazione: micropipetta di vetro ~10-6 m

Resistenza della saldatura: >1 GW

Quando un singolo canale si apre, gli ioni si muoveranno attraverso il canale come una corrente elettrica

Con un opportuno equipaggiamento elettronico e opportune condizioni sperimentali è possibile misurare questa corrente “microscopica”

Amplificatore

Correnti di membrana

dovute ad un singolo canale

aperto o chiuso.

A – membrana elettricamente

eccitabile

B – Membrana chimicamente

eccitabile

Formazione del “Gigaseal”

Rs = 109 – 1010 ohm

Pipetta di vetro

Spazio extracellulare

Spazio intracellulare

Membrana cellulare

Rs=resistenza del seal

Rp=resist. della pipetta

Rin=resist. d’ingresso

Vp=potenziale della pipetta

resistenza del seal Rs

CIRCUITO EQUIVALENTE

intracellulare

extracellulare

L’elettrodo sta misurando il potenziale di riposo di una cellula la cui membrana

contiene solo canali del K aperti. All’aumentare della resistenza di seal Rs, la

misura si avvicina sempre di più al valore di EK

Una registrazione da patch richiede una forte

saldatura tra pipetta e membrana

la qualità della misura dipende da quanto si riesce a minimizzare le perturbazioni

della cellula. Nel caso di una registrazione di potenziale tale aspetto può essere

rappresentato in questo modo.

infatti:

I=EK/(RK+RS)

I=V/RS

V/RS=EK/(RK+RS)

V=EKRS/(RK+RS)

evento di singolo canale

seal buono

seal cattivo

AMPL.

Seals buoni e cattivi

In una registrazione da patch (cell-attached, inside- o outside-out), anche la

corrente attraverso il seal fluisce lungo il circuito di misurazione, aumentando il

rumore sulla corrente misurata.

Nel caso di una registrazione da patch, le correnti attraverso la saldatura (seal) non

distorcono il voltaggio o la corrente misurati, ma si sommano al rumore della

corrente.

Ad es., se la corrente attraverso il seal è dieci volte più ampia di quella attraverso il canale,

allora le fluttuazioni statistiche nel flusso di corrente prodotta dal seal sono √10 (316%) più

ampie di quanto sarebbero in un seal “perfetto”.

• La pipetta di vetro in questo caso ha una punta più grande di un elettrodo tradizionale,

perchè non deve bucare la membrana plasmatica. Ha un diametro interno di 0.5-2 µm ed è

più o meno arrotondata. E' inserita in un portaelettrodo a tenuta, a sua volta collegato con

un tubicino ad una fonte di suzione.

• Viene avvicinata alla cellula, ed a questo punto viene applicata una leggera pressione

negativa; se tutto va bene, cellula ed elettrodo aderiscono saldamente.

• Non si ottiene solo un'adesione stabile meccanicamente (se la cellula è isolata e non

aderisce al fondo della vaschetta è possibile sollevarla e spostarla a piacere), ma anche un

sigillo ad altissima resistenza elettrica (Rs) (da 1 a centinaia di Gohm - 109 ohm), cioè tale

da presentare una elevata resistenza al passaggio di corrente fuori dalla zona di contatto

fra elettrodo (riempito anche qui di soluzione conduttrice) e membrana.

• In queste condizioni, se nell'area di membrana sottesa all'elettrodo, dell'ordine di pochi

µm2, ci sono dei canali ionici, la corrente che fluisce attraverso di essi quando sono nella

conformazione "aperta" passerà attraverso l'elettrodo, senza disperdersi nello spazio

esterno, e potrà essere rilevata da un sistema di amplificazione che abbia un rumore

intrinseco sufficientemente basso (le correnti di singolo canale sono dell'ordine di 0.1-50

pA).

• Questa configurazione, chiamata CELL ATTACHED PATCH, è quella di base, da cui si

parte per tutte le successive modificazioni e applicazioni della tecnica. Essa consente

quindi di effettuare registrazioni di singolo canale ( figura seguente) in condizioni in cui la

cellula è intatta, il suo mezzo intracellulare imperturbato, in condizioni quindi il più libere

possibile da artefatti sperimentali. Si lavora in VOLTAGE CLAMP, in quanto il voltaggio

della pipetta è mantenuto ad un valore costante e che può essere variato a piacere con il

potenziale di comando; in condizioni opportune è possibile misurare l'ampiezza della

corrente in funzione del voltaggio applicato e ricavare informazioni sulla conduttanza di

singolo canale.

Inconvenienti della configurazione di cell-attached patch

• Il principale inconveniente è che il potenziale di membrana (Vm) della cellula è

sconosciuto, perchè nessun contatto con l'ambiente interno è stato realizzato, per cui è

ignoto il valore della ddp (Vc-Vm) presente ai capi del singolo canale di cui si misura la

corrente. Per ricavarlo bisogna introdurre un elettrodo tradizionale (ma così si complicano

di nuovo le cose), oppure distruggere il patch e passare alla configurazione WHOLE CELL

(vedi sotto): a volte, più semplicemente, si prende un valor medio di Vm ottenuto con

misurazioni separate, con tutti i limiti di una simile assunzione.

Sommando un gran numero di registrazioni di SCC sincronizzate,

otterremo l’evoluzione temporale della corrente macroscopica

Differenti tipi di“Patch Micropipetta

Apertura 0.5-1 mm

Bassa resistenza

Saldatura (50 MW)

Membrana cellulare

Corrente di

leakage

Corrente di

membrana Suzione

Gigaseal

(>1 GW) Una breve

suzione

rompe il

patch di

membrana

Il ponte

citoplasmatico

collassa

Il ponte

citoplasmatico

collassa

Trazione Trazione

L’esposizione

all’aria rompe

la vescicola

Trazione

in un

mezzo a

basso

Ca2+

Resistenza

dell’elettrodo

2-10 MW

Whole-cell patch clamp:

Simile alla tecnica di derivazione intracellulare.

Una bassa resistenza di accesso produce registrazioni a basso rumore.

Molti canali contribuiscono al segnale.

Un certo tipo di canali viene isolato con protocolli di voltaggio e farmaci.

Outside-out patch clamp:

Usato per valutare la risposta di singoli canali al voltaggio e a sostanze extracellulari (neurotrasmettitori ecc.).

Inside out patch clamp:

Usato per valutare la risposta di singoli canali al voltaggio e a sostanze intracellulari (secondi messaggeri ecc.).

Configurazione di WHOLE-CELL

Finora ci siamo riferiti alla condizione chiamata “cell attached” (A).

Questa è necessaria per la registrazione delle correnti di singolo canale, ma non è

l’unica “configurazione” della tecnica del patch clamp.

La condizione di ”whole cell” (B) è quella più usata. Essa

permette di registrare le correnti ioniche che attraversano

tutta la membrana, effettuando un “voltage clamp” con un

solo elettrodo anzichè due elettrodi

Naturalmente la soluzione che riempie l’elettrodo dev’essere tale da

perturbare il meno possibile la composizione ionica intracellulare.

Però le proteine intracellulari (protein-chinasi, calmoduline ecc.) vengono

inevitabilmente dilavate.. Per aggirare questo problema, si può usare le tecnica

del “perforated patch”, che consiste nel restare in ”cell-attached” aggiungendo

nell’elettrodo delle molecole che formano canali ionici non selettivi, ad es. la

Nistatina …

Che caratteristiche dovrà avere in linea di massima ?

CellulaCell-

attachedpatch

Whole-cellrecording

suzioneCellula

Cell-attached

patchWhole-cellrecording

suzione

Configurazione di whole cell patch-clamp

perfusione

elettrodo elettrodo

E' l'applicazione della tecnica del PATCH CLAMP utilizzata per ottenere i risultati di

un VOLTAGE CLAMP tradizionale. Sempre partendo dalla configurazione CELL

ATTACHED, con un 'ulteriore suzione si può rompere il patch di membrana, e

stabilire così un accesso diretto fra microelettrodo e citoplasma (vedi figura),

senza, se tutto va bene, peggiorare la qualità del sigillo.

• L'accesso è migliore di quello che si può realizzare perforando la membrana

plasmatica con un microelettrodo tradizionale, in quanto la resistenza della pipetta è

minore, e la dispersione di corrente verso il mezzo esterno è minore, grazie al sigillo ad

alta resistenza. Sempre a causa della bassa (massimo qualche Mohm) resistenza della

pipetta (dovuta al suo diametro relativamente grande), il potenziale a cui è mantenuto

l'elettrodo dal sistema elettronico di amplificazione e controllo può essere considerato in

prima approssimazione lo stesso della cellula, e le correnti che fluiscono attraverso tutta

la membrana cellulare possono essere registrate dall' elettrodo.

• Si possono così effettuare registrazioni di correnti totali in condizioni di VOLTAGE

CLAMP utilizzando un solo elettrodo.

• Tutto questo è in realtà vero se forma e dimensioni della cellula sono adeguate; se

no, il sistema non permette un mantenimento della costanza del potenziale in tutta

l'estensione della cellula, cioè un vero VOLTAGE CLAMP.

• Un importante aspetto di questa configurazione è che, dato il grande diametro della via

di accesso fra elettrodo e cellula, e dato che il volume dell'elettrodo è infinitamente più

grande di quello della cellula, ci sarà un mescolamento fra i contenuti dei due

scomparti, ed in sostanza l'ambiente citosolico si porterà in equilibrio con i soluti

contenuti nell'elettrodo. Questo può essere importante in alcuni casi, in cui si vogliano

effettuare registrazioni con un ambiente controllato sulle due facce della membrana, ma

comporta l'inconveniente che componenti citosolici importanti per la risposta che si vuole

studiare (enzimi, messaggeri interni) possono essere lavati via, diluiti.

•D'altra parte, se la cellula è di grosse dimensioni e/o di forma molto lontana da quella

sferica, può essere molto difficile non solo ottenere un buon VOLTAGE CLAMP, ma

anche una buona perfusione intracellulare.

LE ALTRE CONFIGURAZIONI DEL PATCH-CLAMP

Dalla configurazione di cell-attached, con alcune manovre sperimentali, se ne

possono ottenere delle altre, oltre a quella del whole-cell patch:

- L'INSIDE OUT PATCH

Se si ritrae l'elettrodo, è possibile, se il sigillo è molto buono, che il patch si stacchi

insieme all'elettrodo. Si ha così (figura pagina seguente) un frammento di

membrana, con uno o più canali ionici, sotteso all'orifizio dell' elettrodo, con la faccia

citoplasmatica rivolta verso la soluzione presente nella vaschetta; questa soluzione

può essere rapidamente e ripetutamente cambiata, e si può così studiare, ad

esempio, il ruolo di messaggeri intracellulari nella regolazione delle proprietà dei

canali ionici. Lo svantaggio è che, separando il canale dall'ambiente citoplasmatico,

può andare perso un qualche fattore indispensabile per l'apertura del canale stesso,

e difficilmente identificabile.

- L'OUTSIDE OUT PATCH

Quest'ultima configurazione può essere ottenuta ritraendo l'elettrodo dalla cellula

dopo che si è realizzata la configurazione WHOLE CELL. Si forma un ponte

citoplasmatico che può, spezzandosi, lasciare attaccato all'elettrodo un frammento di

membrana plasmatica con la faccia esterna rivolta verso il contenuto della vaschetta,

e quella citoplasmatica verso l'interno dell'elettrodo. Si possono così effettuare

registrazioni di singolo canale, con l'opportunità in questo caso di cambiare

facilmente la composizione del mezzo presente sulla faccia esterna della membrana,

e studiare gli effetti di sostanze (agonisti, bloccanti) che possono influenzare le

proprietà dei canali presenti in quel patch.

Dalla configurazione “whole cell” si può facilmente passare alla

configurazione di “outside out”, nella quale il patch presenta

all’esterno dell’elettrodo il versante extracellulare della membrana.

Configurazione di OUTSIDE-OUT

Configurazione di OUTSIDE-OUT

L’outside-out è molto utile per studiare le correnti di singolo canale date dai

recettori-canale, come ad esempio il recettore nicotinico per l’acetilcolina …

Configurazione di INSIDE-OUT

La quarta config. è l’ “inside out” (B), nella quale il patch presenta

all’esterno dell’elettrodo il versante intracellulare della membrana.

La sua principale applicazione è

nello studio dei canali chemio-

dipendenti attivati per via

indiretta dal versante

intracellulare, facendo arrivare

sul patch ad es. proteine-G, o

secondi messaggeri, o protein-

chinasi, ecc. .

Più avanti vedremo come questa

configurazione sia stata

fondamentale nello studio dei

canali “GIRK”

Alcune considerazioni generali sul patch clamp

• In tutti i quattro casi descritti sopra si parte, comunque, dalla formazione di un sigillo fra

pipetta e membrana. Perchè questo possa avvenire è necessario che sia l'elettrodo che il

mezzo in cui è tenuto il preparato siano il più puliti possibile, ma anche, che la membrana

plasmatica della cellula da cui si vuole registrare non presenti detriti o sostanze che

possano ostacolare il contatto col vetro della micropipetta. Per ridurre questi problemi è

consigliato filtrare il mezzo dell'elettrodo subito prima del riempimento e di avvicinarsi alla

cellula applicando una lieve pressione positiva che allontana eventuali frammenti dalla

punta dell'elettrodo.

Si può più facilmente realizzare una situazione di cellule pulite effettuando un leggero

trattamento enzimatico, o utilizzando cellule isolate, dissociate enzimaticamente o in

coltura. Ed è proprio lo sviluppo, soprattutto a partire dagli anni '70, delle tecniche di

preparazione di colture cellulari che ha consentito la grande e rapida diffusione del

PATCH CLAMP. Un successivo sviluppo, che ha avuto un impatto notevole in

neurobiologia, è legato alla possibilità di lavorare su fettine di SN: è stato così

possibile effettuare registrazioni da cellule che conservano, almeno in parte, le

loro normali relazioni funzionali.

• Nonostante la tecnica sia stata sviluppata all'inizio soprattutto per poter registrare gli

eventi di singolo canale, la configurazione più utilizzata è sicuramente quella di WHOLE

CELL. Questo sviluppo, in parte imprevisto, è attribuibile a vari fattori.

• Innanzitutto, le misure di singolo canale, molto importanti per determinare in maniera

diretta le proprietà molecolari dei canali (cinetiche, meccanismi di blocco, ecc.) hanno

senso compiuto solo se vengono utilizzate su preparati di cui siano note le proprietà

elettrofisiologiche macroscopiche. Nel caso di molti tipi cellulari le cui proprietà sono state

studiate solo nell'ultimo decennio, questo ha voluto dire fare prima (o comunque anche) gli

esperimenti di WHOLE CELL.

• Grazie a questa tecnica è stato possibile studiare le proprietà elettrofisiologiche di

piccoli neuroni, cellule ghiandolari, cellule muscolari lisce e cardiociti, fibroblasti, cellule

epiteliali e linfociti, tutte cellule che era molto difficile studiare con le tecniche di VOLTAGE

CLAMP tradizionali. Grazie a questi dieci e più anni di nuova elettrofisiologia, oltre che alle

nuove tecniche di biologia cellulare e molecolare, è scaturito un panorama molto più vario

e complesso della natura e del ruolo degli eventi elettrici a livello cellulare. Se la nuova

tecnica ha consentito di allargare la nostra visione al di là dei preparati "classici", nervo e

muscolo, ha avuto anche un impatto profondo sulla neurofisiologia: la possibilità di

registrare dalle arborizzazioni dendritiche e dai terminali pre- e postsinaptici ha fatto

sì che la concezione della cellula nervosa come semplice relè cedesse il posto ad una

visione più complessa ed articolata, e che si potessero gettare le basi, a livello cellulare,

della comprensione di fenomeni fondamentali come la memoria.

Ulteriori sviluppi ed applicazioni.

• In questi anni ci sono stati importanti sviluppi tecnici in varie direzioni (a parte l'uso

delle fettine di SN cui abbiamo già accennato), per allargare le potenzialità della tecnica

e cercare di superare alcuni suoi inconvenienti.

• Uno dei problemi principali legati all'uso del WHOLE CELL PATCH CLAMP, è come

abbiamo visto, legato alla perfusione interna della cellula da parte del contenuto dell'

elettrodo: questo problema è stato affrontato in due modi radicalmente diversi.

Il primo approccio consiste nello sfruttare compiutamente questo fatto, realizzando un

sistema che consenta di cambiare rapidamente la soluzione contenuta nell'elettrodo: se

la cellula non è troppo grande si può pensare che in tempi relativamente rapidi (decine di

secondi) le variazioni si ripercuotano sulla composizione dell 'ambiente intracellulare.

• E' una tecnica abbastanza difficile da usare come routine, ma è stata impiegata da vari

laboratori per studiare gli effetti di messaggeri intracellulari sulla regolazione delle

correnti ioniche. Una recente variazione sul tema consiste nell'uso dei cosiddetti caged

compounds, molecole o ioni legati ad un inibitore da cui possono .essere liberate per

fotolisi con un flash di luce UV. Si mette il composto caged nell'elettrodo, si realizza la

condizione di WHOLE CELL, si inizia la registrazione, e poi si libera per fotolisi la

sostanza (calcio, IP3' ecc.), la cui concentrazione aumenta così istantaneamente,

consentendo di osservare eventuali effetti rapidi sulle correnti.

• Il secondo approccio punta ad evitare gli inconvenienti della diluizione dei

componenti citosolici solubili: questa modificazione della tecnica di base va sotto il

nome di "perforated patch" o di "slow whole celI". Si tratta in sostanza di realizzare

un CELL ATTACHED PATCH con un elettrodo riempito con una soluzione che

contiene sostanze permeabilizzanti (ATP in alcuni casi, o più comunemente, nistatina

o anfotericina, tutte molecole che formano pori ionici nelle membrane): le piccole

molecole e gli elettroliti possono essere scambiati, mentre le macromolecole

citosoliche non possono uscire dalla cellula. Si possono così effettuare registrazioni di

eventi elettrici, anche in condizioni di VOLTAGE CLAMP, senza che la biochimica

della cellula sia perturbata.

• Un altro tipo di misure che si può realizzare in condizioni di WHOLE CELL CLAMP è

quello della capacità della membrana (con opportuni amplificatori): è stato così

possibile, ad esempio, studiare in maniera quantitativa l'accoppiamento eccitamento-

esocitosi in diversi preparati.

• Sono state infine effettuate registrazioni da strutture subcellulari isolate, come i

mitocondri, la membrana nucleare, il reticolo endoplasmatico: da frazioni cellulari (il

"whole terminal" patch su terminali presinaptici; il "perforated vescicle patch", che

consiste nello staccare dalla cellula e trattenere nella pipetta, non un patch di

membrana isolato, ma una vescicola contenente anche organelli subcellulari).

AMPLIFICATORI OPERAZIONALI

L’amplificatore operazionale ideale (A.O.) è essenzialmente, un

amplificatore di tensione, avente le seguenti caratteristiche:

guadagno infinito;

ingresso differenziale;

impedenza di ingresso infinita e impedenza di uscita nulla.

V V 1 1 : tensione sull’ingresso

invertente

V V 2 2 : tensione sull’ingresso

non invertente

+ + V V cc cc

e - - V V cc cc

:tensioni di

alimentazione

V V 0 0 : tensione di uscita

+

– V V

1

V V 2

V V + +

cc

V V - -

cc

V V 0

+

– V V

1

V V 2

V V + +

cc

V V - -

cc

V V 0

V V 1 1 : tensione sull’ingresso

invertente

V V 2 2 : tensione sull’ingresso

non invertente

+ + V V cc cc

e - - V V cc cc

:tensioni di

alimentazione

V V 0 0 : tensione di uscita

+

– V V 1

V V 2

V V + + cc

V V - - cc

V V 0 +

– V V 1

V V 2

V V + + cc

V V - - cc

V V 0 1 2 0 V A V A V - + - =

L’AO può essere definito funzionalmente come un amplificatore differenziale, cioè

un dispositivo attivo a tre terminali che genera al terminale di uscita una tensione

proporzionale alla differenza delle tensioni fornite ai due terminali di ingresso.

Il segnale di uscita V0 è il risultato della somma tra il segnale applicato

all’ingresso invertente, V1, invertito di segno e amplificato di un fattore A-, con

il segnale all’ingresso non invertente, V2 , a sua volta amplificato di fattore A+.

Compensazione dei potenziali di giunzione

Un notevole contributo ai potenziali misurati presenti all’uscita

dell’amplificatore è dato dalla somma dei vari potenziali di giunzione o di

diffusione.

Questi sono generati ogniqualvolta metalli (elettrodi) sono in contatto

con soluzioni ioniche oppure soluzioni con diverse concentrazioni sono in

contatto fra loro (punta del microelettrodo.

Si può eliminare la somma di tutti questi potenziali introducendo, per

mezzo del comando offset dell’amplificatore, un potenziale di segno

opposto quando il microelettrodo si trova nel bagno esterno, prima di

penetrare la cellula.