LA RICERCA SULLA SCLEROSI MULTIPLA · 2019-05-22 · Magliozzi Roberta 43 Studio neuropatologico e...

LA RICERCA SULLASCLEROSI MULTIPLA

Finanziata dalla

Fondazione Italiana Sclerosi Multipla

2015

A cura diRoberta GuglielminoArea Ricerca scientifica AISM-FISM

Coordinamento editorialeSilvia ZinoArea Comunicazione e Ufficio Stampa AISM

Progetto graficoFrancesca Massa

Copyright 2015Fondazione Italiana Sclerosi Multipla

Fondazione Italiana Sclerosi Multipla - OnlusVia Operai 40 - 16149 GenovaTel. 010 27 13 226Fax 010 27 13 [email protected]

Tutti i diritti sono riservati. È vietata la riproduzione con qualsiasi mezzo,anche se parziale, senza il permesso scritto dell’editore

Pubblicato e distribuito daAssociazione Italiana Sclerosi Multipla - OnlusVia Operai, 40 - 16149 Genova

ISBN 9788871481043

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INDICE / INDEX

INTRODUZIONE / INTRODUCTIONMario A. Battaglia 7

Insieme, siamo più forti della sclerosimultipla / Together, we are stronger thanmultiple sclerosisPaola Zaratin 11

NEURORIABILITAZIONE E QUALITàDELLA VITA / NEUROREHABILITATIONAND QUALITY OF LIFE

Filippi Massimo 16Definizione della rete di connettività strutturale e fun-zionale nella sclerosi multipla tramite l’applicazionedell’approccio “graph theory”Mapping structural and functional brain networks inmultiple sclerosis: a graph theory approach

Filippi Massimo 19Mappatura regionale della struttura e delle funzionidell’ippocampo nella sclerosi multipla: correlazioni conle forme cliniche della malattia e con il deficit cognitivoRegional mapping of hippocampal structure and fun-ction in multiple sclerosis: correlations with disease cli-nical phenotypes and cognitive impairment

Bove Marco 22L’impatto della riabilitazione motoria e cognitiva sulleproprietà dinamiche della struttura cerebrale: verso lapersonalizzazione di interventi terapeutici in pazienti af-fetti da sclerosi multiplaThe impact of motor and cognitive rehabilitation on thedynamic properties of brain structure: towards the in-dividual tailoring of therapeutic interventions in multiplesclerosis patients

Trompetto Carlo 26Effetto delle onde d’urto sulla rigidità della caviglia inpazienti con sclerosi multiplaEffects of shock waves on ankle stiffness in patientswith multiple sclerosis

Restivo Domenico Antonio 29Valutazione dell’efficacia della stimolazione transcrani-ca a corrente diretta (tDCS) nella disfagia associata asclerosi multipla

Transcranial direct current stimulation (tcs) for dyspha-gia associated to multiple sclerosis

Malucchi Simona 31Studio longitudinale sul funzionamento neuropsicolo-gico in pazienti con sclerosi multipla in confronto conla popolazione generaleLongitudinal study of neuropsychological functioningin multiple sclerosis patients in comparison to generalpopulation

Furlan Pier Maria 34L’efficacia dell’Eye Movement Desensitization and Re-processing (EMDR) in pazienti con disturbo post trau-matico da stress con diagnosi di sclerosi multipla. Unostudio randomizzato controllatoThe efficacy of Eye Movement Desensitization and Re-processing (EMDR) in patients with post-traumaticstress disorder in multiple sclerosis. A randomized con-trolled trial

CLASSIFICAZIONE E DIAGNOSI DELLAMALATTIA / DISEASE CLASSIFICATIONAND DIAGNOSIS

Martucci Morena 38Identificazione di marcatori infiammatori e dei relativimeccanismi specifici per la sclerosi multiplaIdentification of inflammatory biomarkers related to un-derlying multiple sclerosis specific mechanisms

Martinelli Vittorio 41Caratterizzazione di profili di espressione di geni e dimicroRNA da cellule di sangue perifierico di pazienti af-fetti da sclerosi multiplaCharacterization of genes and microRNAs expressionprofiles from peripheral blood cells in patients affectedby multiple sclerosis

Magliozzi Roberta 43Studio neuropatologico e molecolare mirato a compren-dere la relazione tra processo infiammatorio nelle me-ningi e danno cerebrale corticale nella sclerosi multiplaA combined neuropathological and molecular studyaddressing the link between meningeal inflammationand cortical brain damage in multiple sclerosis

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PATOGENESI E FATTORI DI RISCHIO /PATHOGENESIS AND RISK FACTORS

Salvetti Marco 48Caratterizzazione dei genotipi del virus di Epstein-Barrnella sclerosi multipla attraverso approcci di sequen-ziamento massivoCharacterization of Epstein-Barr virus genotypes inmultiple sclerosis through next generation sequencingapproaches

D’Alfonso Sandra 51Mappatura fine dei loci di suscettibilità alla sclerosimultipla nella popolazione dell’Italia continentale: daimarcatori genetici identificati attraverso studi di asso-ciazione genome-wide alle varianti causaliFine-Scale mapping of multiple sclerosis loci in theContinental Italian population: from tag genetic markersidentified in Genome Wide Association studies to cau-sal variants

Bergamaschi Laura 56Analisi molecolare dell’espressione allele specifica diIL-7Ralpha e il suo effetto sul segnale mediato da IL-7in cellule: mDC, CD4+ e CD8+ isolate da pazienti consclerosi multipla e controlli saniMolecular analysis of IL-7Ralpha allele specific expres-sion and IL7 signaling in mDCs, CD4+ and CD8+ T cellsfrom multiple sclerosis patients and controls

Di Luca Dario 59Studio delle alterazioni nelle risposte antivirali dell’im-munità innata in pazienti con sclerosi multiplaStudy of altered antiviral innate immunity responses inmultiple sclerosis patients

Musio Silvia 61Il ruolo dei basofili nella encefalite autoimmune speri-mentale, un modello animale di sclerosi multiplaThe role of basophils in experimental autoimmune en-cephalomyelitis, a mouse model of multiple sclerosis

Lucca Liliana Elisa 64Linfociti T che co-riconoscono antigeni mielinici e neu-ronali: tolleranza immunologica e contributo relativoall’autoimmunità del sistema nervoso centraleMyelin reactive T-cells that co-recognise a neuronal an-tigen: immune tolerance and relative contribution tocentral nervous system autoimmunity

Falcone Marika 67

Ruolo dei meccanismi immunoregolatori intestinali nellapatogenesi della sclerosi multiplaGut immune regulation in multiple sclerosis patients

Martire Serena 70Studio dei meccanismi alla base della deregolazionedel gene anti-infiammatorio TNFAIP3 in pazienti consclerosi multiplaDeeper insight into the mechanisms underlying the de-regulation of the anti-inflammatory gene TNFAIP3 in pa-tients with multiple sclerosis

Sambucci Manolo 73Ruolo svolto dall’immunosenescenza nell’insorgenza enella progressione della sclerosi multiplaA role for immunosenescence in the onset and progres-sion of multiple sclerosis

Valtorta Flavia 76Ruolo delle citochine pro- e anti-infiammatorie nellamodulazione dell’attività e della composizione presi-naptica: nuove prospettive nella ricerca sulla sclerosimultiplaRole of pro- and anti-inflammatory cytokines in the mo-dulation of presynaptic composition and functioning:new perspectives in multiple sclerosis research

Falco Anna 79Regolazione degli interneuroni cerebrali e spinali daparte delle GTPasi RacRegulation of cerebral and spinal interneurons by RacGTPases

Vinet Jonathan 82Caratterizzazione di un fenotipo microgliale favorevolealla rimielinizzazioneCharacterization of a supportive phenotype of microgliatoward remyelination

VERSO NUOVI TRATTAMENTI /TOWARDS NEW TREATMENTS

Furlan Roberto 85IL-27 e IL 35 nella encefalomielite autoimmune speri-mentale: un affare di famigliaIL-27 and IL-35 in experimental autoimmune encepha-lomyelitis: a family affair

COMPENDIO 2015

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Pluchino Stefano 87

RNA non codificanti e plasticità terapeutica delle cellulestaminali neuraliNoncoding RNAs and therapeutic plasticity of neuralstem cells

Agresti Cristina 91Studio del ruolo dei recettori del TNF durante i processidi demielinizzazione e rimielinizzazioneStudies on TNF receptor signalling during demyelina-tion and remyelination

Uccelli Antonio 94Studio di un modello murino transgenico per la carat-terizzazione del proteoglicano NG2/CSPG4 nella pato-genesi della sclerosi multiplaExploitation of a transgenic mouse model for the un-veiling of the role of proteoglycan NG2/CSPG4 in thepathogenesis of multiple sclerosis

Leocani Letizia 97Stimolazione cerebrale transcranica a corrente direttacome terapia immunomodulante nella sclerosi multipla:studio pilota in modelli muriniBrain tDCS as a disease-modifying treatment of multi-ple sclerosis: a pilot study in mice models

Tuosto Loretta 99Caratterizzazione delle vie di segnalazione del CD28come bersagli terapeutici nella regolazione della tolle-ranza immunologica nella sclerosi multiplaCharacterization of CD28 signalling pathways as the-rapeutic targets to regulate immune tolerance in multi-ple sclerosis

Chiocchetti Annalisa 102Ruolo di Osteopontin a degli anticorpi anti-Osteopon-tina nella sclerosi multiplaRole of Osteopontin and anti Osteopontin antibodiesin multiple sclerosis

Boscia Francesca 105Studio del ruolo dell’isoforma dello scambiatoreNa+/Ca2+ NCX3 nelle cellule oligodendrocitiche per in-dividuare nuove strategie terapeutiche per il controllodella demielinizzazione e rimielinizzazione nella sclerosimultiplaExploring the role of the Na+/Ca2+ exchanger NCX3 inoligodendrocytes to establish new strategies to controldemyelination and remyelination in multiple sclerosis

De Simone Roberta 108

I mitocondri come bersagli e mediatori degli effetti be-nefici degli agonisti PPARγ nella sclerosi multiplaMitochondria as targets and mediators of the PPARγagonist beneficial effects in multiple sclerosis

PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIOFINANZIATI DALLA FISM /FISM FUNDED RESEARCH PROJECTS AND FELLOW-

SHIPS

2014, 2013 113

COMITATO SCIENTIFICO FISM /FISM SCIENTIFIC COMMITTEE

2014, 2013 120

LISTA DEGLI AUTORI /LIST OF THE AUTHORS 126

INDICE / INDEX

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«Si deve assicurare lo sviluppo continuo di una ricerca rigorosa e innovativa, capace di produrre evi-denze che impattino sulla vita delle persone con SM»: così l’Associazione Italiana Sclerosi Multipla,

AISM, apre l’Agenda della Sclerosi Multipla che presenta nella Settimana Nazionale 2015 della SM.

Un’Agenda che, come vuole la parola stessa, mette in rilievo le azioni quotidiane necessarie per concretizzarequella “Carta dei Diritti delle persone con SM” che tanti ricercatori hanno firmato e condiviso durante il Con-gresso 2014 della Fondazione di AISM.

Infatti, il punto di partenza della ricerca scientifica che AISM da 47 anni indirizza, promuove e sostiene è an-che la sua meta: arrivare a sconfiggere definitivamente la sclerosi multipla affermando il diritto delle personecon SM ad essere anzitutto persone, cioè ad avere dalla ricerca le risposte che consentano loro di metterein opera al meglio le proprie qualità umane e professionali. In una parola, di essere “protagonisti” dellapropria storia e “risorse” per la collettività, prima che “pazienti”.

La strada per arrivare a dare risposte concrete alla persona con SM, che è sempre l’autentico centro di ogniricerca scientifica promossa da AISM, è sostanzialmente una: bisogna mettersi insieme, tutti gli attori devonocooperare, verso questo stesso obiettivo.

Bisogna che ciascun ricercatore collochi sempre la propria ricerca nel quadro ampio composto da tutto ciòche gli altri ricercatori nel mondo stanno scoprendo, favorendo interazioni e sinergie in grado di valorizzaresempre più i risultati della ricerca.

Ecco un punto nodale, che emerge leggendo questo prezioso Compendio dei 23 progetti di ricerca e delle8 borse di studio finanziate dalla Fondazione di AISM e conclusi nel 2014: è fondamentale che ogni ricercasulla SM si interfacci con l’insieme di tutte le altre. Le ricerche in neuro-riabilitazione, capaci di mostrarel’impatto della riabilitazione sulle funzionalità e sulla struttura del sistema nervoso centrale, devono neces-sariamente essere connesse con le ricerche impegnate a migliorare gli strumenti per la classificazione e di-agnosi della malattia, con gli studi che indagano innovativi meccanismi patogenetici e fattori di rischio econ le ricerche impegnate a valutare se i fattori individuati possono diventare bersaglio di nuovi trattamentiterapeutici.

È e sarà sempre più determinante che la ricerca innovativa e di eccellenza, finanziata dai Bandi FISM, sicostruisca in sinergia stretta con una ricerca traslazionale e clinica fortemente promossa da iniziative speciali,indirizzata a rispondere alle emergenze ancora orfane di risposte, come quelle legate alla piena compren-sione e al trattamento delle forme progressive di sclerosi multipla.

Vale insomma per la ricerca quella visione che in altri campi della storia propose Mahatma Ghandi: «Unagoccia strappata dall’oceano perisce inutilmente. Se rimane parte dell’oceano, ne condivide la gloria di sor-reggere una flotta di poderose navi».

A ben guardare, le ricerche pubblicate in questo Compendio, dimostrano come i risultati raggiunti dalla«scuola di ricerca» promossa da FISM siano molto più che singole gocce in un oceano:

i 52,5 milioni di euro investiti da FISM negli ultimi 25 anni, serviti a finanziare 360 ricercatori dal 1987 sinoad oggi, con 439 progetti di ricerca e 145 borse di studio, così come le 111 pubblicazioni realizzate nel 2014(che portano a 752 il totale degli studi FISM pubblicati dal 2007 al 2014) stanno costruendo un mondo sem-pre più libero dalla SM.

Introduzione

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COMPENDIO 2015

E questo è riconosciuto da tutti gli stakeholder di AISM: in una ricerca commissionata nel 2013 al CENSIS,i diversi “azionisti sociali” di AISM e l’intera opinione pubblica italiana evidenziano in particolare «un’eccel-lenza nel supporto che l’Associazione fornisce da tempo e con continuità alla ricerca scientifica, con studiche hanno consentito di individuare terapie in grado di migliorare la qualità della vita dei pazienti» e di trattarela malattia.

Dunque la via è collaborare per consentire alle persone di essere più forti della sclerosi multipla e possiamodire che lo stiamo già facendo da tempo.

Ma dobbiamo farlo ancora meglio, più velocemente, più efficacemente e senza barriere geografiche o“politiche”. Domani è già oggi. Lo chiedono e lo meritano tutte le persone con SM.

Mario A. Battaglia

Presidente FISM

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“We must ensure the continuous development of rigorous and innovative research, capable to produce ev-idence that impacts on the lives of people with MS”: this is how the Italian Multiple Sclerosis Association,

AISM, opens the Agenda of Multiple Sclerosis to be presented during the 2015 National Week of MS.

Agenda that, according to the word itself, emphasises the daily actions necessary to implement the “Bill of Rightsof people with MS” that many researchers have signed and shared during the 2014 Congress of AISM Foundation.

The scientific research that AISM, through its Foundation, influences, promotes and supports, and is documentedprecisely by this Compendium, is proof that there exists a rigorous research to give answer to people with MS to-ward the final goal to create a world that is finally free of multiple sclerosis.

And to arrive to give specific answers to the persons with MS, which is always the authentic focus of all scientificresearch promoted by AISM, it is fundamental to get together, all the actors must work together towards thissame goal.

Each researcher must always place his own research in the broad framework of worldwide research, fostering in-teractions and synergies that will enhance more and more research results.

The key point that emerges reading this valuable Compendium (23 research projects and 8 fellowships funded bythe Italian MS Foundation) states that: it is crucial that every MS research interfaces with the set of all the others.The research in neurorehabilitation, able to show the impact on central nervous system functionality and structure,has to be connected with research undertaken to improve the tools for classification and diagnosis of the disease,with studies investigating innovative pathogenic mechanisms and risk factors and with research devoted to assesspotential targets of new therapeutic treatments.

It is and it will be increasingly important that the innovative and excellence research, funded by FISM annual call,is built in close synergy with a translational and clinical research strongly promoted by special initiatives to respondto emergencies still orphan of responses, such as those related to full understanding and treatment of progressiveforms of multiple sclerosis.

What Mahatma Ghandi proposed in other fields of history is therefore valid for research: “A drop torn from theocean perishes without doing any good. If it remains a part of the ocean, it shares the glory of carrying on itsbosom a fleet of mighty ships.” The studies published in this Compendium show that the results achieved by the“FISM school” of researchers are much more than individual drops in the ocean:

52.5 million euro invested by FISM in the last 25 years, that helped finance 360 researchers from 1987 to date,with 439 research projects and 145 fellowships, as well as 111 publications produced in 2014 (leading the totalof FISM studies published from 2007 to 2014 to 752) are building a world increasingly free from MS.

The results of a study commissioned by AISM in 2013 to CENSIS, showed that all the AISM stakeholders recog-nised the value of the scientific research always promoted by AISM, that allowed to identify therapies to treat dis-ease and to improve the quality of life of patients.

Therefore to be stronger than multiple sclerosis we have to work together. We are already doing this, but we mustdo it better, faster, more efficiently and with no geographical barriers or “policies”. Tomorrow is already today. Allthe people with MS demand and deserve it.

Mario A. Battaglia

Presidente FISM

Introduction

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«Together we are stronger than MS». Insieme noi siamo più forti della sclerosi multipla. Il motto sceltodalla Federazione Internazionale della Sclerosi Multipla per la Giornata Mondiale della SM 2015 è

quanto di più appropriato si possa individuare per fotografare la ricerca sulla sclerosi multipla. Quel “noi”raccoglie, infatti, anche i più recenti e promettenti indirizzi della ricerca sulla sclerosi multipla.Lavorare insieme per abbattere le barriere della malattia in tutto il mondo è il tema della Giornata Mondialedella SM di quest’anno e quindi promuovere una cooperazione internazionale sempre più integrata è unpassaggio obbligato per soddisfare i diritti delle persone con SM.

Da qui nasce la necessità di definire un’agenda globale della ricerca sulla SM e indirizzare tutte le risorsenelle aree di ricerca innovative e strategiche.

L’Associazione, insieme alla sua Fondazione, crede che l’identificazione e l’utilizzo diversificato di nuovi mo-delli di promozione e finanziamento della ricerca e di cooperazione siano una condizione fondamentale pervincere questa sfida, e che meritino attenzione e risorse.

Negli anni FISM ha sviluppato una mappa strategica di promozione e finanziamento della ricerca (Zaratin Pet al. Trends in Pharmacological Sciences 2014) che ha permesso di investire nell’innovazione, aumentarei successi nella conoscenza dei meccanismi coinvolti nella malattia, di migliorare la diagnosi della malattiae della sua progressione, di supportare terapie ‘orfane’ quali quelle con le cellule staminali e dimostrare l’im-portanza del trattamento riabilitativo.

È importante mantenere viva l’innovazione della ricerca e far sì che questa innovazione venga presa in caricoda reti e collaborazioni in grado di tradurla in risposte concrete per la persona con SM. Questa è una sfidache richiede la cooperazione di tutti gli attori coinvolti che lavorano insieme condividendo rischi e risorseverso un obiettivo comune. Questo sarà possibile solo definendo metriche di impatto della ricerca che sianosignificative e riconosciute da ciascuna parte interessata e funzionali all’obiettivo comune da raggiungere.In questo processo è fondamentale il ruolo svolto da AISM che ha diversi gradi di coinvolgimento nei progettidi ricerca: da finanziatore a promotore fino ad essere collaboratore e/o partner della ricerca stessa. Solo inquesto modo la ricerca sarà stimolata a non limitarsi metaforicamente a ‘cogliere la frutta che cresce suirami più bassi’ (low hanging fruit) e a rispondere invece ai bisogni ancora privi di risposta (unmeet needs).

In questo orizzonte, l’esempio più consistente è rappresentato da uno dei «Progetti speciali» 2014, l’Inter-national Progressive Multiple Sclerosis Alliance (PMSA), di cui AISM è capofila. La PMSA nel 2014 ha lanciatoil suo secondo Bando di ricerca internazionale per favorire la formazione di network collaborativi globali dieccellenza impegnati nella ricerca per le forme progressive di SM. Tali network dovranno essere costituitida almeno tre organizzazioni, rappresentate da un minimo di tre Nazioni. Questi network dovranno promuo-vere attività di ricerca integrate e lo scambio di conoscenze in aree di ricerca chiave per lo sviluppo di can-didati preclinici di potenziali farmaci, la validazione di misure cliniche significative (‘outcome’) da integrateprecocemente negli studi clinici e l’avvio di nuove sperimentazioni cliniche farmacologiche e riabilitative perla SM progressiva.

In questa stessa ottica di network trovano pieno significato anche gli investimenti di FISM per la costruzionedi Registri di malattia sia nazionali che internazionali, come strumenti di ricerca scientifica per lo sviluppo distudi epidemiologici e clinici e di programmazione sanitaria. Lo stesso vale per l’impegno della Fondazionedi AISM nel promuovere e realizzare la ricerca in neuro-riabilitazione volta alla personalizzazione dei tratta-menti. Tutti i risultati prodotti dalla ricerca contribuiranno a sviluppare nuovi trattamenti terapeutici riabilitativie a fornire utili indicazioni anche al Servizio Sanitario Nazionale per ottimizzare la pianificazione sanitaria delterritorio.

Questo Compendio si apre proprio con la presentazione degli studi in neuro-riabilitazione e qualità della vitaconclusi nel 2014. È sempre più chiaro, infatti, che promuovere la cooperazione nazionale ed internazionalerisulta un passaggio obbligato anche per aumentare l’accesso delle persone con SM ad un trattamento ria-bilitativo personalizzato. Dimostrare l’impatto della riabilitazione sull’attività di malattia e la centralità della

Insieme, siamo più forti della sclerosi multipla

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persona nella gestione del trattamento riabilitativo sono sfide che si possono vincere solo attraverso una ri-cerca cooperativa.

Ma la dimensione collaborativa della ricerca attraversa già tutti gli ambiti finanziati con i precedenti Bandidella Fondazione di AISM.

Un dato, ripreso sinteticamente delle ricerche presentate in questo Compendio, può essere rappresentativodi questa tendenza collaborativa che è già in atto e va implementata ma non inventata: tolte le 8 Borse distudio che, per definizione, sono proposte da un singolo ricercatore con un proprio mentore, sui 23 studiqui presentati e conclusi, 12 indicano di essere stati effettuati in collaborazione tra diversi gruppi di ricerca,operanti anche a livello internazionale.

Ed è significativo che le collaborazioni si intensifichino nei progetti qui raggruppati sotto i titoli “Patogenesie fattori di rischio” e “Verso nuovi trattamenti”. Quanto più ci si avvicina alla fase clinica tanto più diventanecessario integrare competenze, banche dati e risorse.

L’auspicio e il desiderio con cui ogni anno la Fondazione di AISM organizza il Congresso scientifico cuiinvita caldamente tutti i ricercatori che finanzia e segue, del resto, è esattamente quello di favorire e rafforzarela collaborazione tra i ricercatori e tra i ricercatori e altri attori importanti.

Come dice un proverbio africano: «Se vuoi arrivare primo, corri da solo. Se vuoi arrivare lontano, camminainsieme».

Paola Zaratin

Direttore Ricerca Scientifica

COMPENDIO 2015

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“Together we are stronger than MS.” The motto chosen by the International Federation of Multiple Scle-rosis for the 2015 World MS Day is the most appropriate we can find to depict overall the research on

multiple sclerosis. “We” includes, in fact, the most recent and promising directions of research on multiplesclerosis.

This year World MS Day focuses on working together to break down barriers of the disease in the world andthus, to promote increasingly integrated international cooperation is a necessary step to satisfy the rightsof people with MS.

Hence, a necessity to define a global MS research agenda and direct all resources in areas of innovativeand strategic research arises.

The Association, together with its Foundation, believes that identification and use of new models of diver-sified promotion, funding of research and co-operation are a fundamental condition to win this challenge,and therefore they deserve attention and resources.

Over the years, FISM has developed a strategic map for promoting and funding research (Zaratin P et al. Trendsin Pharmacological Sciences 2014) that allowed to invest in innovation, to increase the success in the knowledgeof the mechanisms involved in the disease, to improve diagnosis of disease and its progression, to support “or-phan” therapies such as stem cell therapy and to demonstrate the importance of rehabilitation treatment.

It is important to keep research innovation alive and to ensure that this innovation is taken over by networksand collaborations that can translate it into specific answers for the person with MS. This is a challenge thatrequires the cooperation of all factors involved in working together, sharing risks and resources towards acommon goal. This will only be possible by defining research impact metrics, which are significant and rec-ognized by each interested party and functional to the common goal to reach.

In this process the role played by AISM is essential with varying degrees of involvement in research projects:from funder to promoter, up to be a collaborator and / or a partner of research itself. Only in this way MScommunity will be stimulated to reap ‘high hanging fruits’ and to respond to the still unanswered needs (un-met needs).

In this context, the most significant example is represented by one of 2014 “special projects” the InternationalProgressive Multiple Sclerosis Alliance (PMSA), of which AISM is one of the managing MS Society The PMSAin 2014 launched its second RFA for international research to facilitate a formation of collaborative globalnetwork of excellence committed to the search for progressive forms of MS. These networks will be com-posed of at least three organisations, representing a minimum of three Nations. These networks should pro-mote integrated research activities and exchange of knowledge in key areas of research for the developmentof preclinical candidates of potential drugs, the validation of significant clinical measures (‘outcome’) fromintegrated early clinical studies and the launch of new pharmacological and rehabilitative clinical trials forprogressive MS.

In this same view of network the Italian Multiple Sclerosis Association, through its Foundation, promotesand supports the development of disease Registries, both national and international, in order to improvethe coverage and the efficiency of the collection of clinical and epidemiological data.

The same applies to the AISM Foundation’s commitment to promote and carry out research in neuroreha-bilitation aimed at personalising treatments. All the results produced by the research will help to developnew therapeutic rehabilitation and also provide useful information to the National Health Service in order tooptimize health planning on the territory.

This Compendium opens with the presentation of the neurorehabilitation and quality of life studies concludedin 2014. It is increasingly clear, in fact, that promotion of national and international cooperation is also a nec-essary step to increase the access of people with MS to a personalised rehabilitation treatment. Demon-strating the impact of rehabilitation on the activity of the disease and the importance of the individual in themanagement of rehabilitation treatment are challenges that can be overcome only by a cooperative research.

Together, we are stronger than multiple sclerosis

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But the collaborative dimension of the research was already present in previous FISM Calls.

A fact, briefly resumed in the research presented in this Compendium, may be representative of this collab-orative tendency that is already in action and should be implemented but not invented: except for the 8 Fel-lowships which, by definition, are proposed by an individual researcher 12 studies out of the 23 presentedhere were carried out in collaboration between different research groups operating at the international level.

And it is significant that the collaborations will intensify in the projects here grouped under the headings“Pathogenesis and Risk Factors” and “Towards new treatments.” The closer we approach the clinical phase,the more it becomes necessary to integrate expertise, databases and resources.

This is the reason why FISM organises every year its Scientific Congress and warmly urges all researchersthat it finances and follows to participate; FISM wants to encourage and strengthen collaboration betweenresearchers themselves and between researchers and other important stakeholders.

As an African proverb says: “If you wish to arrive first, run alone. If you wish to go far, walk together.”

Paola Zaratin

Direttore Ricerca Scientifica

COMPENDIO 2015

NEURORIABILITAZIONE EQUALITà DELLA VITA

NEUROREHABILITATION AND QUALITY OF LIFE

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PREMESSE E oBiETTiViLa variabilità interindividuale della distribuzione deldanno strutturale e l’efficienza dei meccanismi diplasticità corticale sono tra i fattori responsabilidell’accumulo di disabilità clinica nei pazienti consclerosi multipla (SM). La maggior parte degli studiprecedenti ha analizzato specifiche reti neuronali(per esempio quella motoria) al fine di valutare la re-lazione tra una loro disfunzione e la disabilità clinicanel corrispondente sistema funzionale clinico (peresempio il sistema piramidale). La definizione del-l’intera architettura funzionale delle reti cerebrali(conosciuta con il termine “connettone”) potrebbecontribuire a capire meglio le dinamiche che rego-lano i processi cognitivi e comportamentali di questipazienti. I vari tentativi effettuati nel caratterizzarequesta moltitudine dei dati, hanno portato, nell’ulti-mo decennio, all’emergere di un approccio multidi-sciplinare allo studio dei sistemi complessi che haorigine proprio nello studio delle reti, conosciuta co-me teoria dei grafi. Lo scopo principale del nostroprogetto è stato di applicare la teoria dei grafi peridentificare la disorganizzazione funzionale del con-nettone umano nei pazienti con SM e di stimarne lacorrelazione con variabili cliniche, neuropsicologi-che e radiologiche. Nel dettaglio, abbiamo valuta-to:a) se e come le proprietà globali dei network fun-zionali cerebrali erano alterate nei pazienti con SMrispetto ai controlli sani;b) la presenza di modifiche dei principali nodi fun-zionali (definiti come regioni cerebrali che interagi-scono con numerose altre regioni) in questi pazienti;c) le correlazioni tra le modifiche di connettività fun-zionale e misure cliniche, neuropsicologiche a diRM convenzionale nei pazienti con SM.

La nostra ipotesi di lavoro era che modifiche fun-zionali dei principali network cerebrali, sia a livelloglobale che a livello regionale, possono contribuirea spiegare le manifestazioni cliniche della malattia,soprattutto in termini di compromissione cognitiva,e che la presenza di un danno strutturale possa in-fluenzare tali modifiche di funzione.

RiSULTATiAbbiamo utilizzato l’analisi dei grafi per valutare lemodifiche di organizzazione del connettone funzio-nale cerebrale in 246 pazienti destrimani con SMcon i principali fenotipi clinici di malattia. Tutti i pa-zienti sono stati sottoposti ad una valutazione neu-rologica. Come misura di compromissione cognitivaabbiamo utilizzato il punteggio al Paced AuditorySerial Addition Test (PASAT), un test neuropsicolo-gico che è sensibile ai deficit della memoria di lavoroe della velocità di processazione delle informazioni.Come gruppo di controllo abbiamo reclutato 55soggetti sani, destrimani, con una storia neurologi-ca, psichiatrica e medica negativa e con una nor-male obiettività neurologica. Rispetto ai soggettisani, i pazienti con SM hanno mostrato un’altera-zione delle proprietà globali dei network cerebrali.Tali modifiche erano utili per distinguere i pazienticon compromissione cognitiva rispetto ai controllisani, mentre non differenziavano i pazienti con iprincipali fenotipi clinici di malattia. Rispetto ai con-trolli sani, i pazienti con SM hanno anche mostratodelle modifiche regionali dei network, caratterizzateda: 1) una perdita dei nodi localizzati a livello del gi-ro frontale superiore, precuneo e cingolo anteriorenell’emisfero di sinistra; 2) una diversa lateralizza-zione dei nodi localizzati a livello dei gangli della ba-se (localizzati a livello dell’emisfero di sinistra nei

Definizione della rete di connettività strutturale e funzionalenella sclerosi multipla tramite l’applicazione dell’approccio“graph theory”

COMPENDIO 2015

Massimo FilippiUnità di Neuroimaging Quantitativo, Istituto di Neurologia Sperimentale, Divisionedi Neuroscienze, Istituto Scientifico San Raffaele, Università Vita-Salute San Raffaele, Milano

collaboRatoRI:Maria Assunta Rocca, Laura Parisi, Paolo Preziosa, Elisabetta Pagani,Paola Valsasina, Vittorio Martinelli, Andrea Falini, Giancarlo Comi

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controlli sani e dell’emisfero di destra nei pazienticon SM); e 3) la formazione di nodi, non presenti neicontrolli sani, nel lobo temporale e cervelletto. Que-ste modifiche delle proprietà regionali dei networkcontribuivano a caratterizzare sia i pazienti concompromissione cognitiva, sia i principali fenotipiclinici di malattia. Nei pazienti, non abbiamo trovatocorrelazioni significative tra le modifiche globali eregionali dei network cerebrali e misure di dannostrutturale (carico lesionale sulle sequenze pesatein T2 e atrofia cerebrale).

CoNCLUSioNiApplicando la teoria dei grafi per analizzare imma-gini di RM funzionale a riposo abbiamo dimostratola presenza di un’alterata organizzazione dei net-

work funzionali cerebrali sia a livello globale che alivello regionale nei pazienti con SM. L’alterazionedelle proprietà globali di questi network indica un ri-dotta capacità di scambiare le informazioni tra areecerebrali distanti, con un impatto sulla presenza didisturbi cognitivi in questi pazienti. Le modifiche re-gionali dell’organizzazione dei network contribui-scono a spiegare non solo alla presenza di deficitcognitivi, ma anche la variabilità fenotipica di questipazienti. Quest’analisi regionale ha anche eviden-ziato che la preservazione funzionale di alcuni nodicerebrali a la perdita di altri sono dei meccanismiche aiutano a spiegare le manifestazioni clinichedella malattia. Questi risultati possono essere utiliper lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche neipazienti con SM, soprattutto in ambito riabilitativo.

iNTRoDUCTioN AND AiMSPrevious investigations in multiple sclerosis (MS)have demonstrated that interindividual variability inthe distribution of structural brain damage and effi-ciency of brain plasticity are among the factors re-sponsible for the accumulation of irreversible clinicaldeficits in these patients. However, most of thesestudies were hypothesis-driven and focused on theanalysis of specific brain networks (for instance, themotor network) and their relationship with impair-ment in the corresponding functional systems (for in-stance, the pyramidal system). An important step tounderstand the disruption of intrinsic brain functionaland structural organization in MS is to map the ele-ments and connections of the brain networks, to cre-ate a comprehensive structural and functionaldescription of the network architecture, known as theconnectome. The aim of this project was to apply“graph theory” to identify the functional connectomein patients with MS, with the following objectives:a) to define if and how global network properties aremodified in MS patients vs healthy controls (HCs);b) to assess if and how cortical hubs (defined asbrain regions that interact with many other regions)are modified with the disease;c) to estimate the correlation between functionalconnectivity disruption vs clinical, neuropsycholog-

ical and conventional MRI variables in patients withMS.Our working hypothesis was that the disruption ofbrain network functional connectivity at a globaland regional level is likely to contribute to the clini-cal manifestations of the disease, especially cogni-tive impairment, and that structural damage mightmodulate rewiring of functional connectivity.

RESULTSBy applying graph analysis to resting state (RS)functional magnetic resonance imaging (fMRI) data,we have investigated the organization of the func-tional brain connectome in 246 right-handed MS pa-tients with the main disease clinical phenotypes. Allpatients underwent a complete neurologic examina-tion, with rating of the Expanded Disability StatusScale (EDSS) score. As a measure of cognitive im-pairment, we used the Paced Auditory Serial Addi-tion Test (PASAT), which is sensitive to abnormalitiesof working memory and information processingspeed. Patients were considered cognitively im-paired (CI) when PASAT score was 2SD below theaverage score of a comparable control group forage, gender and education. Fifty-five right-handed,age- and gender-matched HC with no previous his-tory of neurological, psychiatric, or medical disor-

Mapping structural and functional brain networksin multiple sclerosis: a graph theory approach

NEURORIABILITAZIONE E QUALITÀ DELLA VITA

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ders, and a normal neurological exam were also en-rolled. Global network properties (network degree,global efficiency, hierarchy, path length and assor-tativity) were abnormal in MS patients compared toHC, and contributed to distinguish cognitively im-paired MS patients from HC, but not the main MSclinical phenotypes. Compared to HC, MS patientsshowed: 1) a loss of hubs in the superior frontalgyrus, precuneus and anterior cingulum in the lefthemisphere; 2) a different lateralisation of basal gan-glia hubs (mostly located in the left hemisphere inHCs, and in the right hemisphere in MS patients);and 3) a formation of hubs, not seen in HCs, in theleft temporal pole and cerebellar lobule IV-V. Finally,MS patients also experienced a decreased nodaldegree in the bilateral caudate nucleus and rightcerebellum. Such a modification of regional networkproperties was found to contribute to cognitive im-pairment and phenotypic variability of MS. In pa-tients, global and regional network properties werenot correlated with T2 lesion volume and normalizedbrain volume.

CoNCLUSioNSBy using a graph theoretical analysis of RS fMRI,we showed abnormalities of global and regionaltopological brain functional organization in a largecohort of MS patients. Abnormalities of global net-work properties suggested a reduced competencein information exchange between distant brain ar-eas and were related to the presence of cognitiveimpairment. Regional abnormalities of network or-ganization contributed to distinguish MS patientsfrom HCs and also to characterize cognitive per-formance and phenotypic variability of patients.Such a regional analysis also suggested that func-tional preservation of “critical” hubs as well as lossand/or functional incompetence of alternative hubsare among the mechanisms associated to the clin-ical manifestations of the disease.This novel piecesof information are likely to contribute developing fu-ture therapeutic strategies, particularly in the fieldof rehabilitation.

COMPENDIO 2015

PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI

Rocca MA, Valsasina P, Meani A, Falini A, Comi G, Filippi M. Impaired functional integration in multiple sclerosis: a graph theory study. Brain StructFunct. 2014 Sep 26. [Epub ahead of print]

Rocca MA, Valsasina P, Sala S, Meani A, Falini A, Comi G, Filippi M. Abnormalities of the brain connectome in patients with multiple sclerosis. Mult SclerJ 2013; 19 (Suppl 1): 407.Presented at the 29th Congress of ECTRIMS. Copenhagen, 2-5 October 2013

Filippi M, Rocca MA, Valsasina P, Sala S, Meani A, Falini A, Comi G. Abnormalities of the brain connectome in patients with multiple sclerosis. NeurolSci 2013; 34 (Suppl October 2013): S60-S61. Presented at the 44th Congress of Società Italiana di Neurologia. Milano, 2-5 November 2013

Filippi M, Valsasina P, Sala S, Meani A, Falini A, Comi G, Rocca MA. Abnormalities of the brain connectome in patients with multiple sclerosis. J Neurol2013; 260 (Suppl 1): S31-S32. Presented at the 23rd Meeting of the European Neurological Society Conference, Barcelona, Spain 8th to 11th June2013.

Filippi M, Valsasina P, Sala S, Meani A, Falini A, Comi G, Rocca MA. Abnormalities of the brain connectome in patients with multiple sclerosis. Proc IntlSoc Mag Reson Med 2013; 21: 3553. Presented at the 21st Scientific Meeting of the International Society for Margnetic Resonance in Medicine. SaltLake City, 20-26 April 2013

Filippi M, Valsasina P, Sala S, Meani A, Falini A, Comi G, Rocca MA. Abnormalities of the brain connectome in patients with multiple sclerosis. Neurology2013; 80 (Suppl 1): PD6.009 Presented at the 65th Annual Meeting of the American Academy of Neurology. San Diego, 16-23 March 2013

Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2011 per il periodo di 1 anno e l’ammontare di 30.000 €

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PREMESSE E oBiETTiViLa definizione della distribuzione regionale del dannoa livello del sistema nervoso centrale (SNC) contri-buisce a migliorare la comprensione delle manifesta-zioni cliniche dei pazienti affetti da sclerosi multipla(SM). I deficit cognitivi sono presenti nel 25-60% diquesti pazienti, anche in chi è affetto da una disabilitàfisica lieve. Alcuni studi preliminari hanno dimostratouna correlazione tra una riduzione di volume dell’ip-pocampo, struttura del SNC di importanza strategicaper le funzioni di memoria verbale e visuo-spaziale,e la presenza di disturbi della memoria in pazienticon SM. Recenti studi patologici hanno suggeritoche la suscettibilità al danno può essere diversa nellediverse strutture dell’ippocampo e, soprattutto, chela capacità di neurogenesi delle cellule staminali po-trebbe essere preservata in alcune sue porzioni. Loscopo del progetto è stato di fornire una precisa de-scrizione del coinvolgimento dell’ippocampo in cor-so di SM, utilizzando tecniche avanzate di risonanzamagnetica (RM) funzionale e strutturale. Tra queste,abbiamo utilizzato metodi che permettono di stimarele modificazioni di volume e di forma di superficiedell’ippocampo, di valutare l’integrità strutturale deifasci di connessione di questa struttura e di analiz-zare l’organizzazione funzionale dei circuiti ippocam-pali. L’obiettivo principale del progetto è stato quellodi definire il grado di atrofia globale e regionale del-l’ippocampo in pazienti SM nei diversi fenotipi clinicie come tale danno correli con la loro performanceneuropsicologica. Abbiamo inoltre studiato la con-nettività funzionale e strutturale dell’ippocampo conle altre regioni del cervello.L’ipotesi di lavoro era che la connettività funzionalee strutturale tra l’ippocampo e le altre regioni cere-brali rilevanti per la memoria (e più in generale perle funzioni cognitive) vari nelle diverse fasi della ma-

lattia e che ciò possa contribuire alla presenza e allaseverità del deficit di memoria e cognitivo. Il diversocoinvolgimento delle sottostrutture dell’ippocampo,con la presenza in alcune di una maggiore suscet-tibilità al danno secondario alla malattia e in altre diuna preservazione del potenziale di neurogenesi,potrebbe contribuire a spiegare l’eterogeneità dellemanifestazioni cognitive della malattia.

RiSULTATiAbbiamo reclutato 115 pazienti con SM destrimanie 42 volontari sani di pari sesso ed età. I pazientisono stati sottoposti ad una valutazione neurologi-ca e neuropsicologica. Tutti i soggetti hanno ese-guito uno studio di RM, utilizzando un magnete a3.0 Tesla, durante il quale sono state acquisite leseguenti sequenze: 1) pesata in doppio eco, 2)“double inversion recovery”, 3) 3D pesata in T1, 4)diffusione e 5) RM funzionale a riposo. Per valutarel’atrofia ippocampale ed il coinvolgimento dei diver-si settori istologici dell’ippocampo, abbiamo seg-mentato manualmente gli ippocampi sulle immaginipesate in T1, utilizzando degli atlanti anatomici co-me riferimento. Abbiamo trovato che rispetto aisoggetti sani, i pazienti con SM avevano un’atrofia(perdita di tessuto) significativa degli ippocampi.Nei pazienti con SM, abbiamo riscontrato un’atrofiaselettiva a livello della porzione CA1 e del subicolodell’ippocampo posteriore, bilateralmente. Era, inol-tre, coinvolto l’ilo del giro dentato della testa dell’ip-pocampo di destra. Tali modifiche regionali delvolume degli ippocampi erano correlate al volumedelle lesioni della sostanza bianca, ma non alla di-sabilità dei pazienti. Inoltre, la perdita di tessuto alivello del CA1 e del subicolo correlava con i deficita test neuropsicologici mirati per le funzioni ippo-campali.

Mappatura regionale della struttura e delle funzionidell’ippocampo nella sclerosi multipla: correlazioni conle forme cliniche della malattia e con il deficit cognitivo

Massimo FilippiUnità di Neuroimaging Quantitativo, Istituto di Neurologia Sperimentale, Divisione di Neuroscienze,Istituto Scientifico San Raffaele, Università Vita-Salute San Raffaele, Milano

collaboRatoRI:Maria Assunta Rocca, Vittorio Martinelli, Andrea Falini, Giancarlo Comi

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In 69 pazienti con SM senza compromissione co-gnitiva e 42 soggetti sani abbiamo valutato la cor-relazione tra le modifiche di connettività funzionalea riposo (RS FC) dell’ippocampo e il carico lesio-nale sulle sequenze pesate in T2, così come la pre-senza di depressione. Rispetto ai soggetti sani, ipazienti avevano una ridotta RS FC tra gli ippo-campi e diverse regioni cortico-sottocorticali. La ri-dotta RS FC tra gli ippocampi e il “default-modenetwork” (DMN) erano strettamente correlati ad unmaggior volume delle lesioni pesate in T2, alla du-rata di malattia e alla gravità della depressione edella disabilità.

CoNCLUSioNiQuesti risultati evidenziano che le diverse regionidell’ippocampo hanno una differente vulnerabilitàal danno nei pazienti con SM, con un relativo rispar-mio della testa dell’ippocampo di sinistra. La valu-tazione della distribuzione regionale del danno alivello ippocampale può contribuire a spiegare il de-ficit di specifiche funzioni cognitive nei pazienti conSM, tra cui la memoria e le abilità visuospaziali.Nei pazienti con SM senza compromissione cogniti-va, le lesioni della sostanza bianca influenzano l’inte-grazione funzionale dell’ippocampo con altre regionidel DMN, determinando una sindrome da disconnes-sione che contribuisce alla manifestazioni clinichedella malattia, tra cui la presenza di depressione.

COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSThe definition of the regional distribution of struc-tural damage in the different central nervous system(CNS) compartments is contributing to improve theunderstanding of the clinical manifestations of mul-tiple sclerosis (MS), including cognitive dysfunction.Impaired cognition is present in 25-60% of MS pa-tients and can occur even in the setting of a rela-tively mild physical disability.Although information-processing speed and work-ing memory are the most frequently detected cog-nitive deficits, verbal and spatial learning are alsoaffected, possibly reflecting a hippocampal dys-function. Consistently with the crucial role playedby the hippocampus in memory functions, a fewpreliminary studies in MS have found a correlationbetween hippocampal atrophy and memory impair-ment. However, the hippocampus is not a homoge-neous structure, in terms of both morphology andfunction. Recent pathological studies have suggest-ed that susceptibility to damage might differ in thedifferent portions of the hippocampus and, mostimportantly, that the neurogenecity of neuronalstem cells might be preserved in some of them.Aim of this project was to achieve an accurate de-scription of hippocampal involvement in MS acrossthe entire spectrum of the disease, by employing

advanced structural and functional magnetic reso-nance imaging (fMRI) techniques. The main objec-tives of this project were:a) To assess the degree of global hippocampal at-rophy and the differential involvement of hippocam-pal histological subfields in MS patients with themain disease clinical phenotypes;b) To estimate the correlation of neuropsychologicalimpairment with global and regional hippocampalatrophy;c) To study the structural and functional connectivityof the hippocampus with other brain regions to in-vestigate the adaptive/maladaptive role of such ab-normalities.Our working hypothesis was that functional andstructural connectivities between the hippocampusand other brain regions relevant for memory (and,more generally, for cognition) vary across the mainstages of the disease and that such variation mightcontribute to the presence and severity of memo-ry/cognitive impairment. We also postulate that thedifferential involvement of hippocampal histologicalsubfields, with susceptibility to MS-related damagein some of them and preservation of the neurogen-esis potential in others, might contribute to explainthe heterogeneous cognitive manifestations of thedisease.

Regional mapping of hippocampal structure and functionin multiple sclerosis: correlations with disease clinicalphenotypes and cognitive impairment

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RESULTSWe have recruited 115 consecutive right-handed pa-tients with MS and 42 sex- and age matched right-handed healthy individuals. MS patients underwenta neurological examination with rating of the Ex-panded Disability Status Scale (EDSS) and a neu-ropsychological evaluation. Using a 3.0 T scanner,we have acquired dual-echo (DE), double inversionrecovery (DIR), 3D T1-weighted, diffusion tensor (DT)MRI and resting state (RS) functional MRI se-quences. To assess the degree of global hippocam-pal atrophy and the differential involvement ofhippocampal histological subfields, the hippocampiwere manually traced on 3D T1-weighted imagesand then, their anatomical segmentation has beenperformed using a standard neuroanatomical atlasof the hippocampus. We found that hippocampalvolume was reduced in MS patients vs healthy con-trols. In MS patients, radial atrophy affected CA1subfield and subiculum of posterior hippocampus,bilaterally. The dentate hilus of the right hippocam-pal head was also affected. Regional hippocampalatrophy correlated with brain T2 and T1 lesion vol-umes, while no correlation was found with disability.Damage to the CA1 and subiculum was significantlycorrelated to the performances at hippocampal-tar-geted neuropsychological tests.From 69 cognitively intact MS patients and 42

matched healthy controls we have assessed the re-lationship between abnormalities of hippocampalRS functional connectivity (FC) with brain T2 lesionvolumes and presence and severity of depression.Compared to healthy controls, MS patients experi-enced a significant atrophy of the whole brain andleft hippocampus as well as a distributed pattern ofdecreased RS FC between the hippocampi andseveral cortical-subcortical regions. Reduced hip-pocampal RS FC with the default-mode network(DMN) was strongly correlated to higher T2 lesionvolume as well as to disease duration, severity ofdepression and disability.

CoNCLUSioNSThese results show that hippocampal subregionshave a different vulnerability to MS-related damage,with a relative sparing of the head of the left hip-pocampus. The assessment of regional hippocam-pal atrophy may help explain deficits of specificcognitive functions in MS patients, including mem-ory and visuospatial abilities.In cognitively preserved MS patients, brain focalWM lesions influence the functional integration ofthe hippocampus to other brain regions of the DMN,leading to a disconnection syndrome. Such a dis-ruption of hippocampal RS FC contributes to the oc-currence of depression and to clinical disability.



Longoni G, Rocca MA, Pagani E, Riccitelli G, Colombo B, Rodegher M, Falini A, Comi G, Filippi M. Deficits in memory and visuospatial learning correlatewith regional hippocampal atrophy in MS. Brain Struct Funct. 2015 Jan;220(1):435-44.

Rocca MA, Pravatà E, Valsasina P, Radaelli M, Colombo B, Vacchi L, Gobbi C, Comi G, Falini A, Filippi M. Hippocampal-dmn disconnectivity in MS isrelated to WM lesions and contributes to depression. Submitted

Longoni G, Rocca MA, Pagani E, Riccitelli GC, Colombo B, Rodegher M, Falini A, Comi G, Filippi M. Surface expansion of the hippocampal dentategyrus in multiple sclerosis: an in-vivo evidence of neurogenesis? Neurology 2013; 80 (Suppl 1): P06.127

Longoni G, Rocca MA, Pagani E, Riccitelli G, Colombo B, Rodegher M, Falini A, Comi G, Filippi M. Surface expansion of the hippocampal dentate gyrusin multiple sclerosis: in vivo evidence of neurogenesis? J Neurol 2013; 260 (Suppl 1): S227

Riccitelli GC, Rocca MA, Longoni G, Pagani E, Colombo B, Rodegher M, Falini A, Comi G, Filippi M. Surface expansion of the hippocampal dentategyrus in multiple sclerosis: in vivo evidence of neurogenesis? Mult Scler J 2013; 19 (Suppl 1): 416-417. Presented at the 29th Congress of ECTRIMS.Copenhagen, 2-5 October 2013

Ricciteli G, Rocca MA, Longoni G, Pagani E, Colombo B, Rodegher M, Falini A, Comi G, Filippi M. Surface expansion of the hippocampal dentate gyrusin multiple sclerosis: an in vivo evidence of neurogenesis? Neurol Sci 2013; 34 (Suppl October 2013): S159. Presented at the 44th Congress of SocietàItaliana di Neurologia. Milano, 2-5 November 2013

Messina R, Rocca MA, Longoni G, Pagani E, Colombo B, Rodegher M, Comi G, Falini A, Filippi M. Surface Expansion of the Hippocampal DentateGyrus in Multiple Sclerosis: an In-Vivo Evidence of Neurogenesis? Oral presentation ASNR 52nd Annual Meeting & Symposium. Montreal 19-22 May2014


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PREMESSE E oBiETTiViLa plasticità strutturale cerebrale ha un ruolo nel-l’induzione di fenomeni di plasticità funzionale ai finidi un adattamento a stimoli esterni e condizioni pa-tologiche. In soggetti sani l’apprendimento cogniti-vo e motorio induce significative modificazioni dellasostanza bianca.I pazienti con sclerosi multipla (SM) presentano de-ficit cognitivi e motori, che sembrano essere seguitida riorganizzazione corticale. Quindi si potrebberodefinire protocolli riabilitativi per ottenere un adat-tamento cerebrale efficiente alla fase della malattiaper preservare le funzionalità del paziente. Tuttaviamancano dati riproducibili sull’efficacia di protocolliriabilitativi e sul loro effetto su circuiti nervosi cere-brali. Infatti, sebbene un protocollo riabilitativo ridu-ca la disabilità, i risultati variano da paziente apaziente. Parte di tali variazioni potrebbe riferirsi adifferenze nell’anatomia residua cerebrale in diversefasi della malattia. Valutazioni quantitative in vivodella microstruttura della sostanza bianca, correlatea compiti motori e cognitivi, potrebbero predire lerisposte ad uno specifico trattamento allo scopo dipersonalizzare interventi riabilitativi e ottimizzare ilrisultato finale.Il progetto ha esaminato quanto misure di connet-tività strutturale (circuiti di sostanza bianca) possa-no fornire indicazioni sugli effetti di protocolliriabilitativi sulla performance di pazienti con SM. Indettaglio, sono stati studiati: a) gli effetti della riabi-

litazione dell’arto superiore sulla funzione motoriadella mano; b) gli effetti della riabilitazione cognitivasull’attenzione sostenuta, la memoria di lavoro e lavelocità di elaborazione dell’informazione; c) l’im-patto della riabilitazione motoria sull’architetturastrutturale del cervello con tecniche non convenzio-nali di risonanza magnetica (RM); d) la correlazionetra prestazioni motorie e cognitive e parametri diRM per ricercare indicatori utili a predire la rispostadei pazienti ad uno specifico trattamento; e) la cor-relazione di scale cliniche e gli effetti della riabilita-zione sugli aspetti motori e cognitivi.Riabilitazione motoria

Nel primo anno sono stati reclutati 30 pazienti conSM e deficit motorio alla mano, randomizzati in 2gruppi che hanno ricevuto un protocollo riabilitativoattivo o passivo. Entrambi i gruppi sono stati sotto-posti a 20 sessioni di trattamento di 1 ora, tre voltealla settimana. Il “gruppo trattato” ha ricevuto unariabilitazione motoria attiva, basata su esercizi vo-lontari, tra cui esercizi “task-oriented”, mentre il“gruppo di controllo” è stato sottoposto ad una mo-bilizzazione passiva di spalla, gomito, polso e dita.Prima e dopo i protocolli di riabilitazione, la presta-zione motoria è stata valutata in tutti i pazienti contest standard. Inoltre, i movimenti di precisione delledita sono stati valutati grazie ad un guanto ingegne-rizzato in grado di valutare la cinematica di sequen-ze di movimenti di opposizione delle dita ed indicidi coordinazione bimanuale.

l’impatto della riabilitazione motoria e cognitiva sulle proprietàdinamiche della struttura cerebrale: verso la personalizzazionedi interventi terapeutici in pazienti affetti da sclerosi multipla

COMPENDIO 2015

Marco BoveDIMES, Università degli Studi di Genova, Genova

collaboRatoRI:Ludovico Pedullà

collaboRazIoNI coN altRI GRUppI:Laura Bonzano, Gianluigi Mancardi, DINoGMI, Università degli Studi di Genova,GenovaLuca Roccatagliata, DISSal, Università degli Studi di Genova, GenovaGiampaolo Brichetto, Andrea Tacchino, area Ricerca Scientifica, FISM, GenovaLaura Lopes De Carvalho, Servizio Riabilitazione aISM, Genova

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Nelle stesse sedute, al fine di valutare l’integrità del-la sostanza bianca cerebrale, ogni paziente è statosottoposto ad una valutazione RM con tensore didiffusione per ottenere mappe parametriche di ani-sotropia frazionale, diffusività media, diffusività as-siale, e diffusività radiale. Il valore medio di ogniparametro è stato calcolato separatamente all’in-terno delle regioni di interesse tra i fasci di fibre checollegano aree cerebrali coinvolte nel controllo delmovimento volontario.Riabilitazione cognitiva

Nel secondo anno del progetto, sono state reclutate24 persone con SM con disturbi cognitivi, i quali so-no stati sottoposti ad un intervento di riabilitazionecognitiva per 8 settimane con una nuova applicazio-ne software sviluppata ad hoc per offrire trattamentiintensivi e personalizzati a casa (COGNI-TRAcK). Lepersone sono stati divise in due gruppi: un grupposeguiva un programma adattivo, in cui il livello di dif-ficoltà degli esercizi si modulava in base alla perfor-mance del paziente, mentre l’altro gruppo seguivaun programma che manteneva la difficoltà degliesercizi costante ad un basso livello.Inoltre, prima e dopo l’intervento riabilitativo, en-trambi i gruppi sono stati sottoposti a una valuta-zione cognitiva tramite la Rao’s Brief RepeatableBattery (BRB).

RiSULTATiI due protocolli riabilitativi motori hanno indotto effettipositivi e simili sulla performance motoria unimanua-le, tuttavia il compito di coordinazione bimanuale harivelato che le capacità di coordinazione residue so-no state mantenute nei pazienti trattati mentre eranosignificativamente peggiorate nel gruppo di control-lo. Inoltre, l’integrità della sostanza bianca nel corpocalloso e nei tratti corticospinali nel “gruppo tratta-to” era conservata mentre un peggioramento del-l’integrità microstrutturale dovuto alla malattia èstato trovato nel gruppo di controllo. Infine, un au-mento significativo di diffusività radiale è stato os-servato nei fascicoli longitudinali superiori di

entrambi i gruppi, indicando l’assenza di effetto deltrattamento su questa struttura, che mostra la pro-gressione di un danno probabilmente dovuto ad unprocesso di demielinizzazione in atto durante la ma-lattia.Per quanto riguarda il protocollo di riabilitazione co-gnitiva, i risultati ottenuti indicano che il sistema pro-posto è stato ben recepito dalle persone con SM,come evidenziato dall’alta aderenza al trattamento(media dell’84% di sessioni completate sul totalepianificato). L’efficacia di COGNI-TRAcK nel conte-sto di un programma di riabilitazione cognitiva in-tensiva e personalizzata è stata valutata con unabatteria di test neuropsicologici (BRB) solitamenteutilizzata per indagare la performance cognitiva. Nelgruppo che seguiva un programma adattivo, i risul-tati hanno mostrato un effetto positivo e statistica-mente significativo dell’intervento sulla performancecognitiva in tutti i test, evidenziando come COGNI-TRAcK sia uno strumento adatto ed efficace per lariabilitazione cognitiva nella SM.

CoNCLUSioNiQuesti risultati indicano l’importanza della sommini-strazione, quando possibile, di un trattamento riabi-litativo costituito da movimenti volontari. Inoltre,abbiamo dimostrato che gli effetti benefici di un trat-tamento riabilitativo sono dipendenti dal compitomotorio che viene svolto durante la riabilitazione eselettivi nel loro effetto a livello della struttura cere-brale; e questo diventa fondamentale se si voglionosviluppare degli approcci riabilitativi personalizzati.Inoltre, abbiamo dimostrato come un training co-gnitivo adattivo sia più efficace rispetto ad uno nonadattivo in persone con SM con deficit cognitivi.Una riabilitazione cognitiva intensiva e personaliz-zata basata su esercizi di memoria di lavoro sembramigliorare lo stato cognitivo in questi pazienti. Infineabbiamo dimostrato che il trattamento intensivo epersonalizzato proposto attraverso COGNI-TRAcKè ben accettato, facilmente utilizzabile ed efficacenel migliorare le funzioni cognitive.


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COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSIn adult brains structural neuroplasticity plays a cru-cial role relative to functional plasticity in adaptationto external stimuli and pathological conditions. Inhealthy subjects, white matter (WM) changes canbe observed after motor and cognitive training.Motor and cognitive impairments are present in pa-tients with multiple sclerosis (PwMS), and it hasbeen suggested that motor and cognitive distur-bances are followed by cortical reorganization inthese patients. Thus, rehabilitation protocols couldbe designed to obtain efficient brain adaptation topreserve patients’ outcome. However, consistentdata on the real efficacy of rehabilitative proceduresare lacking, in particular concerning the rehabilita-tion effect on brain networks. In fact, although, im-pairment can be reduced through rehabilitativeinterventions, individual patients’ outcomes arehighly variable. Part of this variation is likely due tovariation in residual brain anatomy. Imaging meas-ures of WM microstructure in combination with mo-tor and cognitive tasks could predict responses toan intervention allowing for individual tailoring oftherapeutic interventions to optimize outcomes.This project aimed at assessing whether imagingmeasures of structural brain connectivity (WM path-ways) could give new hints on the effects of motorand cognitive rehabilitative protocols in PwMS’ per-formance. Particularly, we investigated a) the effectsof upper limb rehabilitation, focused on hand motorfunction; b) the effects of cognitive rehabilitation onsustained attention, working memory and speed ofinformation processing; c) the impact of motor re-habilitation on structural brain architecture usingnon-conventional MRI techniques; d) the correlationbetween motor performance and non-conventionalMRI data in order to identify possible indicators ableto predict the response of the patients to a specificrehabilitative treatment; e) the correlation of clinicalscales with motor and cognitive outcomes.Motor rehabilitation

In the first year of the project, 30 PwMS with handmotor deficits were recruited and randomized into2 homogenous groups to receive active or passivemotor rehabilitation treatment. Both groups under-went twenty 1-hour treatment sessions, three times

a week. The “treatment group” received an activemotor rehabilitation treatment, based on voluntaryexercises including task-oriented exercises, whilethe “control group” underwent passive mobilizationof the shoulder, elbow, wrist and fingers. Before andafter the rehabilitation protocols, motor perform-ance was evaluated in all patients with standardtests. Additionally, finger motor performance accu-racy and bimanual coordination were assessed byan engineered glove.In the same sessions, in order to evaluated whitematter integrity, every patient underwent diffusiontensor imaging to obtain parametric maps of frac-tional anisotropy, mean diffusivity, axial diffusivity,and radial diffusivity. The mean value of each pa-rameter was separately calculated within regions ofinterest including the fiber bundles connecting brainareas involved in the control of voluntary move-ments.Cognitive rehabilitation

In the second year of the project, 24 cognitive im-paired PwMS were recruited and submitted to a 8-week home-based training program delivered bymeans of an ad hoc developed innovative applica-tion software in order to offer personalized at-homeintensive cognitive rehabilitation (COGNI-TRAcK).PwMS were randomized into 2 homogeneousgroups of 12 patients each: the “study group” un-derwent an adaptive working memory training givenby the automatic adjustment of the tasks difficultyto the subjects’ performance; the “control group”was trained with the same working memory exer-cises, but at a constant difficulty level. Before andafter the intervention PwMS’ cognitive status wasassessed using the Rao’s Brief Repeatable Battery(BRB).

RESULTSThe two motor rehabilitation protocols induced sim-ilar effects on unimanual motor performance, but thebimanual coordination task revealed that the resid-ual coordination abilities were maintained in thetreated patients while they significantly worsened inthe control group. Further, in the treatment groupwhite matter integrity in the corpus callosum andcorticospinal tracts was preserved while a mi-

the impact of motor and cognitive rehabilitation on the dynamicproperties of brain structure: towards the individual tailoringof therapeutic interventions in multiple sclerosis patients

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crostructural integrity worsening was found in thecontrol group. Conversely, a significant increase ofradial diffusivity was observed in the superior longi-tudinal fasciculi in both groups, indicating lack oftreatment effects on this structure, showing damageprogression likely due to a demyelination process.Concerning cognitive rehabilitation, our findingssuggest that the proposed new system was verywell accepted by PwMS as deduced by the highadherence to the treatment (average adherence of84%). The effectiveness of COGNI-TRAcK in anadaptive and intensive cognitive rehabilitation inter-vention was evaluated with a standard neuropsy-chological tests battery (BRB). In the “study group”,results showed a significant positive effect of the in-tervention on the performances in all tests, high-lighting that COGNI-TRAcK is a tool suitable anduseful for cognitive rehabilitation in MS.

CoNCLUSioNSAll these findings indicate the importance of admin-istering, when possible, a rehabilitation treatmentconsisting of voluntary movements. We also demon-strated that the beneficial effects of a rehabilitationtreatment are task-dependent and selective in theirtarget; this becomes crucial towards the implemen-tation of tailored rehabilitative approaches.Further, we also demonstrated that an adaptivecognitive training is more effective than a non-adap-tive training in cognitive impaired PwMS. Intensiveand personalized cognitive rehabilitation based onworking memory exercises seems to improve cog-nitive status in these patients. Finally, we demon-strated that the intensive personalized trainingprogram administered by COGNI-TRAcK is well ac-cepted by patients, high usable and effective in im-proving cognitive status in PwMS.



Bonzano L, Tacchino A, Brichetto G, Roccatagliata L, Dessypris A, Feraco P, Lopes De Carvalho ML, Battaglia MA, Mancardi GL and Bove M. Upperlimb motor rehabilitation impacts white matter microstructure in multiple sclerosis. Neuroimage 2014;15;90:107-16

Tacchino A, Pedullà L, Bonzano L, Vassallo C, Battaglia MA, Mancardi GL, Bove M, Brichetto G. A new App for at-home cognitive training: descriptionand pilot study on people with multiple sclerosis. Original paper submitted to Journal of Medical Internet Research

Bonzano L,. Tacchino A,. Brichetto G, Roccatagliata L, Feraco P, Mancardi GL and Bove M. Motor rehabilitation impacts white matter microstructure inpatients with Multiple Sclerosis, HBM Seattle, USA, 2013

Bonzano L, Tacchino A, Brichetto G, Roccatagliata L, Feraco P, Mancardi GL, Battaglia MA and Bove M. Motor rehabilitation impacts white matter mi-crostructure of corpus callosum in patients with Multiple Sclerosis, ECTRIMS, Copenaghen, Denmark, 2013 (premiato come Best Poster presentation).

Bonzano L, Bove M, Tacchino A, Brichetto G, Roccatagliata L, Feraco P, Battaglia MA and Mancardi GL. Effects of motor rehabilitation on corpuscallosum microstructural integrity in Multiple Sclerosis XLIV Congresso Nazionale SIN, Milano, 2013

Pedullà L, Tacchino A, Vassallo C, Bonzano L, Battaglia MA, Bove M, Brichetto G. Riabilitazione cognitiva nella sclerosi multipla: un trattamento person-alizzato intensivo a domicilio tramite un’Applicazione per tablet non commerciale. SIRN, Genova, 2014

Pedullà L, Tacchino A, Vassallo C, Bonzano L, Battaglia MA, Bove M, Brichetto G. Home-based personalized cognitive training with a customized tabletapplication in people with multiple sclerosis. RIMS 2014, Brighton, United Kingdom

Pedullà L, Tacchino A, Vassallo C, Bonzano L, Battaglia MA, Bove M, Brichetto G. A new tool for personalized at-home intensive cognitive rehabilitation.GNB, Pavia, 2014

Tacchino A, Pedullà L, Vassallo C, Bonzano L, Battaglia MA, Bove M, Brichetto G. Riabilitazione cognitiva nella Sclerosi Multipla - Un trattamento per-sonalizzato intensivo a domicilio tramite un’applicazione per tablet non commerciale. SIMFER 2014, Torino

Tacchino A, Pedullà L, Vassallo C, Bonzano L, Battaglia MA, Bove M, Brichetto G. Adaptive vs non-adaptive cognitive rehabilitation training based onworking memory: effects on people with multiple sclerosis. RIMS, Milano, 2015

Bonzano L, Tacchino A, Brichetto G,. Roccatagliata L, Feraco P,. Mancardi GL, Battaglia MA and Bove M. Brain reorganization following upper limbmotor rehabilitation in patients with multiple sclerosis. RIMS, Milano, 2015

Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2011 per il periodo di 2 anni e l’ammontare di 146.000 €

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PREMESSE E oBiETTiViNei soggetti affetti da sindrome del motoneuronesuperiore (UMN), uno dei segni clinici è la spasticitàche può essere definita come una forma di ipertonodovuta ad un aumento velocità dipendente nei ri-flessi tonici da stiramento (Sheean, 2002). È ben no-to come l’ipertono spastico sia dovuto sia ad unacomponente riflessa (Sheean, 2002) che alle com-ponenti intrinseche del muscolo (Gracies, 2005).Recenti studi suggeriscono che il trattamento cononde d’urto radiali (Radial Shock Wave Therapy,RSWT), già utilizzato in numerose patologie a caricodell’apparato muscolo scheletrico, possa ridurrel’ipertono in soggetti affetti da esiti di paralisi cere-brale infantile (PC) e stroke (Vidal, 2011; Gonkova,Kim, 2013).L’ipertono muscolare colpisce circa l’80% di sog-getti affetti da sclerosi multipla (SM) (Crayton, 2004;Rizzo, 2004) ed è spesso associato a dolore (Truini,2013).Il dolore potrebbe essere dovuto sia alle pro-lungate contrazioni muscolari causate dall’ipertono,che alle conseguenze sulle articolazioni e sui tessutimolli (Sheean, 2002). Inoltre, il dolore stesso è cau-sa di ipertono e questo porta all’instaurarsi di un cir-colo vizioso tra dolore, ipertono e disabilità (Ward eKadies, 2002).Per valutare gli effetti a lungo termine della RSWTsu dolore e ipertono, in questo studio randomizzatoin doppio cieco controllato con gruppo placebo, laRSWT è stata usata per trattare l’ipertono dolorosodei muscoli plantiflessori della caviglia in una coortedi soggetti affetti da SM.

RiSULTATiDei 68 soggetti con SM che rispondevano ai criterid’inclusione, 34 hanno ricevuto il trattamento conRSWT e 34 il trattamento placebo. I partecipanti

sono stati valutati al livello basale (T0), 1 settimanadopo la prima sessione (T1), 1 settimana (T2) e 4settimane (T3) dopo l’ultimo trattamento. Sono stativalutati la percezione soggettiva del dolore tramitela Visual Analogic Scale (VAS), e l’ipertono con laModified Ashworth Scale (MAS) ed è stata studiatal’eccitabilità spinale mediante lo studio del riflessoH. Il trattamento con RSWT è consistito in 4 ses-sioni a cadenza settimanale, per un totale di circa2000 shots, ad una frequenza di 4 Hz e una pres-sione di 1,5 Bar. Nel trattamento placebo un cusci-netto in schiuma è stato posto davanti alla puntadell’applicatore. A T1 è stata riscontrata una ridu-zione del dolore alla scala VAS (p<0,0001), a T2 unariduzione sia alla VAS (p<0,0001) che alla MAS(p<0,0001), mentre a T3 si è evidenziato il mante-nimento dell’effetto solo alla VAS (p=0,0004). La va-lutazione elettrofisiologica è stata eseguita a T0 eT2 nel solo gruppo trattato con RSWT, ma l’eccita-bilità spinale è risultata sostanzialmente invariata(p>0,05). Il risultato principale di questo studio èche 4 sedute di RSWT hanno prodotto una riduzio-ne del dolore nei soggetti sottoposti a trattamento.Nel momento del massimo effetto sul dolore (T2),è stata osservata una riduzione consensuale del-l’ipertono, nonostante non si siano osservati cam-biamenti nella stenia né nei test funzionali (10

meters walking test). Non si è evidenziato nessuncambiamento nel gruppo sottoposto a trattamentoplacebo. Sebbene i risultati sul dolore siano in lineacon la letteratura, l’effetto sull’ipertono ha avuto du-rata inferiore. È possibile che la discrepanza con glistudi effettuati su soggetti affetti da PC sia correlataall’età dei soggetti; inoltre, la spasticità nelle per-sone SM è spesso dovuta a lesioni spinali, mentrenello stroke e nella PC è dovuta a lesioni cerebralied è noto che i meccanismi fisiopatologici sono

Effetto delle onde d’urto sull’ipertono spastico in pazientiaffetti da sclerosi multipla

COMPENDIO 2015

Carlo TrompettoDipartimento di Neuroscienze, Riabilitazione oftalmologia, Genetica e Scienze Materno-Infantile(DINoGMI), Università di Genova, Genova

collaboRatoRI:Lucio Marinelli, Laura Mori

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parzialmente diversi (Sheean, 2002; Ward and Ka-dies, 2002). Un’altra spiegazione potrebbe esserel’effetto della RSWT sulla fibrosi e le altre compo-nenti non riflesse dell’ipertono (Gonkova, 2013),che, modificando l’eccitabilità dei fusi neuromusco-lari, potrebbero portare ad una secondaria riduzio-ne della spasticità.

CoNCLUSioNiIn seguito al trattamento con RSWT non sono statiosservati effetti collaterali in nessuno dei soggettitrattati. In particolare, la RSWT non ha prodotto de-bolezza nei muscoli trattati, confermando così i ri-sultati ottenuti in precedenti studi. La debolezzamuscolare è il principale effetto collaterale nel trat-

tamento farmacologico dell’ipertono, che spesso vaa limitare o compromettere i benefici clinici (Gra-cies, 1997).Il fatto che la RSWT possa ridurre il dolore e il tonomuscolare in persone con SM, senza alcun effettosulla forza muscolare, conferma l’idea che questotrattamento agisca sulle componenti non riflessedell’ipertono. Con questo studio è stato possibileevidenziare quante sessioni di trattamento siano ne-cessarie e quanto durino gli effetti. Durante il tratta-mento i pazienti non hanno eseguito trattamentofisioterapico, in modo da riferire i cambiamenti nellemisure di outcome alla sola RSWT. Per ottimizzare irisultati funzionali ottenuti, la RSWT dovrebbe essereintegrata in un programma riabilitativo completo.

iNTRoDUCTioN AND AiMSIn subjects with upper motor neuron syndrome(UMN), one of the clinical signs is spasticity, whichcan be defined as a form of hypertonia due to a ve-locity-dependent increase in tonic stretch reflexesresulting from abnormal spinal processing of pro-prioceptive inputs (Sheean, 2002). In addition tospasticity, however, it is well known that subjectswith UMN syndrome are also suffering from a non-reflex hypertonia, due to connective tissue changes(Gracies, 2005).Radial shock wave therapy (RSWT) has been exten-sively used in rehabilitative medicine to treat mus-culoskeletal disorders, and more recently musclehypertonia, in patients with cerebral palsy (PC) andstroke (Vidal, 2011; Gonkova, Kim, 2013). Musclehypertonia affects up to 80% of subjects with mul-tiple sclerosis (MS) (Crayton, 2004; Rizzo, 2004) andis often painful (Truini, 2013). Pain probably reflectsthe prolonged abnormal contractions due to spas-ticity, but it also depends on the musculoskeletalconsequences due to spasticity and the other com-ponents of the UMN syndrome (Sheean, 2002). Therelationship between spasticity and pain is madeeven more strict by the fact that pain increasesspasticity, creating a spiralling course of more painand disability (Ward and Kadies, 2002).To assess the long-term effects of RSWT on pain

and hypertonia, in this randomised, double blind,placebo-controlled study RSWT has been used totreat the painful hypertonia of ankle extensor mus-cles in a cohort of subjects affected by MS.

RESULTSOn a total 68 subjects affected by MS who met theinclusion criteria, 34 subjects received RSWT and 34subjects received placebo treatment. Participantswere assessed at baseline (T0), 1 week after the firstsession (T1), 1 week (T2) and 4 weeks (T3) after thelast session. We measured pain using the visual ana-logue scale for pain (VAS), muscle tone using Mod-ified Ashworth Scale (MAS) and we evaluated spinalexcitability using the H-reflex. RSWT consisted of acourse of 4 sessions with a 1week interval, with anamount of 2000 shots at a 4 Hz frequency and 1.5Bars. In the placebo sessions we placed a thin foamcushion on the metal applicator. At T1 we assesseda reduction in VAS score (p<0,0001), at T2 a reduc-tion both in VAS score (p<0,0001) and in MAS score(p<0,0001), while at T3 the effect lasted just in VASscore (p=0,0004). The electrophysiological evalua-tion was performed at T0 and T2 only in the RSWTgroup, but spinal excitability resulted unaffected(p>0,05). The main finding of this study, was that acourse of 4 sessions of RSWT produced a pain re-duction. At the time of the maximal effect on pain

Effect of radial shock wave therapy on muscle hypertoniain patients with multiple sclerosis


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(T2), a reduction of muscle tone was observed, whileno significant changes were observed in strength orin functional test (10 meters walking test). Nochanges were assessed in the placebo group.Though our results on pain were in line with the lit-erature, our findings on muscle tone lasted for ashorter time. We suggest that the discrepancy be-tween our results and those reported in the studiesperformed in PC patients is probably related to thepatients’ age; moreover, spasticity in MS patients isoften due to spinal lesions, while in stroke and PCpatients is due to cerebral lesions and it is knownthat pathophysiological mechanisms are partiallydifferent (Sheean, 2002; Ward and Kadies, 2002).Another mechanism could be the effect of RSWTon muscle fibrosis and other non-reflex compo-nents of muscle hypertonia (Gonkova, 2013) whichcould modify muscle spindles excitability, leadingto a secondary reduction of spasticity.

CoNCLUSioNSAfter RSWT no adverse effects were observed inany patient. In particular, RSWT did not induceweakness in the treated hypertonic muscles, con-firming previous results. Weakness is a major sideeffect in the pharmacological treatment of musclehypertonia, which often limits or even overwhelmsthe clinical benefit (Gracies, 1997).The fact that RSWT can reduce the pain and themuscle tone in MS patients, without any effect onmuscle strength, supports the idea that RSWT islikely to act on non-reflex hypertonia. We know howmany sessions are needed and how long the resultslast. During the study, patients have not been treat-ed with physiotherapy, in order to refer any changesin outcome measures to RSWT itself. To optimisethe effect in MS patients and obtain functional re-sults, RSWT should be integrated in a rehabilitationprogram.

COMPENDIO 2015


Marinelli L, Mori L, Solaro C, Uccelli A, Pelosin E, Currà A, Molfetta L, Abbruzzese G, Trompetto C. Effect of radial shock wave therapy on pain andmuscle hypertonia: a double-blind study in patients with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Journal 25 sept 2014, pages 1-8

Oral presentation at: XIV Congresso Nazionale SIRN, Genova 8-10 maggio 2014. and 42° Congresso Nazionale SIMFER, Torino 28 settembre-1 ottobre2014

Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2011 per il periodo di 2 anni per l’ammontare di 41.273 €

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PREMESSE E oBiETTiViLa disfagia è considerata una complicazione dellasclerosi multipla (SM) molto severa ed invalidante.La sua prevalenza può essere stimata intorno al 30-40%. Inoltre la polmonite da aspirazione (polmoniteab ingestiis) associata a disfagia è una delle primecause di morte nei pazienti con SM.Ad oggi non esiste alcun trattamento farmacologicoper la disfagia nelle persone con SM. Negli scorsianni, la stimolazione transcranica a corrente diretta(tDCS) ha dimostrato di essere utile nel modularel’eccitabilità corticale per periodi superiori alla duratadi applicazione dello stimolo (Jeffery et al., 2007; Nit-sche MA e Paulus w 2001). Recentemente è statodimostrato che la tDCS con corrente anodica conintensità di 1.5 mA per 10 min o di 1 mA per 20 min,applicata alle aree corticali implicate nella degluti-zione, è stata in grado di indurre un incrementodell’eccitabilità delle aree corticali della deglutizione,rispetto alla stimolazione fittizia (“sham”) in soggettisani (Jefferson et al., 2009). Tale incremento sembracorrelare con un miglioramento delle funzioni deglu-titorie. Questi risultati sono stati confermati in pa-zienti con disfagia da stroke, in cui la tDCS anodicaè stata applicata all’area corticale deglutitoria del-l’emisfero non affetto (Kumar et al., 2011). In questostudio, abbiamo valutato 18 pazienti con disfagiaassociata a SM, allo scopo di valutare l’effetto dellatDCS anodica con intensità di 2mA per 20 minutisulle funzioni deglutitorie studiante mediante video-fluroscopia, elettromiografia e scale di valutazionecliniche quali la Penetration/Aspiration Scale (PAS)

e la scala di severità della disfagia a 5 punti, e dicomparalo con l’effetto indotto da stimolazione elet-trica del faringe (PES), oltre che con stimolazionesham.

RiSULTATiDopo tDCS “real” (6 pazienti) così come dopo PES(6 pazienti) si è osservato un significativo migliora-mento (p < 0.05) di tutti i parametri di outcome, ri-spetto alla stimolazione sham (6 pazienti). L’effettoera più evidente al quinto giorno (T1), subito dopola fine dell’ultima sessione di stimolazione elettrica,ed a 2 settimane (T2) dopo la fine, ma mantenevaancora la sua significatività anche a 4 settimane (T3).

CoNCLUSioNiI risultati di questo studio suggeriscono che la tDCSanodica applicata sull’area corticale della deglutizio-ne è potenzialmente in grado di migliorare le funzionideglutitorie in pazienti con disfagia associata a SM,con un effetto simile a quello indotto da stimolazioneelettrica del faringe. Tuttavia la tDCS è sicuramentemeglio tollerata della stimolazione elettrica del farin-ge e più facile da applicare. Considerando il vastoimpatto della disfagia sulla progressione e sulla se-verità della malattia e considerando anche l’assolutacarenza di terapie farmacologiche, questo tratta-mento terapeutico e riabilitativo, in associazione conaltri trattamenti riabilitativi e fisici già utilizzati potreb-be rappresentare un utile approccio per trattare unsintomo così grave e disabilitante quale la disfagiaassociata a SM.

Valutazione dell’efficacia della stimolazione transcranicaa corrente diretta nella disfagia associata a sclerosi multipla

Domenico Antonio RestivoUnità operativa di Neurologia, p.o. “Nuovo Garibaldi”, catania

collaboRatoRI:Antonino Pavone, Davide Maimone, Maurilio Russo

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COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSDysphagia, is considered a very severe and life-threatening complication of MS. Its prevalence inMS can be attested around 30-40%. Furthermore,the aspiration pneumoniae due to dysphagia is theleading cause of death in MS patients. No specificpharmacological treatment has been reported fordysphagia in MS patients, up to now. Recently,transcranial direct current stimulation (tDCS) hasshown to be able to modulate brain excitability forperiods overlasting the duration of the stimulus ap-plication (Jeffery et al., 2007; Nitsche MA e Paulusw 2001). Recently, it has been demonstrated that ascompared with sham, anodal tDCS both 1.5 mA for10 min or 1 mA for 20 min, over cortical swallowingareas, increased swallowing motor cortex excitabil-ity in healthy subjects (Jefferson et al., 2009). Morerecently, the increase in cortical excitability was alsoobserved in patients with stroke-related dysphagia,by applying anodal tDCS over the unaffected hemi-sphere (Kumar et al., 2011). The increase in swal-lowing motor cortex excitability was correlated to aclinical improvement in swallowing ability (Kumar etal., 2011).The aim of this study was to assess in 18 dysphag-ic MS patients, the efficacy and effects of 2mA, 20min anodal tDCS on swallowing functions, meas-ured by videofluoroscopic, electromyographic, and

clinical evaluations represented by the Penetra-tion/Aspiration Scale (PAS) and by the 5-point dys-phagia severity scale, as compared to both 5 Hzpharyngeal electrical stimulation (PES) and sham.

RESULTSA significant (p < 0.05) improvement was observedafter “real” tDCS (6 patients) and PES (6 patients)as compared to “sham” group (6 patients) in all theoutcome measures. The effect was stronger at day5 (T1), immediately after the last session of electricalstimulation, at two (T2) weeks, but still persisted at4 weeks (T3)

CoNCLUSioNSThe results of this suggest that anodal tDCS overthe swallowing motor cortex is potentially capableof improving swallowing functions in dysphagic MSpateints. The beneficial effect of tDCS was similarto the effect produced by PES. However, tDCS isbetter tolerated and easier to perform than PES.Considering the large impact of dysphagia on thedisease progression and severity, and consideringalso the complete lack of pharmacological treat-ment, this technique, in association with physical/re-habilitation, may represent an useful approach totreat this very disabling and troublesome symptom.

transcranial direct current stimulation (tdcs) for dysphagiaassociated to multiple sclerosis


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PREMESSE E oBiETTiViIl presente progetto si propone di valutare e moni-torare la progressione del deficit cognitivo facendouso della Rao’s Brief Repeatable Battery, che è digran lunga lo strumento più utilizzato per stimare ladisfunzione cognitiva nei pazienti SM. La batteria èstata somministrata a pazienti colpiti da SM chefanno capo al CReSM (Centro Regionale di Riferi-mento per la Sclerosi Multipla) dell’AOU San LuigiGonzaga di Orbassano, Torino. 303 persone sonostate reclutate, e ricavate le seguenti variabili de-mografiche: età, sesso, durata della malattia, det-tagli sulla malattia.Al fine di neutralizzare eventuali effetti di apprendi-mento, la stessa batteria neuropsicologica è statasomministrata ad un gruppo di controllo di personesane provenienti dalla stessa area. Il confronto conil gruppo di controllo è stato effettuato considerandole distribuzioni di sesso, età e livello di istruzione.I risultati dei pazienti sono stati confrontati conquelli del gruppo di controllo, che ha fornito la pro-porzione di effetto di apprendimento da considerareal fine di avere un quadro pulito del reale declino.Le due coorti sono state seguite per tre anni e il testè stato somministrato annualmente. La disabilità fi-sica dei pazienti è stata valutata utilizzando la scalaEDSS di Kurtzke.Dai dati raccolti è stato possibile ottenere: prevalen-za delle disfunzioni cognitive in una generica popo-lazione SM, percentuale della reale progressionecognitiva per anno, eventuale correlazione tra le fun-zioni cognitive e EDSS, depressione, fatica e ansia.

RiSULTATiCome previsto, da un punto di vista clinico, il grup-po di pazienti presenta livelli più elevati di ansia, de-

pressione e fatica rispetto ai controlli sani, come mi-surato rispettivamente dalle scale di valutazioneHADS (Hospital Anxiety Depression Scale) e FSS(Fatigue Severity Scale).Da un punto di vista cognitivo, la differenza tra pa-zienti e controlli sani alla Rao’s BRB è risultata sta-tisticamente significativa in tutti i test. In primoluogo sono state confrontate le prestazioni alla bat-teria neuropsicologica dopo uno (T1) e due anni(T2), al fine di verificare se le differenze significativesono state mantenute nel tempo.A T1, la differenza tra la performance in due test nonè stata statisticamente significativa tra i due gruppi,mentre negli altri test è stata rilevata una differenzastatisticamente significativa, con i pazienti che han-no avuto una prestazione peggiore rispetto ai con-trolli. A T2, in tutti i test è emersa una differenzastatisticamente significativa tra i due gruppi, conpazienti che hanno avuto una performance peggio-re rispetto ai controlli.Le differenze tra basale (T0) dei pazienti e le perfor-mances successive [(T1-T0)/T0, e (T2-T1)/T1] sututti i test sono state confrontate attraverso t-testcon le corrispondenti differenze del gruppo di con-trollo sano. Il primo confronto tra i due gruppi dipartecipanti (T1-T0)/T0 non ha mostrato alcuna dif-ferenza significativa: questo modello di risultati po-trebbe significare che quando si considera unperiodo relativamente breve (un anno rispetto al ba-sale) e se si tiene conto delle prestazioni a T0, nonci sono cambiamenti significativi nel profilo cogni-tivo dei pazienti. È interessante notare che il secon-do confronto (T2-T1)/T1 ha mostrato una differenzasignificativa nei seguenti test: SDMT, PASAT2, SRT-D, e WLG: questo modello di risultati potrebbe si-gnificare che quando si considera un periodo più

Studio longitudinale sul funzionamento neuropsicologicoin pazienti con sclerosi multipla in confrontocon la popolazione generale

Simona MalucchicReSM (centro di Riferimento regionale Sclerosi Multipla), aoU San luigi Gonzaga,orbassano - torino

collaboRatoRI:Martina Borghi, Francesco Scavelli, Marco Cavallo, Luca ostacoli,Sara Carletto, Antonio Bertolotto

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lungo (due anni rispetto al basale), alcuni test diven-tano più impegnativi per i pazienti con sclerosi mul-tipla rispetto ai controlli sani.

CoNCLUSioNiIl campione è composto da 303 pazienti (91 maschie 212 femmine) e 279 controlli (84 maschi e 195 fem-mine). 267 pazienti su 303 (88%) sono classificaticome SM recidivante-remittente (RR), 9 (3%) comeprimaria progressiva (PP), 21 (7%) secondaria pro-gressiva (SP), e 6 (2%) come recidivante-progressiva(RP).Al T0 i due gruppi di partecipanti differiscono inHADS-ansia e HADS-depressione. Inoltre, il livello difatica valutato con FSS, è significativamente diversa.Il deficit cognitivo è stato definito operativamentecome il sussistere di due o più test BRB con pun-teggi di almeno 1,5 deviazioni standard al di sottodel punteggio dei controlli sani. 195/303 pazienti(64,4%) non ha mostrato la presenza di impairment

cognitivo (C.I.); 34/108 (11,2%) presentano un gradolieve di C.I.; 31/108 (10,2%) presentano una C.I. mo-derata; 43/108 (14,2%) mostrano un C.I. grave. I pre-dittori significativi più sensibili dei punteggi allaBRB-N sono stati: la presenza di SM, l’età, l’istruzio-ne, e il vocabolario. I predittori significativi se si con-siderano solo i pazienti con SM sono stati: corso diSM, età, istruzione, vocabolario e depressione.I risultati confermano l’evidenza della presenza edella natura del deterioramento cognitivo in un am-pio campione di pazienti con sclerosi multipla. Inol-tre, i nostri risultati identificano importanti fattoriclinici e demografici di deterioramento cognitivo neipazienti con SM: il decorso, la durata della malattia,il punteggio EDSS e il vocabolario. I pazienti chehanno forme progressive di SM tendono a presen-tare un profilo clinico e cognitivo più grave, rispettoai pazienti con forma recidivante remittente dellamalattia.

COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSThe project aims to evaluate and monitor the cog-nitive impairment progression by means of theRao’s Brief Repeatable Battery, that is by far themost widely used tool to estimate cognitive dis-function in MS patients. The battery was adminis-tered to patients affected by MS referring to theCReSM (Centro Regionale di Riferimento per laSclerosi Multipla) of AOU San Luigi Gonzaga in Or-bassano, Turin.303 persons were recruited and the following de-mographic variables were collected: age, sex, dis-ease duration and details on the disease. In orderto neutralize possible practice effects, the sameneuropsychological battery was administered to acontrol group made of healthy subjects from thesame catchment area. Group matching was usedto obtain comparable distribution of sex, age andeducational level. Patients’ results were comparedwith those of the control group, providing the rateof practice effect to be considered in order to havea clear picture of the real decline. The two cohortswere followed for three years and the test was per-formed yearly. Physical disability was rated using

Kurtzke’s EDSS score. From the data gathered bythe research it was possible to obtain: prevalenceof cognitive dysfunctions in a general MS popula-tion, rate of real cognitive progression for year, pos-sible correlation between cognitive functions andEDSS, depression, fatigue and anxiety.

RESULTSAs expected, from a clinical standpoint, the groupof patients presented with higher levels of anxiety,depression and fatigue than healthy controls, asmeasured by the HADS (Hospital Anxiety Depres-sion Scale) and the FSS (Fatigue Severity Scale), re-spectively.From a cognitive point of view, the difference be-tween patients and healthy controls on the Rao’sBRB subtests was statistically significant for all ofthem. We firstly compared patients’ and healthycontrols’ performances on the Rao BRB subtestson both T1 and T2, in order to verify whether thesignificant differences were maintained over time.At the T1 assessment, participants’ performance ontwo subtests was not statistically significantly dif-ferent between the two groups, whereas the other

longitudinal study of neuropsychological functioning in MSpatients in comparison to general population

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subtests maintained a statistically significant differ-ence, with patients performing worse than controls.Then, at the T2 assessment, participants’ perform-ance on all of the cognitive subtests presented astatistically significant difference between the twogroups, with patients performing worse than con-trols.Secondly, in order to reach our goal, the differencesbetween patients’ baseline and the following per-formances [(T1-T0)/T0, and (T2–T1)/T1] on all of thecognitive subtests were compared with the corre-sponding differences in the healthy control groupvia t-test. The first comparison between the twogroups of participants (T1–T0)/T0 did not show anysignificant difference: this pattern of results couldmean that when considering a relatively short peri-od (one year from baseline) and when taking intoaccount baseline performance, there is no signifi-cant change in patients cognitive profile. Interest-ingly, the second comparison (T2–T1)/T1 showed asignificant difference in the following subtests:SDMT, PASAT2, SRT-D, and WLG: this pattern ofresults could mean that when considering a longerperiod (two years from baseline), even if we take in-to account one-year performance, some subtestsbecome more challenging for patients with MS, ascompared to healthy controls.

CoNCLUSioNSThe sample consists of 303 patients (91 males and212 females) and 279 controls (84 males and 195

females). 267 patients out of 303 (88%) are classi-fied as relapsing-remitting (RR), 9 (3%) as primaryprogressive (PP), 21 (7%) as secondary progressive(SP), and 6 (2%) as relapsing-progressive (RP).At T0 the two groups of participants differed inHADS-anxiety and HADS-depression. In addition,the level of fatigue, FSS, was significantly differenttoo. Cognitive impairment was defined operativelyas having two or more BRB tests with scores atleast 1.5 standard deviations below the scores ofhealthy controls. 195/303 patients (64.4%) did notshow the presence of cognitive impairment (C.I.);34/108 (11.2%) presented with a mild degree ofC.I.; 31/108 (10.2%) with a moderate C.I.; 43/108(14.2%) presented with a severe C.I. The significantpredictors of the most sensitive BRB-N scoreswere: presence of MS, age, education, and vocab-ulary. The significant predictors when consideringMS patients only were: course of MS, age, educa-tion, vocabulary, and depression.The results corroborate the evidence about thepresence and the nature of cognitive impairment ina large sample of patients with MS. Furthermore,our findings identify significant clinical and demo-graphic determinants of cognitive impairment in MSpatients: course of MS, duration of illness, EDSSscore and vocabulary. Patients presenting with theprogressive forms of MS tend to present a more se-vere clinical and cognitive profile, as compared topatients with the relapsing remitting form of the dis-ease.



Borghi M, Cavallo M, Carletto S, Ostacoli L, Zuffranieri M, Picci RL, Scavelli F, Johnston H, Furlan P.M, Bertolotto A., Malucchi S, Presence and significantdeterminants of cognitive impairment in a large sample of patients with multiple sclerosis”, PLOS One, 2013 July 29;8(7); -abstract presented to theAmerican Academy of Neurology, Philadelphia 2014

Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2009 per il periodo di 3 anni (prorogato di 12 mesi) e l’ammontaredi 100.000 €

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PREMESSE E oBiETTiViLa sclerosi multipla (SM) può essere associata amolti sintomi psicologici. Uno dei sintomi più rile-vanti è l’esperienza di disagio legata all’impattotraumatico della diagnosi o di episodi recidivanti ealla progressione della malattia, che può portare al-lo sviluppo di un Disturbo Post-Traumatico daStress (DPTS). La prevalenza di DPTS in pazientiaffetti da SM varia tra il 16% e il 18% secondol’unica ricerca pubblicata in letteratura precedentea questo progetto (Chalfant et al., 2004), e non cisono altri studi sull’efficacia dei trattamenti psico-logici per pazienti con SM nonostante la sua rile-vanza per la qualità di vita delle persone con SM.Lo scopo primario di questa ricerca è quello di va-lutare l’efficacia del trattamento con EMDR (EyeMovement Desensitization and Reprocessing) peril DPTS secondario alla SM, comparandolo alla Ter-pia di Rilassamento (RT). L’EMDR è il trattamentoelettivo (insieme alla terapia cognitivo-comporta-mentale) per il DPTS secondo le linee guida inter-nazionali. Inoltre come obiettivi secondari si vuolevalutare l’efficacia dell’EMDR sui sintomi associatial DPTS di ansia e depressione, e sulla qualità dellavita dei pazienti.

RiSULTATiIl risultato più significativo che emerge da questostudio è che la maggior parte dei pazienti sono statiin grado di superare il DPTS dopo 10 sedute di te-rapia. Entrambi i trattamenti sembrano essere effi-caci nel ridurre il DPTS e i sintomi concomitanti diansia, depressione e nel migliorare la qualità di vita

delle persone affette da SM, anche in un numero li-mitato di sedute, con un effetto che dura anche do-po 6 mesi dalla fine del trattamento psicologico,soprattutto per il gruppo trattato con EMDR. Un da-to da sottolineare è la minore prevalenza di DPTS ri-sultata rispetto al previsto (6,9%). L’unica altraricerca condotta finora è stata quella di Chalfant ecollaboratori nel 2004, che ha registrato una preva-lenza di DPTS in pazienti con SM di quasi il 16-18%.Sulla base di questi risultati avevamo ipotizzato chela somministrazione del IES-R a circa 500 pazientici avrebbe permesso di raggiungere il numero di 60pazienti trattati. Invece, abbiamo dovuto ampliare ilnostro gruppo di screening a circa 1.000 pazienti af-fetti da SM. Una possibile spiegazione di questa di-screpanza tra i risultati trovati da Chalfant ecollaboratori [2004] e i risultati di questo progetto èl’impiego di diversi questionari per valutare e appro-fondire la diagnosi di DPTS. Questa procedura dif-ferente può comportare una diversa efficienza nelrilevare la presenza di DPTS. Inoltre, il nostro cam-pione è molto più ampio di quello dello studio diChalfant, ed è quindi possibile che i nostri risultatipossano rappresentare una stima più realistica delreale prevalenza di DPTS secondario alla SM.

CoNCLUSioNiQuesto progetto di ricerca mostra che in pazienticon SM, l’EMDR e la Terapia di Rilassamento sonoefficaci nel ridurre i sintomi di DPTS anche con unnumero limitato di sedute. L’EMDR può essere piùefficace della RT, perché la sua efficacia permaneanche sei mesi dopo la fine del trattamento e in al-

l’efficacia dell’Eye Movement Desensitizationand Reprocessing (EMDR) in pazienti con Disturbo posttraumatico da Stress con diagnosi di sclerosi multipla.Uno studio randomizzato controllato

COMPENDIO 2015

Pier Maria FurlanDipartimento di Scienze cliniche e biologiche, Università degli Studi di torino, torino

collaboRatoRI:Luca ostacoli, Sara Carletto, Martina Borghi, Gabriella Bertino,Simona Malucchi

collaboRazIoNI coN altRI GRUppI: Centro Regionale di Riferimento per la SclerosiMultipla (CReSM), A.o.U. San Luigi Gonzaga, orbassano (Torino)

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cuni casi i risultati sono più visibili nel lungo termine.Questi risultati incoraggianti dimostrano che è es-senziale che i sintomi di DPTS vengono rilevati eche interventi brevi e costo-efficaci per ridurre il

DPTS e i sintomi associati, vengano offerti ai pa-zienti con SM, al fine di aiutare questi pazienti a ri-durre il carico psicologico associato ala loromalattia.

iNTRoDUCTioN AND AiMSMultiple sclerosis (MS) can be associated to manypsychological symptoms. One of the most relevantsymptom is the experience of distress related to thetraumatic impact of the diagnosis or of relapsingepisodes and the progression of the disease, thatcan lead to the development of Post-TraumaticStress Disorder (PTSD). The prevalence of PTSD inMS ranges between 16% and 18% (Chalfant et al.,2004), and as far as we know there are no studieson the efficacy of psychological treatments in MSin spite of its relevance for patients’ quality of life.Primary aim of this research is to evaluate the effi-cacy of the treatment with EMDR (Eyes MovementDesensitization and Reprocessing) in PTSD sec-ondary to MS, in comparison with Relaxation Ther-apy (RT). EMDR is the elective treatment (togetherwith Cognitive Behavioral Therapy) for PTSD ac-cording to the international guidelines. The second-ary aims are to evaluate the efficacy of EMDR onthe PTSD-associated symptoms of anxiety and de-pression, and on the patients’ quality of life.

RESULTSThe most significant result emerging from this studyis that the majority of patients were able to over-come their PTSD diagnosis after 10 therapy ses-sions. Both treatments seems to be effective inreducing PTSD, and concomitant anxiety and de-pressive symptoms, and to improve quality of life,even in a limited number of sessions, with an effectthat lasts even after 6 months after the end of thepsychological treatment, especially for the grouptreated with EMDR.It’s important to underline that we found a lowerprevalence of PTSD (6.9%) than expected. The only

research conducted so far was that of Chalfant andcollaborators in 2004, which reported a prevalenceof PTSD in patients with MS of almost 16-18%. Onthe basis of these results in the protocol of ourstudy we hypothesized that the administration ofthe IES-R in approximately 500 patients would al-low us to reach the number of 60 patients treated.Instead, we had to expand our catchment group tonearly 1,000 patients with MS. A possible explana-tion for this discrepancy between the results foundby Chalfant and collaborators [2004] and the resultsof the current research is the use of different ques-tionnaires to reach the diagnosis of PTSD. This dif-ferent procedure may result in a different capacityto detect the presence of PTSD. In addition, oursample is much broader than that of Chalfant study,and it is therefore possible that our results may rep-resent a more realistic estimate of the actual preva-lence of PTSD secondary to MS.

CoNCLUSioNSThis research project suggests that in MS patients,EMDR and RT are effective for reducing PTSDsymptoms even with a limited number of sessions.EMDR may be more effective than RT, because itseffects lasts even six months after the end of treat-ment and in some cases the results are more visibleat a time-distance of some months.These encouraging results show that it is essentialthat PTSD symptoms are detected and that briefand cost-effective interventions to reduce PTSD andassociated psychological symptoms, were offeredto to patients with MS, in order to help these pa-tients to reduce the psychological burden associat-ed with their disease.

the efficacy of Eye Movement Desensitization andReprocessing (EMDR) in patients with post traumatic StressDisorder in multiple sclerosis. a randomized controlled trial


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COMPENDIO 2015


Ostacoli L, Carletto S, Borghi M, Cavallo M, Rocci E, Zuffranieri M, Malucchi S, Bertolotto A, Zennaro A, Furlan PM, Picci RL. Prevalence and significantdeterminants of Post-traumatic Stress Disorder in a large sample of patients with Multiple Sclerosis. Journal of Clinical Psychology in Medical Settings,2013, 20:240-246

Carletto S. The application of EMDR in medical disorders and depression. Research results.Convegno Eye Movement doctoral research: Fourth Metz Academic Meeting (MAM),Université de Lorraine, Metz (FR), 8-9 luglio 2014

Borghi M, Bertino G, Boni D, Carletto S, Castaldo M, Marnetto L, Negro M, Zaccarino C, Ostacoli L. L’efficacia dell’EMDR in pazienti con Disturbo PostTraumatico da Stress con diagnosi di Sclerosi Multipla. Uno studio randomizzato controllato. Convegno Nazionale EMDR “Labirinti traumatici: il filo del-l’EMDR”, Milano, 8-9-10 novembre 2013

Carletto S. The application of EMDR in medical disorders and depression. Current research. Convegno Eye Movement doctoral research: Third MetzAcademic Meeting (MAM),Université de Lorraine, Metz (FR), 2-3 luglio 2013

Carletto S, Francone D, Castaldo M, Negro M, Borghi M, Bertino G, Zuffranieri M, Ostacoli L, Furlan PM. L’efficacia dell’Eye Movement Desensitizationand Reprocessing (EMDR) in pazienti con Disturbo Post Traumatico da Stress con diagnosi di Sclerosi Multipla. XLI Congresso Nazionale della SocietàItaliana di Psicoterapia Medica, Sezione della Società Italiana di Psichiatria, “Psicoterapia. Curare con le parole, integrare con il nuovo, dimostrare conle neuroscienze”, Centro Didattico Facoltà di Medicina e Chirurgia San Luigi Gonzaga, Orbassano (TO), 8-10 giugno 2012

Ostacoli L, Borghi M, Carletto S, Cavallo M, Malucchi S, Sguazzotti E, Rocci E, Zuffranieri M, Furlan PM. L’efficacia dell’Eye Movement Desensitizationand Reprocessing (EMDR) in pazienti con Disturbo Post Traumatico da Stress con diagnosi di Sclerosi Multipla. Uno studio randomizzato controllato.Convegno Nazionale EMDR “Trauma e Relazione”, Roma, 23-24-25 settembre 2011

Borghi M, Carletto S, Rocci E. Il Disturbo Post Traumatico da Stress in soggetti con diagnosi di Sclerosi Multipla. XIII Congresso Nazionale della Sezionedi Psicologia Clinica-Dinamica, Associazione Italiana Psicologia (AIP), Catania, 16-18 settembre 2011


CLASSIFICAZIONE EDIAGNOSI DELLA MALATTIA

DISEASE CLASSIFICATION AND DIAGNOSIS

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PREMESSE E oBiETTiViL’identificazione di biomarcatori immunologici e viepatologiche specifiche nell’insorgenza e progressio-ne della sclerosi multipla (SM) rappresenta una sfidaimportante per migliorare l’efficienza prognostica ele possibili terapie. Poiché l’immunità adattativa gio-ca un ruolo rilevante nell’eziopatologia della SM, ab-biamo studiato la risposta dei linfociti T verso piccoliframmenti (epitopi) derivati dalla digestione di pro-teine mieliniche da parte dei proteasomi, complessidi degradazione proteica. In particolare, ci siamo fo-calizzati su un meccanismo peculiare del proteaso-ma detto Proteasome-catalysed peptide Splicing ingrado di legare frammenti di proteine precedente-mente tagliate e generare nuovi antigeni. Tale studioè stato condotto in pazienti con forma di SM recidi-vante remittente (SMRR), persone in cui si è mani-festata una foma clinicamente isolata (CIS) econtrolli sani, reclutati sia nella popolazione tedescache italiana e portatori delle varianti genetiche HLA-A*02, HLA-A*03 e HLA-B*07 del complesso mag-giore di istocompatibilità di classe I (MHC I), le qualirappresentano un fattore di rischio per lo sviluppodella SM. Inoltre abbiamo cercato di isolare le celluleT CD8+ maggiormente reattive verso epitopi mieli-nici di splicing, per sviluppare cloni da utilizzare instudi in cellulo e approfondire l’analisi di tale mec-canismo sotteso al sistema immunitario umano. Ab-biamo anche caratterizzato lo stato infiammatoriodei donatori misurando nel siero di pazienti e con-trolli i livelli di Osteopontina e di proteasoma circo-lante, implicati nel quadro infiammatorio della SM.

RiSULTATiPer l’identificazione di nuovi epitopi derivati dalladegradazione della mielina con il meccanismo diProteasome-catalysed peptide Splicing abbiamoutilizzato due software innovativi sviluppati nell’Isti-

tuto ospitante, uno bioinformatico predittivo (Spli-ceMet) e uno di quantificazione (QME), associati astudi in vitro di digestione proteica e analisi di spet-trometria di massa. Questo metodo combinato ciha portato all’identificazione di 6 nuovi frammentiproteici di splicing, due dei quali sono stati ricono-sciuti dai linfociti T CD8+. In particolare: un epitopolegante la variante genetica HLA-A*0201 e apparte-nente ad una proteina nucleare del virus Epstein-Barr, virus supposto essere coinvolto nell’insorgenzadella SM; un epitopo legante la variante HLA-B*07e appartenente alla proteina basica della mielina.Verso questi epitopi, successivamente abbiamoidentificato, in individui sani, linfociti T CD8+ alta-mente responsivi, che sono stati processati per losviluppo di cloni cellulari sebbene senza successo.Infine, abbiamo caratterizzato lo stato infiammatoriodi pazienti e controlli sani tramite misura dell’Osteo-pontina e del proteasoma circolante nel sangue.L’Osteopontina è una molecola pro-infiammatoriache ha un ruolo fondamentale nella SM, il proteaso-ma circolante è la forma extracellulare dei proteaso-mi e il suo livello, misurato in vari fluidi biologici,aumenta in condizioni patologiche. Dal nostro stu-dio è emerso che l’Osteopontina e il proteasomacircolante aumentavano nei pazienti con SMRR ri-spetto ai controlli e i loro livelli erano inversamentecorrelati. Il proteasoma circolante sembra esserecoinvolto nei processi che diminuiscono l’infiamma-zione, contrariamente all’Osteopontina, suggerendouna possibile interazione tra le due molecole. Que-sto potrebbe quindi rappresentare un nuovo mec-canismo patologico della SM.

CoNCLUSioNiIl meccanismo di Proteasome-catalysed peptide

Splicing aumenta notevolmente la variabilità delleproteine riconosciute dal nostro sistema immunitario

Identificazione di biomarcatori infiammatori e dei corrispettivimeccanismi specifici nella sclerosi multipla

COMPENDIO 2015

Morena MartucciDIMES- laboratorio di Immunologia, Università di bologna, bologna, Italia;charitè- Institute of biochemistry, University of berlin, berlin, Germany

MENtoRE: Michele Mishto

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e quindi rappresenta un punto chiave, finora trascu-rato, per la comprensione delle reazioni autoimmunialla base di patologie come la SM. Inoltre le nostreosservazioni potrebbero suggerire nuovi biomarca-

tori sierici capaci di agevolare il monitoraggio dellafase attiva di malattia, ma anche la progressione ela risposta alla terapia con uso di metodi non inva-sivi per il paziente.

iNTRoDUCTioN AND AiMSThe identification of immunological biomarkers andpathological pathways involved in the onset andprogression of multiple sclerosis (MS) is a majorchallenge to improve prognosis and therapies.Since adaptive immunity plays an important role inthe aetiopathology of MS, we studied the responseof T lymphocytes against small fragments (epi-topes) derived from the digestion of myelin proteinsby proteasomes, proteolytic complexes for proteindegradation. In particular, we focused on a peculiarmechanism of proteasome activity named Protea-

some-catalysed peptide Splicing, which is capableto ligate protein fragments previously cut and thusgenerate new antigens. This study was carried inpatients with the relapsing-remitting form of MS(RRMS), people affected by clinically isolated syn-drome (CIS) and healthy controls, recruited in theItalian and German population. These individualscarried the genetic variants HLA-A*02, HLA-A*03and HLA-B*07 of the major histocompatibility com-plex class I (MHC I), which represent a risk factorfor the development of MS. We also tried to isolatethe CD8+ T cells highly responsive against myelinspliced epitopes, to develop specific clones to usein in cellulo studies and analyze in detail one ofmechanisms underlying the human immune sys-tem. We also analyzed the inflammatory profile ofsera patients and controls to characterize the in-flammatory status of the donors. To this end wemeasured the levels of Osteopontin and circulatingproteasomes, which are implicated in the inflamma-tory framework of MS.

RESULTSIn order to identify new epitopes derived from thedegradation of myelin protein by the mechanism ofProteasome-catalysed peptide Splicing we usedtwo innovative softwares developed in the host In-

stitute: a predictive bioinformatics method(SpliceMet) and a quantification method (QME), as-sociated to in vitro studies of protein digestion andmass spectrometry analyses. This combined ap-proach led us to the identification of 6 novel splicedprotein fragments, two of which have been recog-nized by CD8+ T cells. In particular: one HLA-A*0201-binder epitope derived from a nuclearprotein of Epstein-Barr virus - virus supposed to beinvolved in MS onset; an HLA-B*07-binder epitopederived from the myelin basic protein. Towardsthese epitopes, we subsequently identified inhealthy people highly responsive CD8+ T lympho-cytes, which were used to develop cell clones al-though without success. Finally, we characterizedthe inflammatory status of patients and healthy con-trols by measuring Osteopontin and circulating pro-teasome in blood samples. Osteopontin is apro-inflammatory molecule that plays a key role inMS, while circulating proteasome is the circulatingextracellular form of the proteasomes and its levelmeasured in various biological fluids increases inpathological conditions. In our study Osteopontinand circulating proteasome increased in RRMS pa-tients compared to controls and their levels were in-versely correlated. The circulating proteasome maybe involved in the down regulation of inflammation,contrarily to Osteopontin, suggesting a possible in-terplay between the two molecules. This might rep-resent a novel pathological mechanism involved inMS.

CoNCLUSioNSProteasome-catalysed peptide Splicing mechanismnotably increases the variability of proteins recog-nized by our immune system and therefore repre-sents a key mediator, yet neglected, tounderstanding the autoimmune response underly-ing diseases like MS. Furthermore, our observations

Identification of inflammatory biomarkers relatedto underlying MS–specific mechanisms

CLASSIFICAZIONE E DIAGNOSI DELLA MALATTIA

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may suggest new serum biomarkers capable of fa-cilitating the monitoring of the active phase of dis-

ease, but also the progression and response totherapy by using non-invasive methods.

COMPENDIO 2015


Bellavista E; Martucci M; Vasuri F; Santoro A; Mishto M; Kloss A; Capizzi E; Degiovanni A; Lanzarini C; Remondini D; Dazzi A; Pellegrini S; Cescon M;Capri M; Salvioli S; D’Errico-Grigioni A; Dahlmann B; Grazi GL; Franceschi C. “Lifelong maintenance of composition, function and cellular/subcellulardistribution of proteasomes in human liver”. Mech Ageing Dev. 2014; 141-142C:26-34.

Borsa di studio finanziata con il Bando 2011 per il periodo di 2 anni e l’ammontare di 58.000 €

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PREMESSE E oBiETTiViLa sclerosi multipla (SM) è una reazione infiamma-toria cronica immuno-mediata contro costituenti delsistema nervoso centrale. Le cellule T regolatrici(Treg) giocano un ruolo chiave nel bilanciare risposteautoimmuni e un loro deficit può favorire l’espansio-ne di cloni T auto-reattivi. Recentemente i microRNA(miRNA), molecole che regolano l’espressione geni-ca e perciò le funzioni cellulari, sono state coinvoltenelle malattie autoimmuni. L’assenza di miRNA nellecellule immunitarie favorisce le malattie autoimmunisistemiche. In questo progetto abbiamo analizzatol’espressione dei miRNA nelle Treg di pazienti conSM recidivante-remittente e nel sangue di paziential loro primo episodio di malattia (CIS).

RiSULTATiAbbiamo misurato il profilo di espressione dei miR-NA, usando microarray, nelle Treg di 12 personecon SM recidivante-remittente in condizioni di sta-bilità di malattia e in 14 controlli sani. Abbiamo iden-tificato le Treg usando i marcatori CD4 e CD25, maquesti marcatori sono espressi anche su cellule ef-fettrici. Perciò abbiamo isolato le Treg dalle T effet-trici usando il marcatore CD127, espresso solo dalleT effettrici, come selezione negativa. Le cellule cosìpurificate sono state usate per validare i risultati delmicroarray e per fare studi funzionali. In parallelo,usando un approccio puramente bioinformatico,abbiamo identificato ulteriori 23 miRNA candidati

ad essere differenzialmente espressi nelle Treg deipazienti con SM. Tra i miRNA alterati, sono stati tro-vati aumentati i membri del cluster miR-106b-25 incomparazione coi controlli sani. In particolare, ilrapporto di questi miRNA tra Treg e T effettrici mo-strava un notevole aumento nelle Treg dei pazienti.Abbiamo effettuato studi funzionali dimostrandoche miR-106b può promuovere la sopravvivenzadelle Treg in soggetti sani. Inoltre, abbiamo anchedeterminato che lo hsa-miR182 è significativamenteaumentato nel sangue periferico di pazienti con laCIS rispetto a tutti gli altri decorsi di malattia e ri-spetto ai controlli sani.

CoNCLUSioNiAbbiamo trovato che il miR106b è alterato nelleTreg dei pazienti con SM. Questo miRNA è stato di-mostrato in precedenza controllare le funzioni delTGFbeta. Il TGFbeta è coinvolto nella differenzia-zione e maturazione delle Treg. Perciò questo clu-ster di miRNA può alterare la funzione delle Treg neipazienti con SM e promuovere la sopravvivenza dicellule T autoreattive. Questi risultati indicano comepotenzialmente utili nella terapia della SM i bersaglifarmacologici nella via del TGFbeta.L’identificazione del miR182 come marker specificodelle CIS che convertiranno a SM definita potrebbediventare un utile biomarcatore a scopo prognosti-co e per identificare i pazienti meritevoli di tratta-mento precoce.

caratterizzazione di profili di espressione di geni edi microRNa da cellule di sangue periferico di pazientiaffetti da sclerosi multipla

Vittorio MartinelliIstituto di Neurologia Sperimentale, Divisione di Neurologia, Istituto Scientifico San Raffaele,Milano

collaboRatoRI:Giuseppe De Santis, Annamaria Finardi, Roberto Furlan, Cinthia Farina

collaboRazIoNI coN altRI GRUppI:Annamaria Nigro, Università del Salento, lecce

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COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSMultiple Sclerosis (MS) is a chronic inflammatory im-mune-mediated response against constituents of thecentral nervous system. Regulatory T cells (Tregs)play a key role in the autoimmune balance and theirimpairment may facilitate the expansion of auto-ag-gressive T cell clones. Recently, microRNAs (miR-NAs), molecules that regulate gene expression andtherefore cell functions, have been involved in au-toimmune disorders. The absence of miRNA in im-mune cells was shown to facilitate systemicautoimmune diseases. In this project we analyzedthe miRNA expression profile in Tregs from Relaps-ing-Remitting MS (MS-RR) and in the whole bloodof patients at their first clinical episode (CIS).

RESULTSWe measured miRNA expression profile by microar-ray analysis on Tregs from 12 Relapsing-RemittingMS patients in stable condition and 14 healthy con-trols. We identified Tregs using CD4+ and CD25+,but these markers are expressed on both T regula-tory cells and T effector cells. Thus, we isolatedTregs from T effector cells by negative selection us-ing the marker CD127, expressed only on T effectorcells and we used these cells to validate our microar-ray results and to perform functional studies. In par-allel, using purely bio-informatics, we identified 23more miRNAs candidates for being differentially ex-

pressed in Tregs from MS patients. Among thederegulated miRNAs, members of the miR-106b-25cluster were found up-regulated in MS patientswhen compared to healthy donors in Treg cells. Moreinteresting, the ratio between Treg/Teff showed an en-richment of these microRNA in T regulatory cells de-rived from patients if compared to healthy controls.We performed functional studies demonstrating thatmiR-106b can promote Treg cell survival in healthysubjects. Furthermore, we found that hsa-miR182 issignificantly up-regulated in peripheral whole bloodsamples from CIS patients compared to all diseasecourses of MS and Healthy Control (HC).

CoNCLUSioNSWe found that miR-106b is disregulated in the Tregof MS patients. This miRNA was previously shownto modulate the TGFbeta signaling pathway. TGF-beta is involved in T regulatory cells differentiationand maturation. Therefore, the deregulation of thismiRNA cluster can alter Treg cells activity in courseof MS and can promote T cells survival. These re-sults indicate all druggable targets reinforcing theTGF-b pathway as potentially efficacious in MS.The identification of miR-182 as a marker specificfor clinically isolated syndrome patients that willconvert to definite MS may become a useful bio-marker for prognostic purpose and to identify pa-tients that need early treatment.

characterization of genes and microRNas expressionprofiles from peripheral blood cells in patients affectedby multiple sclerosis


De Santis G, Diamantini A, Battistini L, Borsellino G, Martinelli V, Moiola L, Colombo B, Rodegher M, Rossi P, Comi G, Furlan R. Differential miRNAs ex-pression profile between treg-versus t effector cells in course of multiple sclerosis. European Journal of Neurology. 18, 579-579, 2011

De Santis G, Ferracin M, Biondani A, Caniatti L, Tola MR, Castellazzi M, Zagatti B, Battistini L, Borsellino G, Fainardi E, Gavioli R, Negrini M, Furlan R,Granieri E. Altered miRNA expression in T regulatory cells in course of multiple sclerosis Journal of neuroimmunology 226 (1), 165-17, 2010


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PREMESSE E oBiETTiViLa patologia della corteccia cerebrale, o sostanzagrigia, ha un ruolo fondamentale nella progressionedella sclerosi multipla (SM) a causa del forte impattosull’accumulo di disabilità neurologica e motoria. Glistudi neuropatologici hanno contribuito a caratte-rizzare alcuni degli eventi di neurodegenerazione,danno assonale e alterazione delle cellule gliali as-sociati all’attivazione microgliale e alla presenza diinfiltrati infiammatori e strutture simil-linfoidi nellemeningi. Tuttavia, la conoscenza dei meccanismimolecolari che sottendono alla formazione delle le-sioni corticali è ancora incompleta. In questo pro-getto abbiamo cercato di comprendere nel dettagliole alterazioni molecolari associate al danno corticalein campioni di tessuto autoptico cerebrale di pa-zienti affetti da SM secondariamente progressiva(SMSP), precedentemente analizzati in uno studioneuropatologico delle lesioni corticali. Abbiamo,inoltre, correlato le specifiche caratteristiche neuro-patologiche e il profilo di espressione genica dellelesioni corticali con l’espressione genica e i livelli dialcune citochine infiammatorie, rispettivamente,nelle meningi e nel liquido cerebrospinale deglistessi pazienti.

RiSULTATiI dati generati nello studio di espressione genicamediante microarray condotto in precedenza sutessuto corticale cerebrale (corteccia motoria) au-toptico da 10 pazienti SMSP con abbondante in-fiammazione meningea, 10 pazienti SMSP con

infiammazione meningea esigua o assente, e 10controlli sani, sono stati sottoposti a una dettagliataanalisi biostatistica e a successiva validazione.L’analisi dei geni differenzialmente espressi nellacorteccia cerebrale dei due gruppi di pazienti conSMSP rispetto ai controlli ha consentito di validarele alterazioni corticali cellulari precedentemente evi-denziate, quali il marcato danno neuronale e asso-nale e la presenza di attivazione microgliale. Sonostati, inoltre, identificati e validati numerosi geni esegnali intracellulari che sono risultati alterati in pre-senza di abbondanti infiltrati meningei. In particolare,è stata evidenziata una disregolazione della rispostainfiammatoria intracorticale mediata dal fattore dinecrosi tumorale TNF, espresso principalmente dallamicroglia attivata. Una stretta associazione è statariscontrata tra infiammazione meningea e incremen-to dei segnali pro-apoptotici e necroptotici mediatida uno dei recettori del TNF, il TNFR1. Questo re-cettore è espresso principalmente nei neuroni e ne-gli oligodendrociti presenti nelle lesioni corticali deipazienti con maggiore danno corticale e più rapidaprogressione della malattia. Al contrario, nelle lesionicorticali dei pazienti con minore grado di infiamma-zione meningea ed estensione del danno corticalee decorso più lento della malattia, è stato riscontratoun incremento significativo di segnali intracellularilegati all’attivazione di un altro recettore del TNF, ilTNFR2, quali segnali anti-apoptotici e segnali coin-volti nella risposta anti-infiammatoria e nella soprav-vivenza cellulare. La produzione delle molecolepro-infiammatorie TNF e interferone-gamma è stata

Studio neuropatologico e molecolare mirato a comprenderela relazione tra processo infiammatorio nelle meningie danno cerebrale corticale nella sclerosi multipla

Roberta MagliozziDipartimento di biologia cellulare, Istituto Superiore di Sanità, Roma

collaboRatoRI:Eleonora Aricò, Barbara Serafini, Barbara Rosicarelli, Maria StefaniaBrignone, Carolina Cruciani, Francesca Aloisi

collaboRazIoNI coN altRI GRUppI:Richard Reynolds, Chris Gardner, Richard Nicholas (Imperial college london, UK)owain Howell, (Swansea University, UK)

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rilevata sia nelle meningi (a livello di espressione ge-nica) che nei campioni di liquor (a livello proteico)provenienti degli stessi casi SMSP con elevato gra-do di infiammazione meningea/danno corticale.Questi risultati suggeriscono che gli infiltrati infiam-matori meningei contribuiscono alla produzione del-le molecole infiammatorie presenti nel liquor e chetali molecole, diffondendo attraverso la membranapiale, possono promuovere demielinizzazione, neu-rodegenerazione e attivazione microgliale nelle le-sioni corticali sottopiali.Infine, in un’estesa analisi di tessuto autoptico ce-rebrale da 44 pazienti con SMSP, abbiamo descrittoper la prima volta la presenza di infiltrati infiamma-tori perivascolari all’interno delle lesioni corticali diuna elevata percentuale (42%) dei pazienti conmaggiore infiammazione meningea e danno corti-cale. Tali infiltrati corticali, particolarmente ricchi dilinfociti B e plasmablasti/plasmacellule, sono statiapprofonditamente studiati per la presenza di pro-teine sintetizzate durante la fase litica dell’infezionecon il virus di Epstein-Barr (EBV), e di interazioni tracellule infettate con il virus e linfociti T citotossici. Idati ottenuti confermano la presenza di cellule in-fettate con EBV nel sistema nervoso centrale di pa-zienti affetti da SM e sostengono l’ipotesi che il

perpetuarsi del danno cerebrale nella SM possa es-sere sostenuto da una risposta immunopatologica.

CoNCLUSioNiMediante l’utilizzo di un approccio combinato mole-colare e neuropatologico questo progetto ha contri-buito a chiarire la forte associazione tra patologiacorticale e mediatori citotossici prodotti da cellule in-fiammatorie infiltranti le meningi o gli strati più super-ficiali della corteccia cerebrale. In particolare, i nostririsultati sostengono l’ipotesi che il microambiente in-fiammatorio generato nello spazio subaracnoideodelle meningi ha un ruolo fondamentale nella esacer-bazione della patologia corticale cerebrale associatacon la maggiore gravità della fase progressiva dellaSM e che il TNF rappresenta uno dei mediatori chiavedel danno cerebrale. Il meccanismo sottostante com-porterebbe uno sbilanciamento dell’equilibrio recet-toriale e delle vie molecolari associate al TNF conconseguente esacerbazione della patologia corticale.Contribuendo a costruire un quadro più dettagliato ecompleto della patologia corticale nella SM, questi ri-sultati potrebbero facilitare l’identificazione di nuovibiomarcatori della neurodegenerazione nella sostan-za grigia e dei processi infiammatori associati al finedi predire e monitorare il decorso della malattia.

COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSCortical, or grey matter, cerebral pathology in mul-tiple sclerosis (MS) has a key role in the progressionof the disease because of its impact on the accu-mulation of neurological and motor disability. Neu-ropathological studies of cortical brain damage inMS contributed to characterize some of the eventsof neurodegeneration, axonal damage and glial al-terations associated with microglial activation andoccurrence of inflammation and aberrant lymphoid-like structures in the meninges surrounding thecerebral cortex. However, understanding of the im-munopathogenic mechanisms that underlie the for-mation of cortical lesions is still incomplete. In thisproject we have tried to understand and better de-fine the molecular alterations associated with corti-

cal damage in post-mortem brain tissue of caseswith secondary progressive MS (SPMS), previouslyanalysed through a detailed neuropathologicalstudy of cellular alterations in subpial cortical le-sions closely associated to meningeal inflammation.We also correlated the specific cortical neuropatho-logical features and transcriptional profiles with pro-inflammatory cytokines expressed in the meningesor detectable in the cerebrospinal fluid of the samepost-mortem SPMS cases.

RESULTSWe performed a detailed biostatistics analysis andsubsequent validation of the gene expression datapreviously generated in the microarray study of post-mortem cortical tissue (motor cortex) from 10 SPMS

a combined neuropathological and molecular studyaddressing the link between meningeal inflammation andcortical brain damage in multiple sclerosis

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cases with abundant meningeal inflammation, 10SPMS cases with negligible or absent meningeal in-flammation, and 10 healthy controls. Analysis ofgenes differentially regulated in the cerebral cortex ofcases with high and low meningeal inflammationcompared to healthy controls allowed to validate thepathological cell changes observed in SPMS caseswith higher degree of meningeal inflammation/corticaldamage and more severe disease progression, suchas the high level of neuronal and axonal damage andmicroglia activity. Furthermore, this approach allowedto identify changes in several genes and signallingpathways in association with increased meningeal in-flammation, including a significative deregulation ofthe inflammatory response mediated by intracorticaltumour necrosis factor (TNF), a cytokine that is mainlyproduced by activated microglia. In particular, we de-tected a strong association between high levels of in-trameningeal inflammatory activity and increase inpro-apoptotic and necroptotic signals mediatedspecifically by one of the TNF receptors, TNFR1. Thisreceptor was found to be mainly expressed in neu-rons and oligodendrocytes in cortical lesions ofSPMS cases with higher cortical damage and morerapidly progressive disease. On the contrary, a signif-icant increase of anti-apoptotic intracellular signals,anti-inflammatory response and cell survival genes,specifically mediated by the TNFR2 receptor, hasbeen detected in cortical lesions of SPMS cases witha lower degree of meningeal inflammation/corticaldamage and with less severe disease progression.Furthermore, the pro-inflammatory molecules TNFand interferon-gamma were detected both in themeninges (at the gene expression level) and in CSFsamples (at the protein level) from the same post-mortem SPMS cases with high degree of meningealinflammation/cortical damage, supporting the ideathat the cells infiltrating the meninges are the mainsource of inflammatory molecules that, once releasedinto the CSF, are able to spread from the pial surfacetoward the adjacent cortex and mediate diffuse de-myelination, neurodegeneration and glial alterationsin subpial cortical lesions.

Moreover, in an extensive analysis of post-mortembrain samples from 44 cases with SPMS with highand low degree of meningeal inflammation and cor-tical damage, we observed for the first time thepresence of perivascular inflammatory infiltrates inthe cerebral cortical lesions of a substantial propor-tion (42%) of the cases with prominent meningealinflammation. These intracortical immune infiltrates,particularly enriched in B lymphocytes and plas-mablasts/plasma cells, have been extensively stud-ied for the presence of proteins synthesized duringthe lytic phase of Epstein Barr virus (EBV) infectionand for interactions between EBV infected cells andcytotoxic T lymphocytes. The data obtained con-firm the presence of cells infected with EBV in thecentral nervous system of MS patients and supportthe hypothesis that brain damage in MS may besupported by an immunopathological response.

CoNCLUSioNSUsing a combined molecular and neuropathologicalapproach, this project has contributed to clarify thestrong association between cortical cell injury andcytotoxic mediators produced by inflammatorycells infiltrating the meninges or the more superfi-cial layers of the cerebral cortex.. In particular, ourresults support the hypothesis that the inflamma-tory milieu generated in the subarachnoid spacehas a fundamental role in the exacerbation of sub-pial grey matter pathology associated with in-creased severity of the progressive MS phase andthat TNF is one of the key mediators of brain tissuedamage. Increased inflammation and presence ofaberrant follicle-like structures in the meningescould induce a shift of the TNF receptor balanceand its molecular pathways in the cortex, resultingin the exacerbation of neuronal and glia dysfunc-tions in the cortex. By contributing to build up amore detailed and complete picture of corticalpathology in MS, these findings could facilitate theidentification of new biomarkers of inflammatoryneurodegeneration useful to predict and monitorthe disease course.

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COMPENDIO 2015


Choi S, Howell O, Carassiti D, Magliozzi R, Gveric D, Muraro P, Nicholas R, Roncaroli F, Reynolds R. Meningeal inflammation plays a role n the pathologyof primary progressive multiple sclerosis. Brain. 2012 Oct;135(Pt 10):2925-37

Magliozzi R, Serafini B, Rosicarelli B, Chiappetta G, Veroni C, Reynolds R, Aloisi F. B-cell enrichment and Epstein-Barr virus infection in inflammatorycortical lesions in secondary progressive multiple sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol. 2013 Jan; 72 (1): 29-41

Gardner C, Magliozzi R, Durrenberger P, Howell O, Rundle J And Reynolds R. Cortical grey matter demyelination can be induced by pro-inflammatorycytokines in the subarachnoid space. Brain. 2013 Dec;136(Pt 12):3596-608

Calabrese M, Magliozzi R, Ciccarelli O, Geurts J, Reynolds R and Martin R. Exploring the origins of grey matter damage in multiple sclerosis. Nature Re-view Neuroscience 2015 Feb 20;16(3):147-58

Nicholas R, Magliozzi R, Campbell G, Mahad D, Reynolds R. Temporal lobe cortical pathology and inhibitory GABA interneuron cell loss are associatedwith seizures in multiple sclerosis. MultipleSclerosis Journal, accepted March 2015.

Magliozzi R, Durrenberger P, Howell O, Reeves C, Nicholas R, Roncaroli F, Aricò E, Brignone MS, Cruciani C, Reynolds R. The balance of TNF signallingpathways modulates cortical pathology in multiple sclerosis. Manuscript in preparation

Magliozzi R, Aricò E, Durremberger P, Roncaroli F, Nicholas R, Aloisi F, Reynolds R. Gene expression profiling of cortical lesions in secondary progressivemultiple sclerosis. ECTRIMS, Lyon, 10- 13 October 2012

Magliozzi R, Serafini B, Rosicarelli B, Chiappetta G, Veroni C, Reynolds R, Aloisi F. Intracortical inflammation and EBV infection in secondary progressivemultiple sclerosis. Oral communication. 114th Meeting of the British Neuropathology Society, London, 13-15 March 2013

Magliozzi R, Durremberger P, Howell O, Roncaroli F, Aricò E, Aloisi A, Reynolds R. A role for TNF signalling in cortical grey matter pathology in multiplesclerosis. Oral communication. International Conference on Immunology 2013, Milan 22-27 August 2013

Magliozzi R, Durremberger P, Howell O, Roncaroli F, Aricò E, Aloisi A, Reynolds R. A role for TNF signalling in cortical grey matter pathology in multiplesclerosis. SINS 2013, Rome, October 2013

Magliozzi R, Durremberger P, Howell O, Roncaroli F, Aricò E, Brignone MS, Aloisi A, Reynolds R. Meningeal inflammation affects the balance of TNF si-gnalling in cortical grey matter in progressive multiple sclerosis. ACTRIMS-ECTRIMS, Boston, 10-13 September 2014

Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2011 per un periodo di 2 anni e l’ammontare di 69.300 €

PATOGENESI EFATTORI DI RISChIOPATHOGENESIS AND RISK FACTORS

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PREMESSE E oBiETTiViTra i fattori non ereditari potenzialmente coinvoltinell’insorgenza della sclerosi multipla (SM), il virus diEpstein Barr (EBV) è quello su cui si hanno più infor-mazioni. Tuttavia, è difficile capire come un virus cheinfetta la quasi totalità della popolazione adulta pos-sa essere associato con una malattia relativamenterara come la SM. Una possibile spiegazione è cheun particolare genotipo virale possa essere associatoalla malattia. Lo scopo di questo progetto è statoquello di analizzare il genoma di EBV per cercareeventuali genotipi associati con la SM, studiando pri-ma la regione più variabile del DNA virale (Epstein-Barr Antigene nucleare 2-EBNA2) e poi estendendol’analisi all’intero genoma virale.

RiSULTATiAbbiamo sequenziato una parte del DNA codificanteper la proteina EBNA2, nel sangue periferico di sog-getti con SM e controlli sani, classificando i genotipidi EBNA2 secondo quanto descritto in letteratura. Inostri risultati hanno dimostrato che il rischio di svi-luppare la SM correla significativamente con un ec-cesso di allele 1.2 e una ridotta presenza dell’allele1.3B nella popolazione di pazienti. Abbiamo identifi-cato anche nuove varianti genetiche, per lo più asso-ciate all’allele 1.2 che risultano anch’esse associatecon la SM. Non abbiamo trovato correlazioni tra ge-notipi di EBV e le caratteristiche cliniche dei pazienti,

ad eccezione del fatto che l’allele 1.2 si riscontratendenzialmente in pazienti con una ridotta duratadi malattia.In collaborazione con il gruppo del Prof. Pesole (Uni-versità di Bari) abbiamo utilizzato un approccio disequenziamento massivo in un sottogruppo di do-natori, per mettere in luce eventuali fenomeni di co-infezione e nuove varianti rare associate con la SM.Per quanto riguarda la regione di EBNA2 abbiamoosservato una maggiore frequenza di co-infezioni(forse dovuta a infezioni multiple) ed un aumentatonumero di varianti rare nei pazienti rispetto ai sani.Non potendo escludere che altre regioni del com-plesso genoma di EBV possano essere rilevanti perla SM, abbiamo esplorato l’intero genoma virale.Avendo bisogno di una grande quantità di DNA vi-rale, impossibile da ottenere dai pochi linfociti B in-fettati da EBV che sono presenti nel circoloperiferico, abbiamo istituito un’ampia e caratteriz-zata banca di linee linfoblastoidi spontanee (linfocitiB infettati con il ceppo endogeno di EBV, spLCLs)da pazienti e controlli (collaborazione con il gruppodel Prof. Faggioni – Università di Roma “Sapienza”),per avere una fonte illimitata di DNA virale. Abbiamoarruolato nello studio pazienti liberi da terapie im-munomodulatorie da almeno un anno o che nonavevano mai fatto terapia. Abbiamo ottenuto lineespLCLs da 20 pazienti sporadici, 10 donatori sanie due coppie di gemelli monozigoti discordanti per

caratterizzazione dei genoptipi del virus di Epstein-barrnella sclerosi multipla attraverso approcci di sequenziamentomassivo

COMPENDIO 2015

Marco Salvetticentre for Experimental Neurological therapies (cENtERS) Neurologia e Dipartimentodi Neuroscienze, Salute Mentale e organi di Senso, ospedale S. andrea Sapienza Universitàdi Roma, Roma

collaboRatoRI:Rosella Mechelli, Claudia Policano, Viviana Annibali, Renato Umeton,Danila Vittori, Carlo Mattei, Giovanni Ristori

collaboRazIoNI coN altRI GRUppI:Graziano Pesole, Dipartimento di bioscienze, biotecnologia e biofarmaceutica,Università di bari “aldo Moro, responsabile dell’unità pesole-cNRbaAlberto Faggioni, Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sapienza Università di Roma

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SM. Abbiamo finora sequenziato campioni di DNAvirale ottenuti dalle linee di 14 pazienti e otto saniche erano stati sottoposti ad un processo di arric-chimento del DNA virale rispetto al cellulare, chenella nostra analisi è un “contaminante”. Ora stiamoconcludendo l’analisi dei dati per valutare il livelloglobale di variabilità del genoma di EBV nelle duepopolazioni prese in esame e per scoprire eventualialtre varianti associate con la SM.

CoNCLUSioNiAbbiamo mostrato l’adeguatezza delle piattaformedi sequenziamento massivo per studiare il genomadi virus che infettano le cellule del sangue perifericoad una frequenza molto bassa.Abbiamo evidenziato una forte associazione tra va-rianti genomiche di EBV e la SM, rafforzando l’ideache EBV contribuisce allo sviluppo della malattia(Mechelli et al Neurology, in stampa). Le varianti vi-rali potrebbero influenzare l’interazione con l’ospitecome suggerito da diverse evidenze: a) la regione

di EBNA2 che abbiamo studiato interagisce con leproteine cellulari come Nur77 e SMARCB1 che so-no state associate con la suscettibilità alla SM e lerisposte antivirali; b) EBNA2 è importante per il suc-cesso delle strategie che il virus adotta per evitaredi essere eliminato dall’organismo; c) la regionedell’mRNA di EBNA2 che abbiamo studiato è ber-saglio di micro-RNA umani che possono tenere sot-to controllo il virus.Questi risultati sono interessanti anche alla luce dialtri che abbiamo recentemente ottenuto, che di-mostrano che una parte della predisposizione ge-netica alla SM può essere attribuibile alle variantipresenti in geni che interagiscono con EBV. In par-ticolare, le regioni del genoma umano a cui si legaEBNA2 sono risultate significativamente arricchitedi varianti geniche associate alla SM (Ricigliano etal. PlosOne, in stampa), suggerendo che una com-plessa interazione tra varianti geniche sia dell’ospiteche del virus può contribuire allo sviluppo della ma-lattia.

iNTRoDUCTioN AND AiMSAmong the non-heritable causative factors poten-tially involved in the multiple sclerosis (MS) etiology,Epstein Barr virus (EBV) received the most convinc-ing evidence. Nonetheless, it is difficult to under-stand how a virus that ubiquitously infects humanscan be associated with a disease of relative limitedprevalence. One possible explanation is that a par-ticular viral genotype associates with the disease.The aim of this project was to analyze the EBVgenome to look for possible genotypes associatedwith MS, studying first the most variable region ofthe viral DNA (Epstein-Barr nuclear antigen 2-EBNA2) and then extending the analysis to the en-tire viral genome.

RESULTSWe sequenced a region of the DNA coding forEBNA2 protein in peripheral blood of persons withrelapsing-remitting multiple sclerosis and controlsubjects. Our results showed that MS risk signifi-cantly correlated with an excess of 1.2 allele and

under-representation of 1.3B allele. We identifiednew genetic variants, mostly 1.2 allele- and MS-as-sociated. We found no correlation between EBVgenotypes and clinical characteristics of patients,except for a trend toward lower disease duration insubjects bearing the 1.2 allele.Together with Pesole’s group (University of Bari) weused deep-sequencing approach in a subgroup ofdonors, to highlight possible co-existence of differ-ent viral genome and new rare MS-associated viralvariants. Concerning the EBNA2 region we ob-served a marginally significant higher occurrence ofco-existing alleles, possibly deriving from multipleinfections, in MS than in controls. We also found aslightly higher prevalence of variant positions in MSwith respect to healthy subjects.Besides EBNA2, we cannot exclude that additionalregions of the complex EBV genome may also berelevant for MS. To explore the whole EBV genomeusing a deep-sequencing approach is necessary alarge amount of viral DNA, that is impossible to ob-tain from the few EBV infected-B lymphocytes pres-

characterization of Epstein-barr virus genotypes in multiplesclerosis through next generation sequencing approaches

PATOGENESI E FATTORI DI RISCHIO

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ent in peripheral blood. We established an extensiveand characterized repository of spontaneouslygrowing EBV transformed B cell lines (spLCLs) frompatients and controls (Collaboration with Faggioni’sgroup – University of Roma “Sapienza”), to use it asan unlimited source of viral DNA. For patients weconsidered only subjects free from disease-modify-ing therapy for at one year or who were treatmentnaive. We obtained spLCLs from 20 sporadic MSpatients, 10 healthy donors and two couples ofmonozygotic twins discordant for MS. In order toproceed with the sequencing, we finalized a methodfor enrichment of viral compared to the cellular DNA,which in our case is a “contaminant”. So far we se-quenced samples from 14 MS-derived and eightfrom HD-derived spLCLs. We are now concludingthe data analysis to evaluate the global level of vari-ability of EBV genome in MS and HD, and to high-light possible other variants associated with MS.

CoNCLUSioNSWe showed the appropriateness of deep-sequenc-ing platforms to investigate patterns of genetic vari-ation of a virus that latently infects peripheral bloodcells at a very low frequency.

Our study unveils a strong association between EBVgenomic variants and MS reinforcing the idea thatEBV contributes to disease development (Mechelliet al. Neurology, in press). Moreover the presentwork shows that the reported associations betweenviral variants and other immune-mediated diseasesmay be true also for MS, through variants with a po-tentially functional impact on the host: a) the regionof EBNA2 we studied interacts with cellular proteinssuch as Nur77 and SMARCB1 that have been as-sociated with MS susceptibility and antiviral re-sponses; b) the gene region we investigated isimportant for successful strategies of EBV immuneevasion; c) the EBNA2 mRNA, where we found MS-related variants, is target of human micro-RNAs thatmay serve to keep in check EBV infection.To strengthen and complement these results wehave also shown that a portion of the genetic pre-disposition to MS is attributable to variants in genesthat interact with EBV. Specifically, EBNA2 bindingmotifs resulted to be significantly enriched in ge-nomic intervals associated with MS (Ricigliano et al.PlosOne, in press), suggesting that a complex in-terplay between both host and viral genetic variantsmay contribute to disease development.

COMPENDIO 2015


Mechelli R, Manzari C, Policano C, Annese A, Picardi E, Umeton R, Fornsiero A, D’Erchia AM, Buscarinu MC, Agliardi C, Annibali V, Serafini B, RosicarelliB, Romano S, Angelini DF, Ricigliano VAG, Buttari F, Battistini L, Centonze D, Guerini FR, D’Alfonso S, Pesole G, Salvetti M, Ristori G.EpsteinBarr virus genetic variants associated with multiple sclerosis. Neurology, 2015 Mar 4. [Epub ahead of print]

Ricigliano VAG, Handel AE, Sandve GK, Annibali V, Ristori G, Mechelli R, Cader MZ, Salvetti M.EBNA2 binds to genomic intervals associated with multiple sclerosis and overlaps with vitamin D receptor occupancy. PlosOne, in press

Annibali V.*, Mechelli R.*, Buscarinu M.C., Romano S., Fornasiero A., Umeton R., Ricigliano V.A.G., Orzi F., Coccia E.M., Salvetti M. and Ristori G. IFN-ß and multiple sclerosis: From etiology to therapy and back. Cytokine and Growth Rev 2014 Oct 31.*Equal credit for authorship

Mechelli R, Vittori D, Coarelli G, Aimati L, De Luca O, Romano S, Ricigliano VA, Annibali V, Policano C, Mattei C, Salvetti M, Ristori G. Screening for neu-rotropic viruses in cerebrospinal fluid of patients with multiple sclerosis and other neurological diseases. Mult Scler. 2014;20:638

Mechelli R, Umeton R, Policano C, Annibali V, Coarelli G, Ricigliano VA, Vittori D, Fornasiero A, Buscarinu MC; International Multiple Sclerosis GeneticsConsortium; Wellcome Trust Case Control Consortium,2, Romano S, Salvetti M, Ristori G. A “candidate-interactome” aggregate analysis of genome-wide association data in multiple sclerosis. PLoS One. 2013;8(5):e63300

Coarelli G,Manzari C, Annese A, Anastasiadou E,Policano C,D’Erchia AM, Picardi E, Buscarinu MC, Annibali V, Ricigliano V, Tullo A, Trivedi P, Pesole G,Ristori G, Salvetti M and Mechelli R. Characterization of Epstein-Barr virus genotypes in multiple sclerosis through next generation sequencing approa-ches” 12 International Congress of Neuroimmunology (ISNI), November 9-13, 2014, Mainz (DE)

Policano C, Mechelli R, Manzari C, Picardi E, Annibali V, Umeton R, Coarelli G, Ricigliano V, D’Erchia AM, Tullo A, Chiara M,. Horner DS, GP, Ristori Gand Salvetti M Characterization of Epstein-Barr virus genotypes in multiple sclerosis” 11 International Congress of Neuroimmunology (ISNI), November4th - 8th, 2012, Boston, MA, USA and XXII AINI Congress, September 26th-29th, Catania, Italy

Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2011 per un periodo di 2 anni (prorogato di 9 mesi) e l’ammontaredi 149.860 €

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PREMESSE E oBiETTiViStudi recenti hanno identificato almeno 101 regionigenomiche coinvolte nella suscettibilità alla sclerosimultipla (SM) oltre alla già nota regione del com-plesso maggiore di istocompatibilità (MHC). Questirisultati sono stati ottenuti analizzando ampi gruppiinternazionali di persone con SM e persone sanedella popolazione prevalentemente di origine nordeuropea, grazie alla collaborazione nell’ambito delConsorzio Internazionale della Genetica della SM(IMSGC). Il nostro gruppo ha partecipato analizzan-do un gruppo di pazienti italiani e di controlli saniseguiti da Centri SM appartenenti ai due consorziitaliani PROGEMUS e PROGRESSO. In questi studila popolazione italiana rappresentava meno del 5%dell’intera casistica, e questa piccola percentualenon permetteva di identificare eventuali fattori ge-netici associati alla SM specifici della popolazioneitaliana. Inoltre, per la maggior parte delle regionigenetiche associate alla SM, non è stato ancoraidentificato il gene specifico o la sequenza genicaspecifica responsabile dell’associazione e quindinon è stato ancora chiarito il ruolo specifico di que-sti geni nello sviluppo della malattia.Scopo di questo progetto è stato identificare, repli-care e caratterizzare funzionalmente variazioni disequenza genica associate al rischio di SM nellapopolazione dell’Italia continentale.

Il progetto trae vantaggio da a) partecipazione didue delle Unità (UPO e HSR) agli ampi studi inter-nazionale di associazione su tutto il genoma(GWAS) dell’IMSGC; b) ampia casistica di 4000 pa-zienti e 4000 persone sane raccolte da UPO e HSRgrazie alla collaborazione con i consorzi PROGE-MUS e PROGRESSO; e c) l’esperienza consolidatadella terza Unità (CNR-ITB) nella tecnica innovativadi sequenziamento di nuova generazione (NGS,Next Generation Sequencing) che permette di de-terminare la sequenza di molti geni in molte personein tempi rapidi e a costi sostenibili.

RiSULTATiAbbiamo inizialmente condotto uno studio di asso-ciazione su tutto il genoma (GWAS) in 750 pazientie 1272 controlli, seguito da una replicazione dei se-gnali più associati in una casistica indipendente di957 pazienti e 956 controlli. Da questo studio ab-biamo selezionato le regioni che mostravano l’as-sociazione più forte nella popolazione italiana checontenevano 100 diversi geni, e le abbiamo sotto-poste ad analisi NGS in 576 pazienti e 408 controlli.Per alcune di queste regioni (17 regioni, 27 geni) ab-biamo sequenziato, oltre alle regioni che vengonotradotte in proteina (regioni codificanti), anche le se-quenze ad esse fiancheggianti che possono conte-nere elementi di regolazione genica.

Mappatura fine dei loci di suscettibilità alla SMnella popolazione dell’Italia continentale: dai marcatorigenetici identificati attraverso studi di associazionegenome-wide alle varianti causali

Sandra D’AlfonsoDepartment of Health Sciences, Upo. Università a. avogadro, Novara

collaboRatoRI:Nadia Barizzone, Lucia Corrado, Alessandra Bagarotti, Miriam Zuccalà,PRoGEMUS

collaboRazIoNI coN altRI GRUppI (pRoGEtto MUltIcENtRIco):Filippo Martinelli Boneschi, Melissa Sorosina, Federica Esposito,Ferdinando Chiarelli, Paola Brambilla, pRoGRESSo, ospedale San Raffaele,Milano (Unità HSR) Gianluca De Bellis, Roberta Bordoni, Eleonora Mangano,Santosh Anand, Istituto di tecnologie biomediche cNR (Unità cNR-Itb)

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Nell’insieme abbiamo identificato 20.308 varianti,81% delle quali assenti nei database pubblici, cheincludono 1.545 varianti con possibile conseguenzafunzionale. Tra queste, 7.517 erano presenti sia neipazienti che nei controlli, e solo il 20% erano giàstate analizzate in precedenti studi, a dimostrazioneche il nostro studio permetteva di eseguire unascansione di queste regioni con una risoluzionemaggiore rispetto agli studi di associazione giàpubblicati. Per 1.503 varianti genetiche la frequenzaallelica era significativamente diversa tra pazienti econtrolli. Per 33 delle regioni analizzate, almeno unavariante identificata in NGS mostrava una associa-zione più significativa rispetto a quanto osservatonei precedenti studi di associazione. Per 7 dei 100geni sequenziati abbiamo osservato delle nuove ra-re varianti funzionali che mostravano una presenzasignificativamente diversa tra pazienti e controlli,suggerendo che anche le varianti rare possono con-tribuire alla genetica della SM come riportato per al-tre malattie multifattoriali.Nell’insieme questi risultati suggeriscono che il no-stro approccio ci permette di condurre un’analisi diassociazione a risoluzione maggiore rispetto aglistudi pubblicati e a identificare con maggiore pre-cisione qual è la variante funzionale coinvolta nellosviluppo della malattia.La regione che mostrava l’associazione più fortenella nostra popolazione è stata approfondita conulteriori esperimenti. Essa contiene il geneTNFSF14 che codifica per una proteina di membra-ne membro della famiglia dei ligandi del tumor ne-crosis factor (TNF) che lega il TNFRSF14, unmembro della superfamiglia del recettore delTNF.L’analisi NGS ha identificato 172 varianti nelgene TNFSF14, mentre solo 4 erano state analizza-te nei precedenti studi pubblicati. Abbiamo genoti-

pizzato gran parte di queste varianti in 1000 pazientie 1000 controlli indipendenti. I nostri risultati preli-minari dimostrano che l’associazione di questo ge-ne con la SM è principalmente determinata da unavariante intronica che, pur facendo parte della se-quenza che non viene tradotta in proteina, è loca-lizzata in una regione con potenziale funzioneregolativa del gene.Per testare questa ipotesi, abbiamo condotto unostudio funzionale analizzando l’espressione del-l’RNA di 83 pazienti non in trattamento farmacolo-gico, e 35 controlli. L’espressione di TNFSF14 erasignificativamente più bassa nei pazienti rispetto aicontrolli ed era più bassa nelle persone (sia pazientiche controlli) che portavano l’allele associato conla suscettività alla SM.L’insieme delle analisi di associazione e degli espe-rimenti funzionali suggeriscono che una specificavariante nucleotidica di TNFSF14 è associata aduna bassa espressione del gene e questo a sua vol-ta può causare una predisposizione alla malattia inquanto è più rappresentato nei pazienti con SM ri-spetto ai controlli sani e poiché l’espressione diquesto gene è ridotta nelle persone con SM.

CoNCLUSioNiQuesto studio rappresenta un nuovo importantetassello nel complesso processo di identificazionedei fattori genetici che svolgono un ruolo di prota-gonista nello sviluppo della SM. Per la prima voltaè stata condotta una scansione sistematica dei genicoinvolti nell’associazione con la malattia che, al-meno per alcuni di essi, ha permesso di identificarela variante genica primariamente responsabile del-l’associazione. Questo è il passaggio preliminare edindispensabile per identificare nuovi meccanismipatogenetici.

COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSRecent studies led to the identification of at least101 genomic regions involved in the genetic sus-ceptibility to multiple sclerosis (MS) besides thewell-established major hystocompatibility (MHC) re-gion. These results have been obtained analyzing

large group of patients with MS and healthy people(controls) from different countries, mainly of north-ern European origin, thanks to the collaborative ef-forts within the International Multiple SclerosisGenetic Consortium (IMSGC). Our group participat-ed with the analysis of a group of Italian patients

Fine-Scale mapping of multiple sclerosis loci in the continentalitalian population: from tag genetic markers identifiedin Genome Wide association studies to causal variants

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and controls followed by MS centers which are partof the two consortia PROGEMUS and PROGRES-SO. In these studies, Italian patients and controlsrepresented less than 5% of the entire populationand thus they were not designed to identify possi-ble genetic factors contributing to the diseasespecifically in the Italian population. Moreover, forthe vast majority of the identified MS associated re-gions, the specific gene and the specific gene func-tion responsible of the detected associated has notbeen identified yet and thus it has not defined yetthe specific role of these genes in the developmentof the disease.The aim of the project was to identify, replicate andfunctionally characterize sequence variations asso-ciated with the risk to develop MS in the Italian con-tinental population.This project takes advantage of: a) the participationof two (UPO and HSR) of the three Units to the largeinternational whole genome association scan(GWAS) studies within the IMSGC; b) a largedataset of 4000 Italian MS patients and 4000matched controls collected by UPO and HSRthanks to the collaborative support of two Italianconsortia PROGEMUS and PROGRESSO and c)the consolidated expertise of the third UNIT (CNR-ITB) in next generation sequencing (NGS), an inno-vative technique that allows to analyse with a rapidand cost effective approach the DNA sequence ofmany entire genes in a large number of individuals.

RESULTSWe performed an association study in the Italianpopulation with genetic markers mapping in thewhole genome (GWAS) in 750 patients with MS and1272 controls, followed by a replication analysis ofthe genetic markers with the strongest associationwith the disease in the DNA of independent persons(957 patients and 956 controls).From this two-stepstudy, we selected the most associated regions inthe Italian population containing a total of 100genes and performed NGS analysis in 576 MS pa-tients and 408 controls. For some of these regions(N=17 regions, 27 genes) we sequenced, besidesthe segment of the gene that will be translated intoprotein (coding sequences), also the sequencessurrounding these regions which could contain reg-ulatory elements.Overall, we identified 20308 variants, 81% absentin databases, including 1545 predicted functionalvariants (missense, nonsense, splice variants). A to-tal of 7517 variants were present in both patientsand controls, only 20% of them were present in pre-viously utilized genotyping platforms, suggestingthat our approach allowed us to perform a scan

with a more dense and detailed resolution in com-parison to the published association studies.A statistically significant different frequency be-tween MS patients and controls was observed for1503 variants, 8.5% of them absent in databases.For 33 of the analyzed regions, at least one variantidentified from NGS showed a more significant as-sociation than that observed with the genomic plat-forms utilized for published association studies. Forseven of the 100 sequenced genes we observednovel rare functional variants whose cumulativepresence was significantly different in the patientswith MS in comparison with healthy controls (Bur-den test analysis), indicating that even rare-low fre-quency variants can contribute to MS genetics, asreported for other complex diseases.Altogether, these results suggest that our approachallowed to perform a scan with a more dense anddetailed resolution compared to GWAS array tech-nology of the published association studies and toidentify more precisely which is the predicted genefunction involved in the development of the disease.The region showing the most significant associationin the Italian population was selected for a furtherfollow-up and detailed experiments. This includesthe TNFSF14 gene encoding for a transmembraneprotein which is a member of the tumor necrosisfactor (TNF) ligand family and binds TNFRSF14, amember of the tumor necrosis factor receptor su-perfamily.Our sequencing approach identified 172 variants inthe TNFSF14 gene, while only 4 variants were test-ed in the association studies published so far. Wedesigned a custom array to genotype a large partof these variants in independent 1000 patients and1000 controls. Our preliminary results showed thatthe association with MS of this gene is mainly driv-en by an intronic variant which, even if it is part ofthe region of the gene that it is not translated intoprotein, is located in a potential regulatory region ofthe gene.In order to test this hypothesis, we performed afunctional analysis in the RNA samples from 83 pa-tients with MS, naïve to treatment, and 35 healthycontrols. The expression of TNFSF14 was signifi-cantly lower in MS patients in comparison with con-trols (P= 0.007). A significantly lower TNFSF14expression (p=0.003) in individuals carrying the MSrisk variants (both patients and controls) was alsoobserved.Altogether, the sequencing, association analysisand functional experiments suggest that a specificsingle nucleotide variation within the TNFSF14 re-gion is associated with a low expression of the geneand this in turn may cause a predisposition to the


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disease since it is more represented in the patientswith MS compared to healthy controls and since theexpression of this gene is lower in MS patients.

CoNCLUSioNSThis study represents a new step towards the com-plex identification process of the genetic players in-volved in MS susceptibility. The systematic scanning

for the first time of the sequence of a large numberof genes associated with MS susceptibility allowedto pinpoint in a subset of these gene the specificgenetic variants primarily responsible of the detect-ed association and thus directly involved in the de-velopment of the disease. This represents the firststep necessary to identify new pathogenic mecha-nisms.

COMPENDIO 2015


Goris A, Pauwels I, Gustavsen MW, van Son B, Hilven K, Bos SD, Celius EG, Berg-Hansen P, Aarseth J, Myhr KM, D’Alfonso S, Barizzone N, Leone MA,Martinelli Boneschi F, Sorosina M, Liberatore G, Kockum I, Olsson T, Hillert J, Alfredsson L, Bedri SK, Hemmer B, Buck D, Berthele A, Knier B, BiberacherV, van Pesch V, Sindic C, Bang Oturai A, Søndergaard HB, Sellebjerg F, Jensen PE, Comabella M, Montalban X, Pérez-Boza J, Malhotra S, Lechner-Scott J, Broadley S, Slee M, Taylor B, Kermode AG, Gourraud PA; International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, Sawcer SJ, Andreassen BK,Dubois B, Harbo HF. Genetic variants are major determinants of CSF antibody levels in multiple sclerosis.Brain. 2015 Jan 22. pii: awu405

Giacalone G, Clarelli F, Osiceanu AM, Guaschino C, Brambilla P, Sorosina M, Liberatore G, Zauli A, Esposito F, Rodegher M, Ghezzi A, Galimberti D,Patti F, Barizzone N, Guerini F, Martinelli V, Leone M, Comi G, D’Alfonso S, Martinelli Boneschi F. Identification of genes, pathways and networks involvedin disease severity and age at onset in Primary Progressive Multiple Sclerosis. Mult Scler. 2015 Jan 12

Paraboschi EM, Rimoldi V, Soldà G, Tabaglio T, Dall’Osso C, Saba E, Vigliano M, Salviati A, Leone M, Benedetti MD, Fornasari D, Saarela J, De JagerPL, Patsopoulos NA, D’’Alfonso S, Gemmati D, Duga S, Asselta R. Functional variations modulating PRKCA expression and alternative splicing predi-spose to multiple sclerosis. Hum Mol Genet. 2014 Dec 20;23(25):6746-61

Sorosina M, Esposito F, Guaschino C, Clarelli F, Barizzone N, Osiceanu AM, Brambilla P, Elisabetta M, Cavalla P, Gallo P, PROGRESSO, PROGEMUS,Martinelli V, Leone M, Comi G, D’Alfonso S, Martinelli Boneschi F. Inverse correlation of genetic risk score with age at onset in bout-onset and progres-sive-onset Multiple Sclerosis. Mult Scler. Multiple Sclerosis Journal 2014 Dec 22

Sorosina M, Brambilla P, Clarelli F, Barizzone N, Lupoli S, Guaschino C, Osiceanu AM, Moiola L, Ghezzi A, Coniglio G, Patti F, Mancardi G, Manunta P,Glorioso N, Guerini FR, Bergamaschi R, Perla F; PROGRESSO; PROGEMUS, Martinelli V, Cusi D, Leone M, Comi G, D’Alfonso S, Martinelli-Boneschi F.Genetic burden of common variants in progressive and bout-onset multiple sclerosis. Mult Scler June 2014 vol. 20 no. 7 802-811

Lucenti A, Galimberti S, Barizzone N, Naldi P; PROGEMUS Group; PROGRESSO Group, Comi G, Martinelli Boneschi F, D’Alfonso S, Leone MA. Multiplesclerosis progression is not associated with birth timing in Italy. J Neurol Sci. 2014 Nov 15;346(1-2):194-6

International Multiple Sclerosis Genetics Consortium (IMSGC), Beecham AH, Patsopoulos NA, Xifara DK et al.Analysis of immune-related loci identifies 48 new susceptibility variants for multiple sclerosis. Nat Genet. 2013;45:1353-60

International Multiple Sclerosis Genetics Consortium. Network-based multiple sclerosis pathway analysis with GWAS data from 15,000 cases and 30,000controls. Am J Hum Genet. 2013 Jun 6;92(6):854-65

Barizzone N, Pauwels I, Luciano B, Franckaert D, Guerini FR, Cosemans L, Hilven K, Salviati A, Dooley J, Danso-Abeam D, di Sapio A, Cavalla P, De-callonne B, Mathieu C, Liston A, Leone M, Dubois B, D’Alfonso S*, Goris A*. (*equal contribution) No evidence for arole of rare CYP27B1 functional va-riations in multiple sclerosis. Ann Neurol. 2013;73:433-7

Barizzone N*,. Leone MA*, Esposito F, Lucenti A, Harbo HF, Goris A,. Kockum I, Oturai A,. Celius EG, Mero IL,. Dubois B, Olsson T, Søndergaard H,.Cusi D,. Lupoli S,. Guerini F, Galimberti D, Salvetti M,. Liberatore G, Martinelli V,. Naldi P, Myhr K,. Bergamaschi R, Comi G,. Martinelli Boneschi F*, D’Al-fonso S*. Association of genetic markers with the presence of cerebrospinal fluid oligoclonal bands in the Italian population European Committee forTreatment and Research in Multiple Sclerosis (ECTRIMS) Congress, Lione 2012 and Società Italiana di Neurologia, Rimini 2012

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Barizzone N*, Luciano B*,.Bagarotti A, Guerini FR, Salviati A., di Sapio A, Cavalla P, Leone M, D’Alfonso S. No functional CYP27B1 variants in ItalianMultiple Sclerosis patients. XV Congresso Nazionale SIGU, Sorrento, 21-24 Novembre 2012

Barizzone N* Leone MA.*, Esposito F, Lucenti A,. Harbo HF, Goris A, Kockum I, Bang Oturai A, Gulowsen E, Celius, I. Mero, B. Dubois, T. Olsson, H.Bach Søndergaard, D. Cusi, S. Lupoli, B. Kulle Andreassen, the International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, the Wellcome Trust Case ControlConsortium 2, K. Myhr F.R. Guerini, the PROGEMUS Group, the PROGRESSO Group, G. Comi, F. Martinelli- Boneschi*, S. D’Alfonso*. Association bet-ween genetic variants and a prognostic marker in Multiple Sclerosis. XV Congresso Nazionale SIGU, Sorrento, 21-24 Novembre 2012

D’Alfonso S and Martinelli Boneschi F, for the International Multiple Sclerosis Genetics Consortium (IMSGC) Deep replication and extensive fine mappingusing the Immunochip significantly expands the genetic architecture of multiple sclerosis XV Congresso Nazionale SIGU, Sorrento, 21-24 Novembre2012

Barizzone N, Sorosina M, Lupoli S, Porcu E, Sonna S, Loi A,. Pitzalis M, Esposito F, Leone M, Lucenti A,. Zoledwieska M, Mulas A, Cocco E, Guerini FR,Brambilla P, Farina, Poddie F, Martinelli V, ComiG. Rosati G,. Frau J, Melis M, the PROGEMUS Group, the PROGRESSO Group, G the IMSGC, M.G.Marrosu, D. Cusi, S. Sanna, F. Cucca, F. Martinelli Boneschi, D’Alfonso S. The combined effect of multiple sclerosis susceptibility variants in continentalItaly and Sardinia. XVI Congresso Nazionale SIGU, Roma, 25-28 Settembre 2013. (Premio SIGU “G.Pilia” migliore presentazione orale malattie com-plesse)

Anand S, Mangano E, Bordoni R, Barizzone N, Corrado L, Sorosina M, Santoro S, MartinelliBoneschi F *, D’Alfonso S*, De Bellis G *. A robust strategyfor the calculation of Allele Frequencies from NGS data of pooled DNA samples European Human Genetics Conference, Milano, 31 maggio -3 giugno2014

Barizzone N, Clarelli F, Sorosina M, Anand S, Mangano E, Bordoni R, Esposito F, PROGEMUS, PROGRESSO, IMSGC, Raymkulova O, Predebon G,Martinelli V, Comi G, Leone M, De Bellis G*, Martinelli-Boneschi F*, D’Alfonso S*. Target resequencing of regions associated with Multiple Sclerosis inthe Italian population. European Human Genetics Conference, Milano, 31 maggio -3 giugno 2014

Barizzone N, Anand S, Sorosina M,. Mangano E, Bordoni R,. Clarelli F, Esposito F, Raymkulova O, Minari N,. Predebon G, Martinelli V, Comi G,. LeoneM, De Bellis G*, Martinelli-Boneschi F*, D’Alfonso S*.Target resequencing of regions associated with Multiple Sclerosis in the Italian population. XLVCongresso Società Italiana di Neurologia, Cagliari, Fiera Internazionale della Sardegna, 11-14 Ottobre 2014 and ECTRIMS/ACTRIMS, Boston, 11-14September 2014

Barizzone N, Anand S, Mangano E, Sorosina M, Bordoni R, Clarelli F, Esposito F, Santoro S, PROGEMUS, PROGRESSO, IMSGC,. Raymkulova O, Pre-debon G, Martinelli V, Comi G, Leone M, De Bellis G *,. Martinelli-Boneschi F*, D’Alfonso S*. Target resequencing of regions associated with MultipleSclerosis in the Italian population. Il sequenziamento di nuova generazione in genetica umana e medica, Bologna, 30-31 Ottobre 2014

InvIted lectureshIps

Sandra D’Alfonso. Genetica delle malattie autoimmuni: similitudini e specificità “Sclerosi Multipla: oltre il giardino” Orbassano (TO), 17 febbraio 2012evento formativo ECM

Sandra D’Alfonso. La genetica delle malattie autoimmuni dopo i GWAS. XVI Congresso Nazionale SIGU, Roma, 25-28 Settembre 2013

Sandra D’Alfonso. The genetics of autoimmune diseases.9th International congress on autoimmunity. Nice, March 2014

Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2011 per il periodo di 2anni (prorogato di 6 mesi) e l’ammontaredi 150.000 €

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PREMESSE E oBiETTiViLa sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmunecausata dalla perdita di mielina dal sistema nervosocentrale creando gravi disabilità. Diversi studi hannoconfermato un’associazione tra il Polimorfismo aSingolo Nucleotide (SNP) nel gene del recettore perl’interleuchina 7 (IL7Rα), rs6897932 (C/T), e il rischiodi sviluppare la SM. L’IL7Rα è il gene per una pro-teina localizzata sulla superficie cellulare di diversecellule del sistema immunitario. Questa proteina,coinvolta nella trasmissione del segnale mediatodall’interleuchina 7 (IL7), ha un ruolo cruciale nelmantenimento dell’omeostasi del sistema immunita-rio. Lo SNP associato è localizzato nell’esone 6 delgene IL7Rα, esone che codifica per il dominio tran-smembrane della proteina. Questo SNP determinasia il cambio tra l’aminoacido treonina in posizione244 con l’aminoacido isoleucina, che un incrementodello splicing dell’esone 6 dando origine ad una for-ma di RNA piú corta che genera una forma solubiledel recettore (sIL7R).In base alle caratteristiche autoimmuni della SM el’importante ruolo dell’IL7R nella regolazione del si-stema immunitario, lo scopo del nostro studio èquello di verificare il ruolo funzionale dello SNP as-sociato alla SM nelle differenti subpopulazioni di lin-fociti T e confermare le osservazioni in linee cellularitransfettate in modo transiente.

RiSULTATiCampioni di plasma e siero, prelevati da persone conSM e controlli, sono stati analizzati per valutare i livellidi sIL7R. Grazie a questi campioni abbiamo confer-mato che i livelli della proteina solubile dipendonodal genotipo dello SNP associato. Infatti, personeomozigote per l’allele di rischio (CC) possiedono ele-vati livelli di sIL7R rispetto alle persone omozigoteper l’allele protettivo (TT) o eterozigote (CT). Queste

differenze sono risultate statisticamente significati-ve nel gruppo dei pazienti.Analisi in cellule CD4+ naïve, CD4+ memoria e CD8+naïve mostrano che lo SNP in IL7R può alterare latrasmissione del segnale mediato da IL7 in linfociti T.Infatti, abbiamo osservato differenti livelli di fosfori-lazione del fattore trascrizionale STAT5 (Signal Tran-

sducer and Activator of Transcription 5) tra i soggettiomozigoti per l’allele di rischio o per l’allele protettivo.In particolare, la fosforilazione di STAT5 sembra au-mentare in pazienti omozigoti CC rispetto ai controllicon lo stesso genotipo. Invece, i pazienti TT presen-tano ridotta fosforilazione di STAT5. Queste differen-ze possono dipendere dal cambio aminoacidico(Thr244Ile) nel dominio transmembrana di IL7R, o daidiversi livelli del recettore solubile presenti nel sanguedei pazienti e dei controlli. Per verificare queste ipo-tesi abbiamo transfettato in modo transiente la lineacellulare Human Embryonic Kidney 293 (HEK293)con IL7R e tutte le proteine coinvolte nella trasduzio-ne del segnale (Gamma Chain, STAT5, e Janus Kina-

se 3 (JAK3). Stimolando queste cellule con IL7abbiamo osservato che l’alterazione del segnale èindipendente dal genotipo. Infatti, abbiamo osserva-to simili livelli di fosforilazione di STAT5 in cellule cheesprimevano l’allele di rischio e quelle che esprime-vano l’allele protettivo. Al contrario, abbiamo notatoche la fosforilazione di STAT5 è alterata dalla presen-za di sIL7R nel terreno di coltura.

CoNCLUSioNiLe nostre analisi in persone con SM e controlli han-no mostrato che lo SNP rs6897932 associato ha uneffetto nella transduzione del segnale mediato daIL7 nei linfociti T. Infatti, abbiamo osservato differentilivelli di fosforilazione di STAT5 tra persone omozi-gote per l’allele di rischio e quelle omozigote per l’al-lele protettivo. Queste differenze possono dipendere

analisi molecolare dell’espressione allele specificadi Il-7Ralpha e il suo effetto sul segnale mediato da Il-7in cellule: mDc, cD4+ e cD8+ isolate da pazienti consclerosi multipla e controlli sani

COMPENDIO 2015

Laura BergamaschiDuke Molecular physiology Institute, Duke University Durham, Nc, USa

MENtoRE: Simon Gregory

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dal cambio aminacidico (Thr244Ile) nel dominio tran-smembrana della proteina o dall’aumentata produ-zione del recettore solubile (sIL7R) rispetto algenotipo. Le nostre analisi in linee cellulari transfet-tate transientemente suggeriscono che l’alterazionedel segnale mediata da IL7 e IL7R sia indipendentedal cambio aminoacidico. Al contrario, la trasmis-sione del segnale è alterata in presenza di sIL7R.Recentemente, è stato mostrato che l’inezione disIL7R in modelli sperimentali di SM (Encefalite Spe-rimentale Autoimmune, ESA) rendendo più grave ildecorso della malattia. In base ai nostri dati e ai datipresenti in letteratura, stiamo creando linee cellulari

che esprimono stabilmente IL7R in modo da valu-tare l’effetto del recettore solubile in diversi periodidi tempo e capire l’interazione con il recettore pre-sente in membrana. Inoltre, stiamo creando dei mo-delli murini per studiare in vivo il ruolo dello SNPdell’IL7R nello sviluppo di cellule del sistema immu-nitario e nel contesto ESA.Sebbene, l’associazione genetica dell’IL7R con laSM da sola non riesca a spiegare interamente la ge-netica della malattia, far chiarezza sui meccanismicon cui l’espressione allele specifica dell’IL7R possaalterare l’attività delle cellule del sistema immunitarioè importante per capire la patogenesi della SM.

iNTRoDUCTioN AND AiMSMultiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease thatis caused by myelin loss in the central nervous sys-tem and results in severe disability. Recent geneticsstudies have confirmed an association between anon-synonymous Single Nucleotide Polymorphism(SNP) in the interleukin 7 receptor alpha chain (IL7Rα)gene, rs6897932 (C/T), and the risk of developing MS.IL7Rα� encodes a transmembrane protein that is ex-pressed in several immune cell subpopulations. Sig-naling via the interleukin 7 (IL7) pathway plays acrucial role in the maintenance of immune systemhomeostasis. The associated SNP occurs within ex-on 6 of IL7Rα that encodes the transmembrane do-main of the receptor. The non-synonymous risk allelecauses a threonine to isoleucine (Thr244Ile) aminoacid change resulting other than a difference aminoacid sequence of the full-length protein also in in-creased skipping of exon 6 and elevated levels of theshort RNA isoform that translates to a soluble protein(sIL7R). Based on the autoimmune characteristics ofMS and the important role of IL7R in the immune sys-tem homeostasis, the aim of our study is to investi-gate the functional role of the associated SNP in MSpathogenesis in T cell subpopulations and transienttransfected cell line models.

RESULTSWe confirmed that the amount of soluble IL7R pro-tein present in plasma or serum of MS patients and

controls is depended on the genotype of the asso-ciated rs6897932 SNP. We observed that peoplehomozygous for the risk allele (CC) have higher lev-els of sIL7R in plasma or serum, compared to peo-ple homozygous for the protective allele (TT) orheterozygous (CT). These differences are statistical-ly significant in MS patients.Our analysis in CD4+ naïve, CD4+ memory, CD8+naïve primary cell culture isolated by MS patientsand controls showed that the associated rs6897932SNP might have an effect on the IL7/IL7R signalingin T lymphocytes. Indeed, we have observed differ-ent levels of phosphorylated Signal Transducer andActivator of Transcription 5 (STAT5) protein amongsubjects carrying the risk (C) or the protective (T) al-lele. Specifically, STAT5 phosphorylation seems tobe increased in MS patients carrying the risk allele(C) compared to the genotype matched healthycontrols. Conversely, MS patients carrying the pro-tective allele (T) seem to have lower levels of phos-phorylated STAT5 in both CD4+ and CD8+ naïve Tcells. These differences can be due to either theamino acid change (Thr244Ile) within the transmem-brane domain of the full-length IL7R, or the sIL7Rprotein level produced differentially based on thegenotype. To address these questions we havetransiently transfected the membrane bound IL7Rprotein along with all the IL7/IL7R signaling machin-ery (Gamma Chain, STAT5, and Janus Kinase 3(JAK3)) in Human Embryonic Kidney 293 (HEK293)

Molecular analysis of Il-7Ralpha allele specific expressionand Il7 signaling in mDcS, cD4+ and cD8+ t cells fromMS patients and controls


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cell line and evaluate the effect of the two alterna-tive alleles in the IL7/IL7R signaling. These datasuggest that the alteration in the IL7/IL7R signalingis independent of the amino acid change. Indeed,we have not observed differences in STAT5 phos-phorylation based on the IL7R expressed allele.Conversely, the IL7/IL7R signaling is affected in thepresence of sIL7R in the culture medium.

CoNCLUSioNSOur analysis in MS patients and controls showedthat the associated rs6897932 SNP has an effecton the IL7/IL7R signaling in T cells. Indeed, we haveobserved different levels of phosphorylated STAT5among subjects carrying the risk (C) or the protec-tive (T) allele. These differences can be due to eitherthe amino acid change (Thr244Ile) within the trans-membrane domain, or the sIL7R protein produceddifferentially based on the genotype. Our analysisin transiently transfected cell line suggests that the

alteration in the IL7/IL7R signaling is independentof the amino acid change. Conversely, the IL7/IL7Rsignaling is reduced in the presence of sIL7R. Re-cently, injection of human sIL7R protein has beenshown to exacerbate experimental autoimmune en-cephalomyelitis (EAE) in mice prolonging the effectof IL7. Based on our data and the one in the litera-ture, we are establishing stable cell lines to betterinvestigate the role of sIL7R in a time dependentmodel and its interaction with the IL7R complex. Weare also creating transgenic mouse models to studythe role of IL7R human alleles and sIL7R in immunecell development and in the context of EAE. Al-though, the genetic association of IL7R with MSdoes not account for all of the genetic contributionsto the disease, elucidating the mechanisms bywhich the allele specific expression of IL7R altersthe activity of different immune cell types will pro-vide very important data for understanding thepathology of MS.

COMPENDIO 2015


Gregory SG, Galarza-Muñoz G, Brigs FB, Bergamaschi L, Arvai S, Shao X, Barcelos LF, Garcia-Blanco MA. Functional characterization of a multiplesclerosis associated variant in IL7Ra. American Society of Human Genetics 64th Annual Meeting. October 18–2, 2014 San Diego, CA, USA

Bergamaschi L, Arvai S, Galarza Munoz G, Skeen M, Kondo M, Garcia-Blanco MA.and Gregory SG. Molecular analysis of IL-7Rα allele specific expressionand IL7 signaling in mDCS, CD4+ and CD8+ T cells from MS patients and controls.2014 Carolinas Multiple Sclerosis Researchers Forum, August 23,2014 Durham, NC, USA

Bergamaschi L, Arvai S, Galarza Munoz G, Skeen M, Kondo M, Garcia-Blanco MA and Gregory SG. Molecular analysis of IL-7Ralpha allele specific ex-pression and IL7 signaling in mDCs, CD4+ and CD8+ T cells from MS patients and controls- Annual Scientific Congress of the Italian MS Society andits Foundations, May 2014, Rome, Italy

Bergamaschi L, Arvai S, Skeen M, Kondo M, Gregory SG. Defining the T-cell effect of the MS associated SNP, rs6897932, on IL7/IL7Ra signaling.National Multiple Sclerosis Society, Carolina’s research Symposium, August 2013, Durham, NC, USA

Bergamaschi L, Beaver, Skeen M, Kondo M, Gregory SG. Molecular analysis of IL-7Ralpha allele specific expression and IL7 signaling in mDCs, CD4+and CD8+ T cells from MS patients and controls- Annual Scientific Congress of the Italian MS Society and its Foundations (May 2013), Rome, Italy

Bergamaschi L, Beaver J, Skeen M, Kondo M, Gregory SG. Defining the t-cell effect of the MS associated SNP, rs6897932, on IL7/IL7Rα signaling. 11thInternational Congress of Neuroimmunology Nov 4th-8th, 2012 Boston, MA, USA

Bergamaschi L, Beaver J, Skeen M, Kondo M, Gregory SG. Defining the T-cell effect of the MS associated SNP, rs6897932, on IL7/IL7Rα signaling. Na-tional Multiple Sclerosis Society, Carolina’s research Symposium, August 2012, Durham, NC, USA


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PREMESSE E oBiETTiViL’immunità innata rappresenta la prima linea di di-fesa verso le infezioni microbiche, e la sua stimola-zione protegge dalle infezioni virali. Risultati ottenutidi recente nel nostro laboratorio mostrano che, in al-cune persone con sclerosi multipla (SM), l’immunitàinnata conferisce una maggiore suscettibilità all’in-fezione virale. Lo studio di questo fenomeno ci haportato alla scoperta che questo difetto è associatoalla presenza sulle cellule Natural killer (NK) di unparticolare recettore, il KIR2DL2. Le cellule NK sonoimportanti per il controllo dell’infezione virale, e di-versi risultati pubblicati suggeriscono che un’altera-zione delle cellule NK possa portare allo sviluppo dipatologie autoimmuni. Ci proponiamo di studiareper quali motivi le cellule NK di persone con SMhanno queste risposte diverse contro le infezioni vi-rali e le conseguenze che queste disfunzioni posso-no avere sulla genesi dei meccanismi autoimmuni.

RiSULTATiIn questo progetto abbiamo valutato i meccanismimolecolari alla base dell’effetto del recettoreKIR2DL2 sull’attivazione delle cellule NK contro l’in-fezione virale in persone con SM e in controlli. Inparticolare, abbiamo analizzato l’effetto dell’espres-sione KIR in cellule NK e le vie che potrebbero es-sere implicate nella loro modulazione.Abbiamo osservato, per la prima volta, come l’in-

duzione dell’espressione di KIR2DL2 riduca l’attivitàcitotossica di cellule NK verso cellule bersaglioHLA-C1+ infettate da herpesvirus, e la secrezionedi molecole pro-infiammatorie (Interferone-gamma).Abbiamo identificato un sottogruppo di cellule chia-mate NK17, in grado di secernere Interleuchina-17,ma non Interferone-gamma, che non sono in gradodi attivarsi ed eliminare l’infezione da herpesvirus inpazienti con SM positivi per KIR2DL2. Questi risul-tati indicano che il sottogruppo di cellule NK17 èdannoso per il controllo virale. La valutazione di altrivirus erpetici (HHV-6 e EBV) ha dimostrato un effet-to simile di KIR2DL2 nella SM nei confronti dell’eli-minazione del virus.

CoNCLUSioNiRiportiamo, per la prima volta, la capacità dell’infe-zione da herpesvirus di indurre un sottoinsieme dicellule NK17 in persone con SM positive perKIR2DL2, suggerendo un possibile ruolo di questecellule NK nella maggiore suscettibilità alle infezionida herpesvirus. Questi dati suggeriscono un’ impli-cazione importante anche in altre malattie infettivee autoimmuni. La valutazione dei meccanismi allabase della minore risposta delle cellule NK17 control’infezione da herpesvirus potrebbe portare ad indi-viduare nuove strategie terapeutiche per il controllodella maggiore suscettibilità alle infezioni da herpe-svirus in un sottogruppo di persone con SM.

Studio delle alterazioni nelle risposte antiviralidell’immunità innata in pazienti con SM

Dario Di LucaDipartimento di Scienze Mediche, Università di Ferrara, Ferrara

collaboRatoRI:Antonella Rotola, Elisabetta Caselli, Roberta Rizzo, Valentina Gentili,Daria Bortolotti, iva Pivanti

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COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSInnate immunity is the first line of defense againstmicrobial infections, and its stimulation protectsagainst viral infections. Recent results obtained inour laboratory showed that in some patients withMS, innate immunity confers increased susceptibilityto herpesvirus infections. The study of this phenom-enon has led to the discovery that this defect is as-sociated with the expression of a particular receptor,KIR2DL2, on cells Natural killer (NK). NK cells are im-portant for virus infection control, and several resultshave been published suggesting an alteration of NKcells in autoimmune diseases. We plan to investigatethe reasons for which the NK cells of MS patientshave these different responses towards viruses andthe consequences that these dysfunctions can haveon the genesis of autoimmune mechanisms.

RESULTSIn this project we have evaluated the molecularmechanisms at the basis of KIR2DL2 effect on NKcell activation towards viral infection in MS patients.In particular, we have analyzed the effect of KIR ex-pression in NK cells and the pathways that couldbe implicated in their modulation. We observed, for

the first time, the induction of KIR2DL2 expressionthat reduced the cytotoxic activity of NK cells to-wards HLA-C1+ target cells infected by herpesvirusand the secretion of pro-inflammatory molecules(Interferon-gamma). We have identified a subset ofNK17 cells, able to secrete Interleukin-17 but notInterferon-gamma and presenting no activation andherpesvirus infection clearance in KIR2DL2 positiveMS patients. These results indicate NK17 subset asdetrimental for viral control. The evaluation of otherherpesviruses (HHV-6 and EBV) supported a similareffect of KIR2DL2 in MS towards virus clearance.

CoNCLUSioNSWe report, for the first time, the ability of herpesvirusinfection to induce a NK17 cell subset in KIR2DL2positive MS patients, suggesting a role for these NKcells in the increased susceptibility to herpesvirusinfection. These data suggest an important implica-tion also in other infective and autoimmune dis-eases. The evaluation of the mechanistic basis ofthe lower responsiveness of NK17 cells to her-pesvirus infection could identify new therapeuticstrategies in counteracting herpesvirus susceptiblein a subset of MS patients.

Study of altered antiviral innate immunity responsesin MS patients


Ben Fredj N, Rizzo R, Bortolotti D, Nefzi F, Chebel S, Rotola A, Frih-Ayed M, Di Luca D, Aouni M. Evaluation of the implication of KIR2DL2 receptor inmultiple sclerosis and herpesvirus susceptibility. Journal Of Neuroimmunology, 2014, 271 (1-2), p.30-5.

Bortolotti D, Rotola A, Di Luca D, Rizzo R. KIR2DL2 overexpression influences NK cell response to CpG. Frontiers In Immunology, 2013, p.538, ISSN:1664-3224

Rizzo R, Gentili V, Casetta I, Caselli E, De Gennaro R, Granieri E, Cassai E., Di Luca D., Rotola A. KIR2DL2 expression alters natural killer cells responseto herpesvirus infection in multiple sclerosis patients. Journal of Neuroimmunology, 2012, 253, p. 38-39

Rizzo R, Bortolotti D, Granieri E, Groppo E, Rotola A, Di Luca D. KIR expression influences NK cell response to herpesvirus infection in MS patients. 2ndEuropean Seminar in Virology (EuSeV), Bertinoro (BO, Italy) 13-15 June 2014

Rizzo R, Rotola A, Bortolotti D, Gentili V, Granieri E, Cassai E, Di Luca D. Herpesvirus infection modifies NK17 subset in Multiple Sclerosis patients. “9°Forum SIVIM”, Pisa (Italy), 09-10 December 2013

Rizzo R. Assetto genico delle cellule NK e suscettibilità alle infezioni virali. SIVIM Milano, 5-7 Maggio 2010


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PREMESSE E oBiETTiViL’encefalite sperimentale autoimmune (ESA) è ilmodello di sclerosi multipla (SM) più comunementeusato, è mediato dalle cellule T CD4+ e condividemolte caratteristiche cliniche e istologiche con lapatologia umana. L’ESA è indotta dalle cellule T hel-per (Th) autoreattive che sono in grado di promuo-vere infiammazione e demielinizzazione del sistemanervoso centrale. Le cellule maggiormente respon-sabili del danno alla mielina sono le cellule T auto-reattive Th1 (che producono IFN-ɣ) e Th17 (cheproducono IL-17). Tuttavia, noi e altri gruppi abbia-mo dimostrato che diversi componenti della rispo-sta Th2, classicamente associata alla rispostaallergica, potrebbero essere implicati nello sviluppodell’ESA. I basofili, i granulociti circolanti meno rap-presentati (meno dell’1% dei leucociti), sono cellulecoinvolte nella risposta allergica storicamente igno-rate sia per la loro scarsa numerosità, sia per le so-miglianze con i mastociti. Recentemente, moltigruppi hanno studiato il ruolo dei basofili nelle al-lergie, dimostrando il ruolo di queste cellule comemediatori, regolatori ed effettori dell’infiammazionedi tipo 2. Recentemente i basofili sono stati collegatianche a patologie autoimmuni, come il lupus siste-mico eritematoso (LES), mettendo in luce nuovipossibili ruoli di queste cellule. Lo scopo di questolavoro è quello di studiare il ruolo dei basofili nel-l’ESA.

RiSULTATiAbbiamo caratterizzato la popolazione dei basofiliin topi naïve e in topi con ESA, analizzando la lorofrequenza nel sangue periferico, organi linfoidi e nelsistema nervoso centrale. I basofili sono stati definiticome cellule CD3-, CD45/B220-, Cd11b-,Ly6G/Ly6C-, Ly76-, CD49b+, CD200R3+,FcεR1α+, IgE+. Per meglio studiare il ruolo dei ba-

sofili nell’ESA, abbiamo utilizzato un anticorpo mo-noclonale, anti-FcεRIα (MAR-1) che ci ha permessodi ottenere una completa e duratura eliminazione(28 giorni) dei basofili. Il trattamento con MAR-1 nonha influito sulla frequenza degli altri leucociti, fattaeccezione per un leggera modulazione delle celluledendritiche e delle cellule natural killer. I topi trattaticon MAR-1 e i controlli sono stati immunizzati conl’antigene mielinico MOG35-55 per indurre un mo-dello cronico di ESA. Il trattamento con l’anticorpoanti-FcεRIα ha portato ad una ESA più grave, spe-cialmente durante la fase cronica della malattia.L’analisi della risposta immune alla MOG ha eviden-ziato un aumento di proliferazione e di produzionedi citochine pro-infiammatorie (IFN-γ, IL-17, IL-6)nei topi trattati con MAR-1 rispetto ai controlli. Que-sti risultati sono stati osservati durante l’esordio ela fase acuta della malattia ma non nella fase croni-ca, quando i livelli di basofili circolanti erano revertitia valori normali. L’analisi istopatologica del sistemanervoso centrale ha confermato le evidenze speri-mentali evidenziando un aumento del numero deifoci infiammatori dei topi trattati con MAR-1 rispettoai controlli.

CoNCLUSioNiQuesti dati suggeriscono che i basofili sono celluleimportanti nella patogenesi del modello sperimen-tale di SM, in particolare il trattamento con l’anti-corpo anti-FcɛRIα che elimina queste celluledall’organismo, determina l’aumento delle risposteinfiammatorie di tipo Th1 e Th17 contro gli antigenimielinici e peggiora la malattia nel modello ESA.Recentemente è stato creato un nuovo modello ditopi senza basofili (Mcpt8DTR) che utilizzeremo inuno studio futuro per confermare i nostri dati. Perottenere un riscontro dei nostri risultati sulla SMumana, in collaborazione con la Dott.ssa Giovanna

Il ruolo dei basofili nella encefalite autoimmune sperimentale,un modello animale di sclerosi multipla

Silvia MusioNeuroimmunologia e Malattie Neuromuscolari, Fondazione IRccS Istituto Neurologico“c. besta”, Milano

MENtoRE: Rosetta Pedotti

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Borsellino (Ospedale Santa Lucia, Roma) abbiamocaratterizzato i basofili nel sangue di persone conSM e di controlli sani tramite analisi di citofluorime-tria. Inoltre, abbiamo analizzato lo stato di attivazio-

ne dei basofili nel sangue periferico umano (personecon SM e controlli) avvalendoci di due specifici mar-catori di attivazione (CD203c e CD63). L’analisi diquesti dati è attualmente in corso.

COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSExperimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)is a CD4+ T cell–driven autoimmune disease thatshares clinical and histological similarities with MS,thus modeling in mice the human disease. EAE isinduced by autoreactive T helper (Th) cells that me-diate tissue inflammation and demyelination in theCNS. Autoreactive Th1 cells (IFN-ɣ producing) andTh17 cells (interleukin-17 producing) against myelinantigens have been implicated in the induction ofthis disease. However, we and other have shownthat several components of Th2 response classical-ly associated with allergic diseases might play a rolein EAE. Basophils, the least abundant granulocytepopulation (less than 1% of leukocytes), are cellsinvolved in allergy that have been historically neg-lected because of this minority status and a pheno-type that is similar to mast cells. In recent years,many groups have been investigating the role ofthese cells in immunology and allergy, providing ev-idence for a role of these cells as initiators, regula-tors and effectors of type 2 inflammation. Recently,basophils have been correlated in pathologies withan autoimmune component, such as systemic lu-pus erythematous (SLE), opening the field to newinvestigations. The aim of this work was to investi-gate a possible role for basophils in EAE.

RESULTSWe characterized basophils population in naïve andEAE mice by studying their frequency in circulatingblood, primary lymphoid organs and central nervoussystem (CNS). Basophils were defined as CD3-,CD45/B220-, Cd11b-, Ly6G/Ly6C-, Ly76-, CD49b+,CD200R3+, FcεR1α+, IgE+ cells. We set up a pro-tocol to deplete basophils using anti-FcεRIα anti-body (MAR-1), a newly established monoclonalantibody that greatly helped the research on thesecells, injected twice/day for three days. Treatment

resulted in a long lasting depletion of basophils (28days). MAR-1 treatment did not affect the frequencyof other leukocytes, except for a slight non-signifi-cant modulation of dendritic cells and natural killercells. MAR-1 treated mice and controls were immu-nized with MOG35-55 to induce a chronic model ofEAE. Anti-FcεRIα antibody treatment resulted in ex-acerbated EAE, especially during the chronic phase.To evaluate the immune response against myelinantigen we analyzed antigen-induced T cell prolifer-ation and cytokine production in LNCs. MAR-1treated mice proliferate more than controls. More-over, pro-inflammatory cytokines (IFN-γ, IL-17, IL-6)production was increased in MAR-1 treated mice.These results were observed during onset and acuteEAE, but not at later stages of disease (chronicphase) when circulating basophils count was backto normal values. Neuropathological analysis of theCNS revealed an increased number of inflammatoryfoci in MAR-1 treated mice versus control.

CoNCLUSioNSThese data suggest that anti-FcɛRIα treatment in-duces increased Th1 and Th17 responses againstmyelin antigen and worsens EAE severity. Becausea new animal model of systemic basophils deficien-cy has been established (Mcpt8DTR), this model willbe used in a future study to confirm our results.Last, in parallel with the experimental model, toevaluate the possible relevance of these findings inhuman MS, in collaboration with Dr. GiovannaBorsellino (Santa Lucia hospital, Rome) we charac-terized basophils in peripheral blood of healthy sub-jects and MS patients by flow cytometry analysis.Moreover, to evaluate the activation state of ba-sophils in MS patients we stimulated these cellsfrom MS patients and controls and checked for ac-tivation markers CD203c and CD63. We arepresently analyzing the results.

the role of basophils in experimental autoimmuneencephalomyelitis, a mouse model for multiple sclerosis

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Costanza M, Musio S, Abou-Hamdan M, Binart N, Pedotti R. Prolactin is not required for the development of severe chronic experimental autoimmuneencephalomyelitis. J Immunol, 2013

Bosticardo M, Musio S, Fontana E, Angiari S, Draghici E, Constantin G, Poliani PL, Pedotti R, Villa A Development of central nervous system autoimmunityis impaired in the absence of Wiskott-Aldrich syndrome protein. PlosOne 2014

Musio S, The role of basophils in EAE. XXIII AINI Congress, 1-4 October 2014, Sorrento

Musio S, The role of basophils in EAE Congresso Scientifico Annuale FISM, 28-29 Maggio, 2014, Roma

Musio S, The role of basophils in EAE. Congresso Scientifico Annuale FISM, 29-30 Maggio, 2013, Roma

Musio S, The role of basophils in EAE. XXII AINI Congress, 22 August 2013, MiCo Milano Congressi

Borsa di studio finanziata con il Bando 2011 (prorogata di sei mesi) per il periodo di 2 anni e l’ammontare di 52.000 €

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PREMESSE E oBiETTiViL’identità delle proteine antigeniche che indirizzanol’attacco autoimmune della sclerosi multipla (SM)nel sistema nervoso centrale (SNC) è una delle que-stioni irrisolte di questa malattia. Sebbene molti an-tigeni studiati siano proteine della guaina mielinica,è stato proposto che le cellule T nella SM possonoriconoscere antigeni neuronali, e quindi contribuireal processo neurodegenerativo che caratterizza lafase progressiva della SM.Il mio laboratorio ospitante ha descritto, in un mo-dello animale di SM, l’encefalomielite autoimmunesperimentale (ESA), un clone T che riconosce con-temporaneamente un antigene mielinico e uno neu-ronale, la glicoproteina oligodendrocitica dellamielina (MOG) e il neurofilamento medio (NFM), conun conseguente aumento della gravità della malat-tia rispetto a modelli in cui l’attacco è diretto controun solo antigene. Cellule T che rispondono a più an-tigeni del self contemporaneamente, sono state iso-late anche nella tiroidite autoimmune e in modellianimali di diabete, dove inducono una malattia piùgrave che le cellule T specifiche per un solo antige-ne. Le cellule T bispecifiche si ritrovano quindi in di-versi contesti di autoimmunità dove contribuisconoalla patologia.Gli obiettivi del mio progetto sono stati di indagarel’origine delle cellule T bispecifiche e il loro contributoalla malattia nel modello animale più usato di SM, laESA indotta con MOG35-55 in topi C57BL-6.

RiSULTATiAbbiamo riportato che tra le cellule T dei topiC57Bl/6 esistono diversi cloni indipendenti che ri-conoscono MOG35-55 e NFM15-35. Durante il pri-mo anno abbiamo indagato le origini strutturali ditale bi-specificità. Abbiamo trovato che tra il 25%e il 60% delle cellule T specifiche di MOG35-55 rea-

giscono anche contro NFM15-35. Mutando siste-maticamente gli aminoacidi del peptide NFM15-35,abbiamo mostrato che le cellule T bispecifiche ri-conoscono aminoacidi identici in MOG e NFM, se-condo un meccanismo di mimetismo tra i dueantigeni. Abbiamo poi indagato il perchè la presen-za di MOG e NFM non renda le cellule T bi-specifi-che tolleranti, un processo che avviene per leproteine del self e permette di evitare una rispostaautoimmunitaria, ma che appare difettoso nella SM.La MOG è espressa nel timo, l’organo dove le cel-lule T in via di sviluppo sono rese tolleranti. Ripor-tiamo qui che anche NFM è espressa nel timo,precisamente in una popolazione di cellule epitelialiimportante per il processo di tollerizzazione. Per ca-pire se l’espressione dei due antigeni nel timo de-termini una risposta diminuita contro gli stessiantigeni, abbiamo immunizzato topi in cui l’espres-sione di MOG, NFM o entrambe è stata eliminata.Abbiamo osservato un effetto dell’espressione diMOG, ma non di NFM, sull’induzione di tolleranza:in assenza di MOG la produzione di molecole in-fiammatorie associate alla SM è risultata aumenta-ta. Al momento non siamo riusciti a spiegare perchèNFM, benchè espressa nel timo, non tollerizzi le cel-lule bi-specifiche. L’ipotesi che stiamo indagandoè che NFM sia espressa nel timo ma non stabilmen-te presentata alle cellule T in via di sviluppo.Durante il secondo anno, ci siamo interessati alcontributo delle cellule bispecifiche alla gravità dellamalattia nell’ESA indotta con MOG35-55.Abbiamo osservato che l’ESA è meno grave in as-senza di NFM, in particolare durante la fase cronicadella malattia. Il dato che la frequenza delle celluleT bispecifiche che infiltrano il SNC aumenta duranteil corso della malattia suggerisce che tale differenzasia dovuta all’assenza di NFM15-35 in quanto ber-saglio dell’attacco autoimmune. In topi che non

linfociti t che co-riconoscono antigeni mielinici e neuronali:tolleranza immunologica e contributo relativoall’autoimmunità del sistema nervoso centrale

COMPENDIO 2015

Liliana Elisa Luccacenter of physiopathology of toulouse-purpan, Inserm U1043, University Hospital purpan,toulouse France

MENtoRE: Roland Liblau

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esprimono NFM, invece, l’accumulo di cellule T bi-specifiche non avviene, a indicare che tali cellulesono attirate dal rilascio di NFM a seguito della di-struzione assonale. Infine, per dimostrare che la ri-sposta diretta contro NFM15-35 è patogenica,abbiamo eliminato le cellule T specifiche perNFM15-35 durante il corso della malattia. In topitrattati all’inizio della fase cronica della malattia ab-biamo osservato un recupero quasi completo.Questi risultati suggeriscono che nella ESA indottacon MOG35-55 la transizione verso la fase cronicadipende dalla presenza di cellule T bispecifiche, chericonoscono NFM15-35 rilasciato durante la distru-zione neuronale.

CoNCLUSioNiIn conclusione, i nostri risultati mettono in evidenzail fatto che una risposta diretta contro due antigenidel SNC aggrava l’autoimmunità. Nella SM, le tera-pie a disposizione reprimono le cellule T indipen-dentemente dalla specificità, esponendo quindi lepersone con SM a un rischio di infezioni e tumori.La difficoltà nel comprendere la specificita antige-nica della SM è data dal fatto che essa varia nel cor-so della malattia e tra individui. Il nostro lavoromostra che in uno stesso individuo l’attacco au-toimmune può essere diretto contro più antigenicontemporaneamente. Inoltre, abbiamo mostratol’importanza di un antigene neuronale per la croni-cità della malattia: questa osservazione potrebbeessere utile per una migliore comprensione della fa-se neurodegenerativa della SM.

iNTRoDUCTioN AND AiMSA key question concerning multiple sclerosis (MS)pathogenesis is which antigenic proteins of the cen-tral nervous system (CNS) are targeted. While manyof the antigens proposed as targets of pathogenicT cells are from the myelin sheath, it has beenrecognised that these T cells can also be directedagainst neurons, possibly contributing to the neu-rodegenerative process that accompanies the sec-ondary progressive phase of the disease.Using an animal model of MS, Experimental Autoim-mune Encephalomyelitis (EAE), my host team discov-ered that a T-cell clone targets simultaneously amyelin and a neuronal antigen, Myelin Oligodendro-cyte Glycoprotein (MOG) and neurofilament medium(NFM), resulting in increased disease severity. Inter-estingly, T cells that respond to different self-antigenshave also been isolated in autoimmune thyroiditisand in animal models of diabetes, where they drive amore severe disease than T cells with a single speci-ficity. These observations indicate that bispecific T-cells are implicated in autoimmunity where they coulddetermine disease severity. I joined the team with thegoals of exploring the origin and contribution to dis-ease of bispecific T cells in the world-wide used EAEmodel induced with MOG35-55 in C57BL-6 mice.

RESULTSWe reported that the T cell compartment of C57Bl/6mice contains distinct T cell clones that co-recog-nize MOG35-55 and NFM15-35. During the firstyear, we explored the structural origin of such bis-pecificity. We established the frequency of bispecificT cells and found that 25 to 60% of all MOG35-55-specific CD4 T cells also recognize NFM15-35. Bymutating systematically the aminoacids of the NFMpeptide, we showed that bi-specific T cells requirethe presence of aminoacids that are identical be-tween MOG and NFM, resulting in the two antigensmimicking each other. Next, we investigated why bi-specific T cells are not rendered tolerant to the pres-ence of MOG and NF-M, a mechanism that happensfor self-proteins but is malfunctioning in MS. MOGis expression in the thymus, the organ where devel-oping T cells are made tolerant. We report that NFMis also expressed in the thymus, specifically by asubset of thymic epithelial cells crucial for inductionof tolerance. In order to assess whether presence ofthe two antigens in the thymus allows for control ofthe T cell responses directed against these, we im-munized mice lacking expression of MOG and NFMor control mice with MOG35-55. Interestingly, wecould detect an impact of the expression of MOG,

Myelin reactive t-cells that co-recognise a neuronal antigen:immune tolerance and relative contribution to central nervoussystem autoimmunity


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but not NFM, on immune tolerance. Indeed, in theabsence of MOG expression we observed an en-hanced production of inflammatory molecules asso-ciated with CNS autoimmunity by bi-specific cells.To date, we haven’t been able to elucidate why ex-pression of NFM, instead, doesn’t result in toleriza-tion of bi-specific T cells. Whether NFM is expressedin the thymus but not stably presented to developingbi-specific T cells is currently being investigated bymy host lab.During the second year, we assessed whether tar-geting NFM15-35 contributes to pathogenicity inMOG35-55-induced EAE. We observed that micelacking NF-M in the CNS develop a milder EAE,specifically in the chronic phase. To establish if re-duced severity was due to the absence of NFM15-35 as a target antigen, we analyzed the recruitmentof bi-specific T cells to the inflamed CNS. Indeed,we observed a striking increase in the frequency ofbispecific T cell clones. Of note, we didn’t report thesame enrichment of bispecific T cells in the CNS ofmice lacking the expression of NF-M, suggestingthat these cells persist in the CNS following releaseof NFM due to neuronal damage. Finally, to provethat recognition of NFM15-35 in EAE is pathogenic,we eliminated T cells specific for NFM15-35 during

the course of the disease. Strikingly, when the treat-ment was applied to mice entering the chronicphase of EAE, we observed a prompt recovery. Ourresults suggest thus that in MOG35-55-inducedEAE, the transition towards disease chronicity relieson the presence of bispecific T cells, which recog-nize NFM15-35 released during tissue damage.

CoNCLUSioNSIn conclusion, our results underline that simultane-ous targeting of two CNS antigens can worsen au-toimmunity. In MS, existing therapies target T cellsregardless of their specificity, thus dampening alsoprotective immune responses and exposing peoplewith MS to infections and cancer. The difficulty inunderstanding antigen specificity of MS relies on thefact that these antigens may vary between individu-als and over time. Our work shows that multiple anti-gens can be target simultaneously even in a givenperson. Moreover, we point out the importance ofneuronal antigens during the chronic phase of EAE:this observation could hold relevance to the stillpoorly understood neurodegenerative phase of MS.Altogether, better understanding antigen-specificityof MS could lead to tailored therapies able to targetonly the T cells involved in the disease.

COMPENDIO 2015


Lucca LE, Desbois S, Ramadan A, Ben-Nun A, Eisenstein M, Carrié N, Guéry JC, Sette A, Nguyen P, Geiger TL, Mars LT, Liblau RS. Bispecificity formyelin and neuronal self-antigens is a common feature of CD4 T cells in C57BL/6 mice. J Immunol2014, 193(7):3267-77

Ramadan A, Lucca L, Carrié N, Desbois-Beaumel S, Liblau RS, Mars LT. In situ expansion of polyspecific T cells that recognize distinct self-antigensdrives the progression of organ-specific autoimmunity. Manuscript in preparation

Lucca LE. Autoreactive T cells specific for both a myelin and a neuronal antigen contribute to EAE 15th International Congress of Immunology, MilanAugust 24th 2013, selected oral communication


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PREMESSE E oBiETTiViLa sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmu-ne causata dalle cellule del sistema immunitario cheattaccano la mielina, il rivestimento dei neuroni, pro-vocando così danni a carico di vari distretti del si-stema nervoso centrale (cervello e midollo spinale).Negli ultimi 20-30 anni abbiamo assistito ad undrammatico aumento dell’insorgenza di malattie au-toimmune come la SM e la comunità scientifica èconcorde nel ritenere che alcuni fattori ambientaliche sono notevolmente cambiati negli ultimi decen-ni come la dieta e la maggiore igiene ambientalepossano giocare un ruolo essenziale in questo fe-nomeno. Fino ad oggi non è stato però chiaro ilmeccanismo attraverso il quale tali fattori ambientalifavoriscono l’insorgenza della SM. Negli ultimi annigli immunologi hanno fatto una scoperta importan-te: che la flora intestinale regola il funzionamentodel nostro sistema immunitario non solo a livello in-testinale ma anche in altre parti del nostro organi-smo. Da qui l’ipotesi che fattori ambientali cheagiscono a livello intestinale possano aumentare ilrischio di sviluppare SM attivando il sistema immu-nitario e, in particolare, le cellule immunitarie re-sponsabili dell’attacco al sistema nervoso centrale(SNC). A supporto di tale ipotesi uno studio pubbli-cato nel 2011 sulla prestigiosa rivista scientifica Na-

ture ha dimostrato che la flora batterica intestinalepuò indurre l’Encefalite Allergica Sperimentale (ilmodello sperimentale della SM) attivando il sistema

immunitario. Lo scopo del nostro studio è statoquello di verificare se anche in individui con SM re-cidivante remittente (SMRR) è possibile identificarevariazioni e attivazione dell’immunità a livello inte-stinale come conseguenza di variazioni di fattoriambientali che agiscono a livello intestinale modifi-cando la flora (dieta, igiene ambientale, etc). A que-sto scopo abbiamo raccolto campioni di tessutointestinale di pazienti che si sottoponevano ad unaesofagogastroduodenoscopia per motivi diagnosti-ci (reflusso gastroesofageo, sospetto clinico di ce-liachia o altro) e da questi tessuti abbiamo estrattoed analizzato le cellule del sistema immunitario.

RiSULTATiNel nostro progetto originale avevamo proposto distudiare campioni tissutali e di sangue periferico di10-20 persone con SM-RR e controlli sani. Ad oggiabbiamo analizzato le percentuali relative di diversesottopopolazioni linfocitarie in campioni tissutali in-testinali e di sangue periferico di 23 pazienti affettida SM e controlli sani. La nostra analisi ha eviden-ziato che nelle persone con SM c’è uno squilibriotra la percentuale di linfociti Th17 effettori (che sonoresponsabili del danno al SNC) e linfociti FoxP3+ Tregolatori (la cui funzione è quella di “spegnere”l’immunità). Altri linfociti T come i Th1, le cellule re-golatorie Tr1 e Th2 sono invece risultati normali nel-le persone con SM. I nostri risultati preliminarihanno anche dimostrato che alcuni farmaci immu-

Ruolo dei meccanismi immunoregolatori intestinalinella patogenesi della sclerosi multipla

Marika FalconeDipartimento di Immunologia, trapianti e Malattie Infettive, IRcSS Istituto ScientificoSan Raffaele, Milano

collaboRatoRI:Chiara Sorini, ilaria Cosorich

collaboRazIoNI coN altRI GRUppI:Filippo Canducci, IRcSS Istituto Scientifico San Raffaele, MilanoAlberto Mariani, Pieralberto Testoni,Unità di Gastroenterologia, ospedale San Raffaele, MilanoKenya Honda, RIKEN center for Integrative Medical Sciences, Yokohama, Japan

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no-modulatori che sono efficaci nella prevenzionedelle ricadute SM, come il copolimero e l’interferon-beta, agiscono modulando l’immunità intestinale ri-pristinando un normale rapporto tra linfociti Th17effettori e linfociti FoxP3+T regolatori.

CoNCLUSioNiLa conclusione del nostro studio è che nelle perso-ne con SM-RR vi è un’alterazione dell’immunità alivello intestinale che potrebbe avere un effetto di-retto sulla regolazione dell’autoimmunità e quindidel danno infiammatorio a livello del SNC. Il nostro

prossimo obiettivo è quello di verificare se tali va-riazioni dell’immunità intestinale siano imputabili adalterazioni della flora batterica intestinale e ad abi-tudini dietetiche che possono avere un impatto cru-ciale nella composizione della flora intestinale (dietacon un alto apporto di grassi animali e basso ap-porto di fibre). Il fine ultimo del nostro studio saràquello di evidenziare fattori ambientali, ed in parti-colare specifiche abitudini alimentari, che possanoinfluire negativamente sul rischio di sviluppare rica-dute di SM modificando la flora e l’immunità inte-stinale.

COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSMultiple sclerosis (MS) is an autoimmune diseasecaused by immune cells that attack and destroy themyelin sheath thus damaging neurons of the CentralNervous System (brain and spinal cord). In the past20-30 years western countries experienced a dra-matic raise in the incidence of autoimmune diseaseslike MS and there is general agreement that environ-mental factors that changed in the past decadessuch as diet and hygiene standards may haveplayed a crucial role in increasing the incidence ofMS. However, the mechanisms through which thoseenvironmental factors impinge on MS pathogenesisare still largely unknown. Recently, it was discoveredthat environmental factors acting at the intestinallevel such as diet and microbiota modifications havea high impact on the immune system both at the in-testinal and systemic level. This finding raised thehypothesis that those environmental factors may af-fect MS by altering gut immunity and activating Tcells responsible for the immune attack to the CNS.In support to that hypothesis, a research study pub-lished in 2011 in Nature demonstrated that modifi-cations of the intestinal microbiota induced EAE, theexperimental model of MS, by altering gut immunity.Our goal was to assess whether in humans affectedby RR-MS there are alterations of gut immunity thatcould be linked to environmental factors acting atthe intestinal level by modifying the microbiota suchas dietary habits and hygiene standards. To this aimwe analyzed gut immune cells in intestinal mucosa

samples (and peripheral blood for comparison) ofRR-MS patients undergoing EGDS for diagnosticpurposes (gastroesophageal reflux, clinical symp-toms of celiac disease, etc).

RESULTSIn our proposal we planned to analyzed intestinalmucosal samples and blood samples of 10-20 RR-MS and healthy controls. In the one-year period ofthis pilot research grant we analyzed samples from23 RR-MS patients and healthy controls. Our pre-liminary data indicate that in MS patients there is analteration of the ratio between Th17 effector T cells(responsible for the immune attack to the myelinsheath) and FoxP3+ T regulatory cells (whose func-tion is to suppress T cell immunity and autoimmu-nity). Other T cell subsets such as Th1 cells, Th2cells and regulatory Tr1 cells were not altered in MSpatients compared to healthy controls. Our prelim-inary results also showed that some immune mod-ulatory drugs that are effective in preventing MSrelapses such as copolymer-1 and interferon betaare capable to affect gut immunity and restore anormal effector/regulatory T cell balance in the in-testinal mucosa.

CoNCLUSioNSOur conclusion is that MS patients carry an alter-ation of gut immune cells that affects autoimmunityat the systemic level and worsen inflammation with-in the CNS. Our next objective is to verify whether

Gut immune regulation in multiple sclerosis patients

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those alterations of gut immunity in MS patients aredue to modifications of the intestinal microbiota andto a dietary regimen that affects microbiota compo-sition (high fat/low fibers diet). Our ultimate goal will

be to identify environmental factors and, specifical-ly, dietary habits that can negatively affect thepathogenesis of MS by altering microbiota compo-sition and gut immunity.



Sorini C, Dolpady J, Usuelli V, MessinaMJ, SaitaD, Canducci F, Mariani A, HondaK, Martinelli V, Falcone M.Gut immune regulation in multiple sclerosis patients. Congresso Annuale FISM- Roma 29 Maggio, 2014

Messina MJ, Falcone M, Mariani A, Rodegher M, Moiola L, Comi G, Martinelli V.The role of gut immunity in Multiple Sclerosis patients. Congresso della Società Italiana di Neurologia, Cagliari, 24 Aprile, 2014


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PREMESSE E oBiETTiViL’enzima A20, codificato dal gene TNFAIP3, è unamolecola chiave nel controllo dell’infiammazione edell’autoimmunità. In modelli sperimentali è statodimostrato che l’espressione dell’enzima è neces-saria per prevenire l’infiammazione cronica e lo svi-luppo di patologie autoimmuni, mentre nell’uomovarianti polimorfiche a singolo nucleotide nella re-gione del gene TNFAIP3 sono state associate adun maggior rischio di sviluppare diverse malattieautoimmuni, tra cui la sclerosi multipla (SM). Inoltre,il nostro gruppo di ricerca ha osservato che, rispet-to ai controlli, i pazienti con SM mostrano nel san-gue periferico una minore espressione di ungruppo di molecole ad azione anti-infiammatoriatra cui TNFAIP3, suggerendo che la SM sia scate-nata da un difetto nel controllo negativo dell’infiam-mazione.Su queste basi, ci siamo proposti di caratterizzarele popolazioni cellulari responsabili del deficit diespressione di TNFAIP3 e di ricercarne le possibilecause, focalizzandoci sui fattori epigenetici.Infine, poiché numerosi studi epidemiologici descri-vono una maggiore suscettibilità allo sviluppo dimalattie autoimmuni da parte dei pazienti che nesono già affetti, ed in particolare è stata osservatauna maggiore incidenza di tiroidite autoimmune diHashimoto tra i pazienti con SM rispetto alla popo-lazione generale, abbiamo deciso di confrontare illivello di espressione di TNFAIP3 in pazienti conSM, con tiroidite autoimmune e con entrambe lepatologie, oltre che in pazienti con SM a diverso de-corso clinico.

RiSULTATiPer indagare le funzioni di TNFAIP3, abbiamo deci-so di identificare le popolazioni cellulari del sangueperiferico che hanno un ruolo preponderante neldeficit di espressione osservato nei pazienti con

SM. A tal proposito abbiamo confrontato i livelli diTNFAIP3 in monociti e linfociti T CD4+ ottenuti da24 pazienti con SM e 18 controlli sani. Dai risultatiè emerso che l’espressione del gene è più bassanei monociti dei pazienti rispetto a quelli dei con-trolli, mentre nei linfociti la differenza di espressionenon raggiunge risultati significativi.Inoltre, per approfondire i meccanismi biomolecolarialla base della deregolazione di TNFAIP3, abbiamodeciso di valutare la variabilità epigenetica globaledi pazienti e controlli. Abbiamo quindi sequenziatopiccoli RNA contenuti nelle microvescicole isolatedal plasma di sei pazienti con SM e sei controlli sa-ni, identificando in questo modo 15 piccoli RNA noncodificanti (ncRNA) differentemente espressi neidue gruppi, di cui 9 sotto-espressi e 6 sovra-espressi nei pazienti. Sulla base della letteratura lamaggior parte di questi sembra avere un ruolo in di-versi tipi di tumori, alcuni sono coinvolti nella ma-lattia di Alzheimer e Parkinson, mentre nessuno èstato ancora descritto nella SM. L’analisi computa-zionale per individuare i possibili geni bersaglio deitrascritti identificati è ancora in corso.Infine, abbiamo selezionato diversi gruppi di sog-getti per confrontare i livelli di TNFAIP3 tra pazienticon SM e tiroidite autoimmune e tra pazienti conSM a diverso decorso clinico. Ad oggi abbiamo rac-colto nella Biobanca del nostro Centro i campionidi 60 pazienti con SM recidivante-remittente(SMRR) senza tiroidite autoimmune, 37 con SMRRe tiroidite, 27 con SM primariamente progressiva,51 non-SM con tiroidite (21 ipotiroidei e 30 eutiroi-dei) e 49 controlli sani.

CoNCLUSioNiIn conclusione, il nostro studio dimostra che i mo-nociti rivestono un ruolo centrale nel fenomenodell’alterata espressione di TNFAIP3 osservata pre-cedentemente nel sangue intero dei pazienti con

Studio dei meccanismi alla base della deregolazione del geneanti-infiammatorio tNFaIp3 in pazienti con sclerosi multipla

COMPENDIO 2015

Serena MartireUnità di Neurobiologia clinica, Istituto di Neuroscienze della Fondazione cavalieri ottolenghi,orbassano (to)

MENtoRE: Simona Perga

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SM. Abbiamo, inoltre, identificato 15 ncRNA circo-lanti differentemente espressi nei pazienti rispettoai controlli, la cui analisi dei possibili geni bersaglioconsentirà di evidenziare eventuali interazioni conTNFAIP3 o altri geni del suo pathway. Infine, misu-rare l’espressione del gene nei gruppi di soggettiselezionati consentirà di capire se diversi livelli diTNFAIP3 sono in grado di determinare diversi gradidi autoimmunità.

Nel complesso, i risultati di questo studio ci hannoconsentito e consentiranno di approfondire le co-noscenze sul ruolo di TNFAIP3 nella SM e più in ge-nerale nell’autoimmunità. Dal momento cheTNFAIP3 e le molecole che fanno parte del suo pa-

thway rappresentano un bersaglio manipolabile perattenuare la componente infiammatoria, ulterioristudi in questo campo potrebbero fornire le basi perlo sviluppo di nuovi approcci terapeutici.

iNTRoDUCTioN AND AiMSThe A20 enzyme, codified by the TNFAIP3 gene, isconsidered a central gatekeeper in inflammationand immunity. In fact, the phenotype of mice withfull or conditional A20 deletion shows that A20 ex-pression is essential to prevent chronic inflamma-tion and autoimmune pathologies. Moreover, singlenucleotide polymorphisms within the TNFAIP3 ge-nomic locus have been associated with multiple in-flammatory and autoimmune disorders, includingmultiple sclerosis (MS). Recently, our group ob-served a significant down-regulated expression ofa panel of important anti-inflammatory molecules inwhole peripheral blood of MS, among which TN-FAIP3, suggesting that MS arises from a defectivenegative feedback control of inflammation.Based on this ground, we planned to characterizethe blood cell populations that may be critically in-volved in the unbalanced expression of TNFAIP3 inMS and to investigate the causes underlying theTNFAIP3 expression deficit, focusing on epigeneticfactors.Finally, since epidemiological studies showed an in-creased susceptibility for people with one autoim-mune disease to develop another and, specifically,several studies described an increased co-occur-rence of MS with Hashimoto’s thyroiditis comparedto the general population, we decided to evaluateTNFAIP3 expression levels in patients with MS, withautoimmune thyroiditis or both, as well as in pa-tients with different MS clinical course.

RESULTSTo investigate the function of TNFAIP3, we aimed

at identifying particular blood cell subpopulationshaving a pivotal role in its unbalanced expression.To this purpose, we performed real-time PCR ex-periments on monocytes and CD4+ T cells ob-tained from 18 healthy controls (HC) and 24 MSpatients. Results showed that TNFAIP3 gene ex-pression was lower in monocytes of MS patientsthan in HC, while in CD4+ T cells the under-expres-sion in MS patients was only approaching statisticalsignificance.Moreover, in order to deepen insight into the biomol-ecular mechanisms underlying TNFAIP3 deregula-tion in MS, we focused on a fine-scale assessmentof the epigenetic variability of MS patients com-pared to HC. Small RNAs extracted from macrovesi-cles precipitated from plasma of six MS and six HCwere sequenced, identifying 15 differentially ex-pressed non-coding RNA (ncRNA). Nine of them re-sulted down-regulated in MS, while the remainingsix showed an up-regulation. In the literature thereis no evidence of an involvement of this group ofncRNA in the MS disease, whereas most of themappear to have mainly a role in different types ofcancer, and two of them are described to be in-volved in Alzheimer and Parkinson disease. Howev-er, computational analyses for ncRNA targetprediction are now underway.Finally, aiming to compare TNFAIP3 gene expres-sion level in patients with MS, with autoimmune thy-roiditis or both, as well as in patients with differentMS clinical course, we selected different cohort ofsubjects. Until now we collected in our Biobanksamples from 60 treatment-naïve relapsing-remit-ting (RRMS) without other autoimmune diseases,

Deeper insight into the mechanisms underlyingthe deregulation of the anti-inflammatory gene tNFaIp3in patients with multiple sclerosis


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37 treatment-naïve RRMS affected also by autoim-mune thyroiditis, 27 primary progressive MS, 51non-MS patients affected by autoimmune thyroiditis(21 hypothyroid, 30 hyperthyroid) and 49 HC.

CoNCLUSioNSIn conclusion, to date this study demonstrated thatmonocytes play a pivotal role in the unbalanced ex-pression of TNFAIP3 previously described in wholeperipheral blood of MS patients. Moreover, we iden-tified 15 ncRNA differentially expressed in MS com-pared to HC. Subsequent computational analysisfor target prediction will allow us to highlight thepresence of ncRNA which are able to interact with

genes of the TNFAIP3 pathway, influencing their ex-pression level. Finally, the evaluation of TNFAIP3 ex-pression in the selected cohorts of subjects mayhelp to understand if different levels of TNFAIP3gene expression can predispose to different de-grees of autoimmunity.As a whole, results of the present study allowed andwill allow a better understanding of the role of TN-FAIP3 in MS and autoimmunity in general. SinceTNFAIP3 or molecules in its pathway could beboosted to tone down the inflammatory componentof MS, future studies in this field may provide thebasis for the development of novel therapeuticstrategies.

COMPENDIO 2015


Navone ND, Perga S, Martire S, Berchialla P, Malucchi S, Bertolotto A. Monocytes and CD4+ T cells contribution to the under-expression of NR4A2 andTNFAIP3 genes in patients with multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 2014 Jul 15;272(1-2):99-102

Martire S, Giuliano-Albo A, Perga S, Falvo S, Marnetto F, Reviglione R, Capobianco M, Corpillo D, Bertolotto A. DBP isoforms and ApoE as early pro-gnostic CSF biomarkers of MS aggressiveness. XXIV National AINI Congress, Sorrento (Italy), 1-4 ottobre 2014

Perga S, Martire S, Montarolo F, Spadaro M, Navone ND, Berchialla P, Bertolotto A. Role of single nucleotide polymorphisms and haplotype variants inTNFAIP3 expression modulation in multiple sclerosis patients. XXIV National AINI Congress, Sorrento (Italy), 1-4 ottobre 2014

Martire S, Montarolo F, Perga S, Navone ND, Finardi A, Furlan R, Bertolotto A. Role of NR4A2 in a Multiple Sclerosis mouse model (Experimental Au-toimmune Encephalomielitis). 29th Congress of the European Committee for treatment and research in multiple sclerosis. Copenhagen (Denmark), 2-5ottobre 2013

Borsa di studio finanziata con il Bando 2012 per il periodo di 1 anno e l’ammontare di 22.000 €

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PREMESSE E oBiETTiViL’immunosenescenza viene definita come la fase incui inizia il declino della immunità cellulo-mediata.In letteratura scientifica è stata ripetutamente cor-relata l’età del sistema immunitario con lo sviluppodi forme di autoimmunità, e sono stati descritti deimarcatori di senescenza su linfociti T in individui af-fetti da patologie autoimmuni. Recenti ricerche suldifferenziamento linfocitario e senescenza del siste-ma immunitario hanno imputato un ruolo chiave aduna proteina chiamata p38. La protein chinasi p38appartiene alla famiglia delle MAP chinasi (MAPK),e quando viene attivata gli eventi di trasduzione delsegnale che ne derivano portano ad una regolazio-ne dell’attivazione linfocitaria, della proliferazione edel rilascio delle citochine. A conferma di questa in-fluenza di p38 sullo sviluppo linfocitario è stato di-mostrato il suo coinvolgimento, mediante induzionedi una risposta di tipo Th17, nello sviluppo e pro-gressione della Experimental Autoimmune Ence-

phalomyelitis (EAE), il modello sperimentale dellasclerosi multipla (SM). Tuttavia, benché ci sia unaimmunosenescenza prematura nei pazienti affettida SM, il ruolo della p38 in questo contesto patolo-gico non è stato ancora definito in maniera chiara.Il nostro progetto si è proposto di chiarire il ruolosvolto dalla immunosenescenza nell’insorgenza e laprogressione della SM. Il nostro primo obiettivo èstato correlare lo studio di marcatori di immunose-nescenza, attraverso lo studio del fenotipo cellularee del differenziamento dei linfociti T CD4 e CD8, conl’età e la gravità della patologia in persone con SMrecidivante-remittente (SMRR). A questi risultati ab-biamo quindi aggiunto lo studio parallelo sulla atti-vazione di p38.È importante notare come questo studio evidenzi lapossibilità di modulare il signaling di p38 come pos-sibile soluzione per bilanciare gli effetti deleteri, do-vuti alla immunosenescenza, nelle persone con SM.

RiSULTATiIl progetto è iniziato dimostrando che le cellule TCD4+, isolate da persone con SMRR, mostrano unareattività alterata di p38. Questo è stato evidenziatomediante citofluorimetria, rilevando un aumento del36% di p38 nelle cellule CD4 a seguito di stimola-zione, mentre in assenza di stimolazione non abbia-mo evidenziato differenze nel livello basale di p38.Questo risultato è stato confermato studiando il rate

di fosforilazione di p38 con la tecnica Western Blot.Per studiare l’impatto di questa aumentata attivazio-ne di p38 è stata valutata la frequenza delle celluleTEMRA, che fenotipicamente rappresentano dellecellule senescenti. I risultati hanno dimostrato comela percentuale di questo subset cellulare sia più altanei pazienti con SM sia per quanto riguarda le celluleT CD4+ che per le cellule T CD8+. Quindi, nei pa-zienti SM, ad un aumento della fosforilazione di p38corrisponde un aumento dell’immunosenescenzaPer valutare l’effetto di p38 nel differenziamentodelle cellule Th17, sono stati condotti dei saggi cel-lulari in presenza di un inibitore specifico di tutte leisoforme di p38 (BIRB796). Linfociti T CD4 naïve(CD4+CD45RA+CD27+) sono stati indotti a polariz-zare verso il fenotipo Th17 attraverso l’aggiunta diun cocktail citochinico (TGFbeta, IL1beta, IL6, IL23)con o senza inibitore di p38. Dopo 5 giorni di pola-rizzazione è stata valutata la produzione di IL17 me-diante citofluorimetria ed ELISA. I risultati hannomostrato un effettivo blocco della polarizzazioneverso Th17 in presenza di inibitore di p38, e la pro-duzione di IL17 era significativamente ridotta.

CoNCLUSioNiI nostri dati hanno dimostrato che il signaling di p38è aumentato nei pazienti SM. Questo favorisce undifferenziamento dei linfociti T verso un fenotipo se-nescente TEMRA, visto che la frequenza di questofenotipo è maggiore proprio nei pazienti SM. È in-

Ruolo svolto dalla immunosenescenza nella insorgenzae progressione della sclerosi multipla

Manolo SambucciUnità di Neuroimmunologia, Fondazione Santa lucia, Roma

MENtoRE: Luca Battistini

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teressante infine notare come p38 sembra esserecoinvolto nel differenziamento delle cellule Th17 sianei soggetti sani che nei pazienti SM. Avere capitouno dei meccanismi che modulano la senescenza

nei linfociti può indirizzare potenziali terapie voltealla modulazione di p38 allo scopo di bilanciare isuoi effetti deleteri sulla funzionalità del sistema im-munitario nella SM.

COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSImmunosenescence is defined as a decline in cell-mediated immunity with age. Several evidencessuggest that aging of the immune system and onsetof autoimmunity may be correlated. As a matter offact, the incidence of autoimmune diseases appearsto be higher in the elderly and an age-inappropriatedifferentiation and expression of senescence mark-ers has been described in T lymphocytes from pa-tients affected by certain autoimmune diseases.Recent findings indicate that immunosenescenceoccurs prematurely in patients affected by relapsingremitting multiple sclerosis (RRMS) and other datasuggest that p38 MAP-kinase is involved in humanlymphocyte differentiation and senescence, and p38phosphorylation has been shown to be activated ina pro-inflammatory environment. Once sparked, thep38 cascade regulates lymphocyte activation, pro-liferation and cytokine release. Confirming its centralrole in shaping the immune response, the p38 MAPKcascade has been shown to be required for the de-velopment and progression of experimental autoim-mune encephalomyelitis (EAE), the animal model ofmultiple sclerosis (MS), through the induction of aTh17-mediated autoimmune response. In additionto this, p38 cascade has been shown to be crucialin inducing T cell senescence. Interestingly, prema-ture immunosenescence has been related to autoim-munity in humans. Nevertheless, the contribution ofp38 phosphorylation on human Th cell generationand senescence in MS pathogenesis has not beenclarified yet.Therefore, our first objective was to relate the studyof immunosenescence markers, through the studyof CD4 and CD8 lymphocytes phenotype and dif-ferentiation, with age and severity of the disease inpatients with relapsing-remitting MS (RRMS). Tothese results we then added the parallel study onactivation of p38.

Our study aims to clarify the role played by im-munosenescence in the onset and progression ofmultiple sclerosis. In addition to this, the under-standing of the mechanisms that modulate senes-cence in lymphocytes will lead to the opportunity tocounteract the aging of the immune system and itsdeleterious effect on the functionality of the immuneresponse in MS.

RESULTSWe first measured by flow cytometry the level of ex-pression of the p38 kinase ex-vivo, and found thatthere was no difference in the basal level of p38 to-tal protein and phosphorylated protein betweendonors and MS patients. However, when the levelsof p38 phosphorylation were measured in isolatedCD4-positive T cells upon stimulation with PMA andionomycin, we uncovered a completely different sit-uation: CD4 + lymphocytes from RR-MS individualsin fact showed a significantly higher propensity tophosphorylation than their counterparts isolatedfrom healthy donors. After stimulation the fold in-crease of p38 MFI in CD4 cells was 36% higher inpatients than in healthy donors. To validate the re-sults obtained by flow cytometry, we performed thesame experiment in western blot.As p38 pathway has an impact on T cell senes-cence, the second step of the project was to inves-tigate whether the high activation of this kinaseleads to a higher frequency of senescent lympho-cytes in MS patients in comparison with healthydonors. A group of RR-MS patients was then re-cruited and PBMCs were isolated from peripheralblood. The frequency of CD45RA re-expressing cells(TEMRA), known to be senescent-like T cells wasanalysed by flow cytometry. The results show thatthe percentage of this cell subset is higher in pa-tients in comparison with healthy donors, and thisholds true both for CD8+ and CD4+ T lymphocytes.

a role for immunosenescence in the onset and progressionof multiple sclerosis

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To outline the contribution of the p38 signallingpathway on the induction of human Th17 differen-tiation, we performed a T cell differentiation assayof naïve CD4+CD45RA+CD27+ lymphocytes uponstimulation with anti-CD3 and anti-CD28 and theappropriate polarizing cytokines (TGFbeta, IL1beta,IL6, IL23), in the presence or absence of the p38 in-hibitor BIRB796. BIRB796 was selected for its abil-ity to inhibit with great efficiency all four isoforms ofp38 MAPK and for its low toxicity on lymphocytesin culture. After 5 days of culture, cells were stimu-lated with PMA and ionomycin, and the release ofIL17 was assessed by flow cytometry. We were ableto detect a sizeable frequency of IL17 positive cellsunder polarizing conditions, and this frequency ap-peared to be significantly inhibited in the presenceof BIRB796.Finally, we measured by ELISA the release of IL17by isolated naive CD4 cells under polarizing condi-tions in the presence or absence of BIRB after 5days. While uncommitted CD4 T cells did not re-lease IL17, Th17-polarized lymphocytes secretedsignificant amounts of the proinflammatory cy-tokine. IL-17 release was significantly reducedwhen BIRB796 was used in the differentiation as-say, thus confirming the cytofluorimetric data.Overall our results demonstrated that CD4+ T cellsisolated from RR-MS individuals display an alteredresponsiveness of the p38 cascade, resulting in an

increase of p38 phosphorylation upon stimulation.We also showed that the p38 signalling pathway isimplicated in the generation of Th17 lymphocytesfrom human CD4+CD27+CD45RA+ naive T cells,both in healthy donors and in patients affected bythe relapsing remitting form of MS (RR-MS). The da-ta obtained also indicates that p38 activation is es-sential for IL17 release from central memorylymphocytes and committed Th17 cell clones, bothin healthy donors and in RR-MS patients. In addi-tion to this, the results obtained show an increasedfrequency of CD8+ and CD4+ TEMRA cells(CD45RA re-expressig cells) in patients affected byRR-MS in comparison with healthy donors. Thesesubsets of effector T cells actually show markers ofT cell senescence and the highest expression ofphospho-p38, when compared with other T cellsubsets.

CoNCLUSioNSThese data suggest that the p38 signalling pathwayis upregulated in MS patients. In addition to this,upregulation of the p38 cascade in patients couldpush T cell differentiation towards a TEMRA-senes-cent phenotype, as the frequency of this senescent-like subset is higher in the peripheral blood of MSpatients. Finally, p38 appears to be involved in thedifferentiation of Th17 cells both in healthy donorsand in RR-MS patients.


Di Mitri D, Sambucci M, Loiarro M, De Bardi M, Cencioni MT, Volpe E, Gasperini C, Centonze D, Sette C, Akbar A, Borsellino G, Battistini L. The p38-MNK axis modulates TH17 differentiation and functionality in multiple sclerosis. Submitted to Immunology


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PREMESSE E oBiETTiViLa sclerosi multipla (SM) è definita come una malattiainfiammatoria del sistema nervoso centrale. Le causealla base della SM sono ancora poco chiare, ma mol-ti studi hanno rivelato che durante lo sviluppo dellamalattia vi è la progressiva alterazione del funziona-mento delle cellule cerebrali, i neuroni, in seguito allaperdita di un componente fondamentale, la mielina,una sostanza che garantisce la corretta comunica-zione tra i neuroni permettendo il normale funziona-mento del nostro cervello. La perdita della mielinasembra essere imputabile ad un malfunzionamentodel sistema immunitario, il quale attacca in modo er-roneo alcune proteine della mielina. Alcune ricercherecenti hanno però evidenziato che alcuni sintomi simanifestano prima della perdita di mielina, sugge-rendo che altri fattori determinino un danno neuro-nale e siano importanti per l’evolversi della malattia.Lo scopo di questo progetto di ricerca è stato pro-prio quello di studiare l’effetto diretto delle molecolerilasciate dal sistema immunitario sul funzionamen-to dei neuroni, indipendentemente dall’azione sullamielina, e in particolare sul funzionamento dell’unitàstrutturale alla base della comunicazione tra neuro-ni, la sinapsi.La sinapsi è composta da due compartimenti: un ter-minale presinaptico, in cui sono accumulate vesci-cole sinaptiche cariche di neurotrasmettitore, e uncompartimento postsinaptico, deputato a ricevere ilneurotrasmettitore e mediarne una cascata di segna-lazione a seguito dell’attivazione di specifici recettori.

Molti lavori recenti si sono occupati di comprenderequale fosse l’effetto di mediatori infiammatori sulcompartimento postsinaptico, ma risulta ancora pocostudiato il contributo immunomodulatorio nella fun-zionalità del compartimento presinaptico. Con questoprogetto abbiamo voluto approfondire proprio questoaspetto. La comprensione di questi meccanismi, deiquali si conosce molto poco, permetterebbe di am-pliare la conoscenza delle cause di questa malattia,aprendo nuove possibili strade per la terapia.

RiSULTATiPer rispondere alla nostra domanda biologica ab-biamo utilizzato colture neuronali ippocampali pri-marie derivate da topo, un modello in vitro bencaratterizzato in letteratura. I neuroni cresciuti in vi-

tro, una volta maturati, sono stati incubati con cito-chine pro- e anti-infiammatorie per tempi brevi(5-60 minuti). Sono stati poi eseguiti vari saggi voltia valutare parametri di funzionalità neuronale. Ciòche abbiamo osservato è che l’esposizione a cito-chine pro-infiammatorie, ma non anti-infiammatorie,determina un aumento dell’eccitabilità dei neuroni,che si manifesta con un aumento del calcio basaleintracellulare, un aumento nella frequenza di eventidi rilascio spontaneo di vescicole sinaptiche, un au-mento nel numero di vescicole sinaptiche reclutatein seguito a specifici paradigmi di stimolazione elet-trica. Questi effetti funzionali si accompagnano adun aumento della fosforilazione di sinapsina 1 me-diato dalla chinasi ERK. Sinapsina 1 è un proteina

Ruolo delle citochine pro- e anti-infiammatorie nellamodulazione dell’attività e nella composizione presinaptica:nuove prospettive nella ricerca sulla sclerosi multipla

COMPENDIO 2015

Flavia ValtortaUnità di Neuropsicofarmacologia, Divisione di Neuroscienze, ospedale San Raffaele, Milano

collaboRatoRI:Serena Bellani, Fabrizia Guarnieri, Elena Monzani

collaboRazIoNI coN altRI GRUppI:Luca Muzio, Gianvito Martino, Unità di Neuroimmunologia, Divisione di Neuroscienze,ospedale San Raffaele, MilanoDavide Pozzi, lab di Farmacologia e patologia del cervello, IRRcS Humanitas,Rozzano (MI)

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in grado di regolare il numero di vescicole sinapti-che disponibili per la fusione, modulando così il ri-lascio di neurotrasmettitore. Sinapsina potrebbequindi essere un mediatore cruciale della rispostaneuronale a citochine pro-infiammatorie.Per capire come l’esposizione cronica a un ambien-te infiammatorio possa influire sulla funzionalitàneuronale, abbiamo incubato i neuroni in colturacon citochine pro-infiammatorie per cinque giorni.Abbiamo così osservato che l’esposizione cronicaa citochine infiammatorie determina una riduzionespecifica di alcuni marcatori sinaptici, indicandol’attivazione di meccanismi compensatori di rimo-dellamento delle sinapsi che potrebbero essere voltia un silenziamento delle stesse. Inaspettatamente,in neuroni deleti per sinapsina, questo rimodella-mento della composizione sinaptica diventa dram-matico.Ci siamo quindi chiesti se l’assenza di sinapsina po-tesse modificare il decorso della malattia. Abbiamoquindi indotto l’Encefalite Sperimentale Allergica,un modello sperimentale di SM ampiamente utiliz-

zato, in topi wild-type e topi deleti per il gene Syn1,e monitorato il decorso clinico della patologia per90 giorni. Ciò che emerge da dati ancora preliminariè che l’assenza di sinapsina 1 non altera l’anda-mento acuto della patologia, ma ne migliora il de-corso cronico. Infatti, i topi senza sinapsina 1 siattestano in fase cronica su un punteggio clinico in-feriore, seppur di poco, rispetto ai controlli. Ciò èconfermato anche dall’analisi istopatologica dellelesioni presenti a livello del midollo spinale.

CoNCLUSioNiGrazie a questo progetto pilota, appena concluso,abbiamo potuto investigare le conseguenze direttedi una esposizione neuronale a un ambiente pro-in-fiammatorio e abbiamo identificato la cascata delsegnale ERK-sinapsina 1 come mediatore impor-tante della risposta neuronale a citochine. Ciò rap-presenta un primo passo verso l’identificazione diun possibile nuovo meccanismo patogenetico e diconseguenza di un nuovo possibile bersaglio far-macologico.

iNTRoDUCTioN AND AiMSMS is defined as an inflammatory disease of thecentral nervous system. The causes at the basis ofMS are still unclear, but many studies have revealedthat during the development of MS there is a pro-gressive alteration of the functioning of neurons,due to the loss of myelin. Myelin is a fundamentalcomponent, as it allows a correct communicationbetween neurons and the correct functioning of ourbrain. The loss of myelin seems to be caused by amalfunctioning of the immune system, which erro-neously attacks some myelin proteins. However, re-cent research underlined that some symptoms arisebefore the loss of myelin, thus suggesting that othermechanisms determine the neuronal damage.The aim of this project was to study the direct effectof molecules released from the immune system onneuronal function, independently from the action onmyelin, and in particular on the synapse. The synapseis composed of two compartments: a presynapticterminal where synaptic vesicles filled with neuro-

transmitter are accumulated, and a postsynapticcompartment, deputed to developing a signal cas-cade in response to the activation of specific recep-tors by the neurotransmitter released. Many papersin the literature focused on the effect of inflammatorymediators on the postsynaptic compartment. Less isknown about the immunomodulatory contribution onpresynaptic functionality. In this project we wantedto deepen this aspect. Indeed, the comprehension ofthese mechanisms, which are not well understood,would allow us to widen the knowledge of MS caus-es and to open new routes for therapy.

RESULTSIn order to address our biological question, we usedmouse primary hippocampal neuronal cultures, awell-characterized in vitro model. Neurons grown inculture until maturation were incubated with pro-and anti-inflammatory cytokines for brief periods oftime (5-60 min). Several assay for the analysis of theneuronal functionality were then performed. We ob-

Role of pro- and anti-inflammatory cytokines inthe modulation of presynaptic composition and functioning:new perspectives in multiple sclerosis research


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served that the exposure to inflammatory cytokinescauses an increase in neuronal excitability, whichmanifests through an increase in basal intracellularcalcium levels, an increase in the frequency ofspontaneous events of vesicle fusion (miniature ex-citatory postsynaptic currents, mEPSCs), an in-crease in the number of vesicles recruited uponspecific paradigms of electrical stimulation. Thesefunctional effects are accompanied by an increasedphosphorylation of synapsin 1 by the ERK kinase.Synapsin 1 is a protein able to regulate the numberof synaptic vesicles available for fusion, thus mod-ulating neurotransmitter release. Therefore, synapsinmay be a crucial mediator of the neuronal responseto pro-inflammatory cytokines.We also wanted to understand how a chronic ex-posure to an inflammatory milieu could influence onneuronal functionality. To this aim, we incubatedneurons in culture with pro-inflammatory cytokinesfor five days. At the end, we observed that thechronic exposure to inflammatory cytokines causesa specific reduction in some synaptic markers,pointing to the possibility that a compensatory re-modelling of synapses may be activated in these

cells, probably to silence them. Unexpectedly, inneurons deleted for synapsin the synapse remod-elling becomes dramatic.We wanted to investigate whether the absence ofsynapsin could modify disease progression. To thisaim, we induced EAE in wild-type and synapsin 1knock-out mice, and we followed the clinical out-come for 90 days. Preliminary data indicate that theabsence of synapsin 1 does not modify the acutephase of the pathology, but it positively influencesthe chronic phase. In fact, the knock-out mice sta-bilize at a lower clinical score with respect to controlmice. This is confirmed by the histo-pathologicalevaluation of the lesions in the spinal cord.

CoNCLUSioNSThanks to this pilot project, we could investigate thedirect consequences of neuronal exposure to an in-flammatory milieu, and we identified the ERK-synapsin 1 signalling cascade as an importantmediator of the neuronal response to cytokines. Thisrepresents a first step towards the identification ofa novel possible pathogenic mechanism, and thusof a novel possible pharmacological target.

COMPENDIO 2015


Guarnieri FC, Bellani S, Pozzi D, Monzani E, Corbetta A, Fornasiero EF, Muzio L, Martino G and Valtorta F. Modulatory effects of pro- and anti-inflammatorycytokines on signalling pathways and molecular composition of nerve terminals. Congresso Scientifico Annuale FISM, Roma 28-29 Maggio 2014

Monzani E, Guarnieri FC, Bellani S, Pozzi D, Valente MM, Fornasiero EF, Martino G, Muzio L and Valtorta F. Role of pro- and anti-inflammatory cytokinesin the modulation of presynaptic composition and functioning: new perspectives in multiple sclerosis research. San Raffaele Scientific Retreat, Milano,29-30Novembre 2013

Guarnieri FC, Bellani S, Pozzi D, Monzani E, Valente MM, Fornasiero EF, Martino G, Muzio L and Valtorta F. Role of pro- and anti-inflammatory cytokinesin the modulation of presynaptic composition and functioning: new perspectives in multiple sclerosis research. Congresso Scientifico Annuale FISM,Roma 29-30Maggio 2013

Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2011 per il periodo di 1 anno (prorogato di 1 anno) e l’ammontaredi 30.000 €

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PREMESSE E oBiETTiViStudi post-mortem mostrano che gli interneuroniGABAergici positivi per la parvalbumina (PV+) risul-tano diminuiti nella corteccia motoria di personecon sclerosi multipla (SM). Linee di topi con knoc-kout (KO) neuronale di una o entrambe le GTPasiRac1 e Rac3 sono state prodotte nel laboratorio didr. Ivan de Curtis.Dati e mostrano che il numero diinterneuroni PV+ cerebrali diminuisce nei topi conknockout (KO) rispetto ai controlli. I due specificiobiettivi del progetto sono stati:1) Analizzare gli effetti dell’encefalite sperimentaleautoimmune (ESA) sulle cellule GABAergiche corti-cali per studiare il meccanismo che causa la perditadegli interneuroni corticali osservata nelle personecon SM.2) Analizzare gli effetti della mancanza delle Rac su-gli interneuroni spinali inibitori, per identificare difettiin specifiche popolazioni di interneuroni; un puntodi partenza per un progetto a lungo termine che ve-da l’uso di questi modelli animali per l’analisi deimeccanismi che ricadono sugli interneuroni inibitorispinali nelle persone con SM.

RiSULTATiPer quanto riguarda il primo obiettivo del progettoabbiamo osservato gli effetti dell’ESA sugli inter-neuroni PV+ e calretinina positivi (CR+) nella cor-teccia motoria primaria di topi. È stata rilevata unasignificativa riduzione del numero degli interneuroniPV+ ma non dei CR+ nei topi con ESA. La quantifi-cazione degli interneuroni PV+ negli strati II-III dellacorteccia motoria primaria ha mostrato una riduzio-ne del 30% negli. (P<0.001), mentre non sono stateosservate differenze nel numero degli interneuroniPV+ negli strati IV-VI della corteccia motoria prima-ria nei topi con ESA. La riduzione nel numero di in-terneuroni PV+ è stata osservata soltanto nei topicon un elevato score clinico (2.5-3; 30 dpi). È stato,

inoltre, visto uno scarso segnale dei terminali GA-BAergici (a livello degli strati II-III). La riduzione delnumero delle cellule PV+ è risultata accompagnatada una riduzione del segnale del GABA: l’area oc-cupata dallo specifico marcatore è risultata ridottadel ≈50%. La quantificazione nella corteccia moto-ria ha mostrato una riduzione della colocalizzazionedi PV con vGAT a livello dei terminali presinapticinei topi con ESA. Abbiamo osservato, inoltre, lapresenza di cellule CD45+ e cellule apoptotiche(con la tecnicaTUNEL) nella corteccia degli animalicon ESA con elevato punteggio clinico (2.5-3); an-che il segnale per GFAP è risultato più forte in questitopi rispetto ai quelli con basso score clinico.Per quanto riguarda il secondo punto del progettoabbiamo effettuato un’ analisi sul midollo spinale ditopi con doppio knockout (dKO) allo stadio di 13giorni postnatale (P13).Il transgene SynI-Cre risultaespresso allo stadio di 12,5 giorni embrionali(E12.5),e questo indica che Rac1 viene deleta moltopresto nei neuroni del midollo spinale. Sono statiosservati dei cambiamenti nello staining per X-Galtra l’area dorsale e ventrale della materia grigia tragli stadi embrionali a E12.5 e quelli postnatali a P13.Il transgene synI-Cre è espresso negli interneuroniPV+, CR+, e nei motoneuroni ChAT+. Abbiamo os-servato, infatti, una forte colocalizzazione del-l’espressione del transgene synI-Cre con neuroniPV+ (86%), CR+ (72%), CB+ (82%), and ChAT+(83%). L’espressione di Rac3 nelle corna ventrali edorsali, così come nei DRGs vista attraverso l’ibri-

dazione in situ è risultata forte agli stadi P0-P7, de-bole negli stadi P13-P25.Abbiamo visualizzato gliinterneuroni attraverso immunofluorescenza su se-zioni di midollo spinale da topi dKO e i rispettivicontrolli (Rac3KO) nello stadio P13. L’area ventralelombare del midollo spinale (L1-L4) risulta esserecoinvolta nel controllo del movimento delle zampeposteriori e i topi con doppio knockout (dKO) risul-

Regolazione degli interneuroni Gabaergici da partedelle Gtpasi Rac

Anna FalcoUnità di adesione cellulare, Università Vita-Salute e Istituto Scientifico San Raffaele, Milano

MENtoRE: ivan de Curtis

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terebbero atassici e poco coordinati. Il midollo spi-nale di questi topi risulta essere più piccolo, conuna forte diminuzione nel numero degli interneuroniPV+, CR+ and CB+, rispetto ai topi controllo. Lecellule PV+ a livello del midollo spinale risultano, inoltre, essere GABA negative, suggerendo che po-trebbero essere glicinergiche.

CoNCLUSioNiI nostri dati dimostrano che il circuito inibitorio ri-sulterebbe affetto nella corteccia motoria primariadei topi con ESA, e suggeriscono che gli interneu-roni PV+ sono vulnerabili in maniera specifica allapatologia durante la progressione del trattamentoESA. La ragione di questa vulnerabilità non è anco-ra chiara. Poiché gli effetti sulle cellule PV+ sonostati osservati soltanto nei topi con un elevato scoreclinico, la perdita di queste cellule potrebbe rappre-

sentare un segno degli stadi avanzati della patolo-gia. Con gli studi precedenti che implicano difettiGABAergici in altre aree del cervello durante lo svi-luppo della patologia, i nostri risultati supportanol’ipotesi che un rafforzamento del segnale dagli in-terneuroni GABAergici potrebbe essere una validaalternativa terapeutica per controllare la progressio-ne del danno neuronale nelle persone con SM. Co-munque, il dato sullo sviluppo del midollo spinaleche risulta essere alterato nei topi con doppio knoc-kout (Rac1/Rac3) è preliminare per studi futuri suitopi con singolo knockout e sui topi conESA e i ri-spettivi controlli. La comprensione dei meccanismiintracellulari mediati dalle Rac che regolano lo svi-luppo degli interneuroni spinali potrebbe essere ri-levante per studi futuri indirizzati sugli effettidell’ESA su queste cellule (Gilmore et al. 2008; Vogtet al. 2009) e nelle persone con SM.

COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSRecent post-mortem analysis on brains from pa-tients indicate that parvalbumin-positive (PV+) GA-BAergic interneurons are decreased in the motorcortex of patients with Multiple Sclerosis (MS). Dif-ferent mice lines with single or double neuronalknockout (dKO) of the genes for the Rac1 and Rac3GTPases have been produced in the lab of dr. Ivande Curtis. The data show that the number of corticaland hippocampal PV+ interneurons is decreased inthe KO mice compared to controls. The two specificaims were:Aim 1. To analyze the effects of experimental au-toimmune encephalomyelitis (EAE) on cortical GA-BAergic cells to study the mechanisms causing theloss of cortical interneurons observed in MS pa-tients.Aim 2. Analysis of the effects of Rac depletion oninhibitory spinal interneurons, to identify defects inspecific populations of spinal interneurons; a star-ting point for a long-term project aiming at the useof these animal models for the analysis of the me-chanisms affecting spinal inhibitory interneurons inMS.

RESULTSAim 1. We have tested the effects of EAE on PV+and calretinin(CR)+ interneurons in the primary mo-tor cortex of mice. We found a significant reductionof the number of PV+, but not CR+ interneurons inEAE-treated WT mice. Quantification of PV+ inter-neurons in layers II-III of the primary motor cortexshowed a reduction of 30% in EAE animals(P<0.001). No difference were observed for thenumber of PV+ cells in layers IV-VI of the primarymotor cortex of EAE mice. The number of PV+ INswas reduced only in mice with high clinical score(2.5-3; 30 dpi). We found a lower signal of GABAer-gic terminals (layers II-III) in EAE mice. The reduc-tion of the number of PV+ cells accompaniedimpaired GABA signaling: the area occupied by ei-ther marker was reduced by ≈50%. Interestingly,quantification in the motor cortex showed that co-localization of PV with vGAT at inhibitory presynap-tic sites was also decreased in EAE mice. We foundmore CD45+ cells and apoptotic cells (by TUNEL)in the cortex of EAE mice with high clinical score(2.5-3). Also the signal for GFAP was stronger withrespect to mice with low score.Aim 2. We have started the analysis of spinal cords

Regulation of cerebral and spinal interneurons by Rac Gtpases

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in P13 dKO mice. SynI-Cre is expressed at E12.5,indicating that Rac1 was deleted early in spinal cordneurons. A change in X-Gal staining between ven-tral and dorsal areas of the gray matter was obser-ved between E12.5 and P13. The synI-Cre

transgene is expressed in the PV+, CR+ and CB+interneurons, and in ChAT+ motor neurons. Therewas a strong colocalization of synI-Cre transgeneexpression with PV+ (86%), CR+ (72%), CB+ (82%),and ChAT+ (83%) neurons. Rac3 expression in theventral and dorsal horns, as well as in DRGs detec-ted by in situ hybridization was stronger at P0-P7,weaker at P13-P25. We looked at interneurons byimmunofluorescence on sections of spinal cordfrom P13 dKO and control (Rac3KO) littermates.The ventral lumbar region of the spinal cord (L1-L4)is involved in the control of hindlimbs that are affec-ted in the ataxic and poorly coordinated dKO mice.The spinal cord was smaller in these mice, with astrong decrease in the number of PV+, CR+ andCB+ interneurons compared to controls. Spinal PV+cells were GABA-negative, suggesting that theymay be glycinergic.

CoNCLUSioNSOur data demonstrate that inhibitory circuits are af-fected in the motor cortex of EAE mice, and suggestthat PV+ interneurons are specifically vulnerable tothe pathological insult during EAE progression. Thereason for this vulnerability is unknown. Since theeffects on PV+ cells were only detectable in micewith elevated clinical score, loss of these neuronsmay be a hallmark of advanced stages of the disea-se. Together with previous studies implicating a GA-BAergic defect in other areas of the brain during thedevelopment of the disease, our results support thehypothesis that the reinforcement of signaling byGABAergic interneurons may be a valid therapeuticalternative to control the progression of the neuronaldamage in MS patients. Moreover, the finding thatdevelopment of the spinal cord was altered inRac1/Rac3 dKO mice is preliminary to future studieson single KO mice and on EAE versus WT mice. Un-derstanding the intracellular Rac-mediated mecha-nisms regulating the development of spinalinterneurons will be relevant to future studies ad-dressing the effects of EAE on these cells (Gilmoreet al. 2008; Vogt et al. 2009) and in human MS.



Falco A, Pennucci R, Brambilla E, de Curtis I. Reduction of parvalbumin-positive interneurons and inhibitory input in the cortex of mice with experimentalautoimmune encephalomyelitis. Exp Brain Res 2014, 232:2439-49.

Falco A, Montinaro V, Pennucci R, Tonoli D, Brambilla E, Furlan R, de Curtis I. Regulation of GABAergic interneurons by Rac GTPases: implication forMultiple Sclerosis. Congresso Scientifico Annuale FISM. Roma, 25-26 maggio 2011.

Falco A, Montinaro V, Pennucci R, Tonoli D, Brambilla E, Furlan R, de Curtis I Regulation of GABAergic interneurons by Rac GTPases: implication forMultiple Sclerosis. Congresso Scientifico Annuale FISM. Roma, 30-31 maggio 2012.

Falco A, Montinaro V, Pennucci R, Tonoli D, Brambilla E, Furlan R, de Curtis I Regulation of GABAergic interneurons by Rac GTPases: implication forMultiple Sclerosis. Congresso Scientifico Annuale FISM. Roma, maggio 2013.


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PREMESSE E oBiETTiViLe cellule microgliali, considerate i macrofagi delcervello, giocano un ruolo chiave nella sclerosi mul-tipla (SM). È stato osservato che le cellule microglialipresentano un fenotipo attivato in tutte i tipi di lesionedella SM e, per questa ragione, si ritiene che abbianoun ruolo lesivo. Tuttavia, dati recentemente ottenutida cellule microgliali derivate dal modello del cupri-zone, nel topo, suggeriscono che la microglia possaesprimere un fenotipo favorevole alla rimielinizzazio-ne. Per questa ragione abbiamo ipotizzato che i ma-crofagi, infiltratisi nelle lesioni della SM, possanopresentare un fenotipo favorevole alla lesione, mentrela microglia possa intervenire per sostenere la rimie-linizzazione dei neuroni. Per verificare questa ipotesiabbiamo proposto lo studio differenziato dei macro-fagi e delle cellule microgliali isolate da topi affetti daEncefalite Sperimentale Allergica, ESA, ottenendo talicellule sia nella fase acuta sia nella fase cronica, percaratterizzare il fenotipo di entrambi i menzionati tipicellulari dopo averli identificati e separati mediantel’uso di marcatori specifici, in citometria di flusso. Ab-biamo anche proposto un esperimento di deplezionedella microglia per verificare se fosse possibile otte-nere una modulazione dei processi di rimielinizzazio-ne nel modello del cuprizone.

RiSULTATiNella ESA in fase acuta abbiamo notato che i ma-

crofagi presenti negli infiltrati mostrano un fenotipoproinfiammatorio e, probabilmente, si rendono re-sponsabili della attivazione dei linfociti T. Tuttavia,contrariamente a quanto avevamo ipotizzato, le cel-lule microgliali non hanno dimostrato di possedereun fenotipo favorevole alla rimielinizzazione. Al con-trario, tali cellule sono risultate essere in stato di im-munosoppressione, suggerendo la mancanza di unloro ruolo nei fenomeni flogistici in atto nelle lesionidella SM. Di conseguenza, abbiamo deciso di so-prassedere all’effettuazione degli esperimenti di de-plezione da effettuarsi nel modello del cuprizone.Nella ESA in fase cronica, abbiamo osservato unanotevole riduzione del numero di macrofagi presentinelle aree di infiltrazione e, inoltre, il viraggio dellamicroglia verso un fenotipo simile a quello dei ma-crofagi.Questi dati suggeriscono che vi sia una variazionenel fenotipo microgliale quando la malattia si croni-cizza.

CoNCLUSioNiI risultati ottenuti nel nostro progetto indicano che imacrofagi, ma non le cellule microgliali, possonoessere le cellule responsabili dei processi flogisticidelle lesioni riscontrate nella SM, almeno nelle fasiiniziali della malattia. Questi risultati forniscono nuo-ve conoscenze sul ruolo della microglia e dei ma-crofagi nella fisiopatologia della SM.

caratterizzazione di un fenotipo microgliale favorevolealla rimielinizzazione

COMPENDIO 2015

Jonathan VinetDipartimento di Scienze biomediche, Metaboliche e Neuroscienze, Università degli Studidi Modena e Reggio Emilia, Modena

MENtoRE: Giuseppe Biagini

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iNTRoDUCTioN AND AiMSMicroglia, the macrophages of the brain, are con-sidered as key players in multiple sclerosis (MS). In-deed, microglia activation is observed in all MSlesions and for this reason, they are consideredharmful. However, recent data obtained from isolat-ed microglia in the mouse cuprizone model suggestthat microglia display a phenotype that is supportivefor remyelination. We thus hypothesized that in MS,infiltrating macrophages may display a harmful phe-notype whereas microglia would help the remyelina-tion of neurons. To verify this, we proposed to isolatemicroglia/macrophages from experimental autoim-mune encephalomyelitis (EAE) mice either in theacute or chronic phase and investigate the pheno-type of both cell types after differentiating them us-ing flow cytometry cell sorting and specific markers.We also proposed to deplete microglia from thebrain and verify whether it would affect remyelinationin the cuprizone model.

RESULTSIn acute EAE, we observed that infiltrating macro-

phages display a pro-inflammatory phenotype andthat they are probably responsible for T-cells acti-vation. However, contrary to what we hypothesized,microglia did not express a phenotype supportiveof remyelination. Instead, they remained immunesuppressed suggesting that they do not participatein the inflammation occurring in MS lesions. Ac-cordingly, we decided to renounce in performing thedepletion experiment in the cuprizone model. Inchronic EAE, we observed that the number of infil-trating macrophages was notably reduced and thatthe microglia phenotype was more similar tomacrophages. These data suggest that a shift in mi-croglia phenotype occurs when the disease be-comes chronic.

CoNCLUSioNSThe results derived from our project indicate thatmacrophages but not microglia might be the cellsresponsible for the inflammation occurring in MS le-sions, at least at the beginning of the disease. Thisprovides new insights on the role of micro-glia/macrophage in the pathophysiology of MS.

characterization of a supportive phenotype of microgliatoward remyelination



Vainchtein ID, Vinet J, Brouwer N, Brendecke S, Biagini G, Biber K, Boddeke HW. and Eggen BJ. In acute experimental autoimmune encephalomyelitis,infiltrating macrophages are immune activated, whereas microglia remain immune suppressed. Glia, 2014; 62(10):1724-35

Vinet J, van Zwam M, Dijkstra IM, Brouwer N, van Weering HR, Watts A, Meijer M, Fokkens MR, Kannan V, Verzijl D, Vischer HF, Smit MJ, Leurs R, BiberK. and Boddeke HW. Inhibition of CXCR3-mediated chemotaxis by the human chemokine receptor-like protein CCX-CKR. Br. J. Pharmacol. 2012;168(6):1375-87

Vinet J, Vainchtein ID, Brouwer N, Brendecke S, Biagini G, Biber K, Boddeke HWGM. and Eggen BJL. In acute experimental autoimmune en-cephalomyelitis, invading macrophages are immune activated whereas microglia remain immune suppressed. 9th FENS Forum of Neuroscience, Milan,July 2014

Vainchtein ID, Vinet J, Brouwer N, Brendecke S, Prinz M, Eggen BJL, Boddeke HWGM. The phenotypes of microglia and macrophages during experi-mental autoimmune encephalomyelitis (EAE). XI Euroglia, Berlin, July 2013

VERSO NUOVITRATTAMENTI

TOWARDS NEW TREATMENTS

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VERSO NUOVI TRATTAMENTI

PREMESSE E oBiETTiViLa sclerosi multipla (SM) è una malattia immuno-me-diata. Tra le molecole che il sistema immunitario usaper comunicare, due sono state identificate comecruciali per lo sviluppo della malattia: IL-12 e IL-23.Queste molecole sono entrambe pro-infiammatoriee appartengono a una famiglia di molecole che haaltri due membri, entrambi considerati anti-infiam-matori: IL-27 e IL-35. Noi abbiamo usato un approc-cio di terapia genica per somministrare IL-27 e IL-35direttamente nel sistema nervoso centrale di topi af-fetti da una malattia neuroinfiammatoria chiamataEAE, considerata un modello di SM. La nostra ipo-tesi di lavoro era che IL-27 e IL-35, probabilmentein equilibrio omeostatico con i membri pro-infiam-matori della famiglia, fossero i loro più efficienti ini-bitori e perciò una terapia efficace per la SM.

RiSULTATiIL-27 e IL-35 sono molecole costituite da due subu-nità, perciò difficili da produrre mediante terapia ge-nica. Abbiamo perciò prima generato dei vettori

lentivirali capaci di produrre IL-27 e IL-35 e dimo-strato la loro corretta attività biologica. In seguito ab-biamo somministrato IL-27 e IL-35 nel cervello ditopi affetti da EAE. IL-27 si è rivelata efficace, ridu-cendo la severità clinica della malattia, mentre IL-35si è dimostrata inefficace. Questo è sorprendenteperché entrambe IL-27 e IL-35 somministrate nelcervello sono state capaci di convertire le cellule im-munitarie del cervello, chiamate microglia, da unprofilo pro-infiammatorio ad un profilo anti-infiam-matorio.

CoNCLUSioNiIl nostro studio mostra che IL-27, ma non IL-35, ini-bisce lo sviluppo clinico dell’EAE nei topi ed è per-ciò una molecola candidata a divenire una terapiaper la SM. Per esplorare ulteriormente le potenzialitàdi sviluppo di IL-27 come trattamento nell’uomo vor-remmo dissezionare meglio il meccanismo d’azioneterapeutica, che evidentemente non implica neces-sariamente la modulazione di microglia, per raffor-zare il razionale della traslazione all’uomo.

Il-27 e Il-35 nella encefalomielite autoimmune sperimentale:un affare di famiglia

Roberto FurlanIstituto di Neurologia Sperimentale, Divisione di Neuroscienze, Istituto Scientifico San Raffaele,Milano

collaboRatoRI:Giacomo Casella, Annamaria Finardi, Chiara Maiorino

collaboRazIoNI coN altRI GRUppI:Trevor owens, University of odense, Denmark

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COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSMultiple sclerosis (MS) is an immune-mediated dis-ease. Among the molecules the immune system us-es to communicate, two have been identified ascrucial to develop MS: IL-12 and IL-23. These mole-cules are both pro-inflammatory mediators and be-long to a family of molecules that has two othermembers both considered to be anti-inflammatory: IL-27 and IL-35. We have used a gene therapy approachto deliver IL-27 and IL-35 directly in the central nerv-ous system of mice affected by a neuroinflammatorydisease called EAE, considered a model of MS. Ourworking hypothesis was that IL-27 and IL-35, be-cause possibly involved in a homeostatic balancewith the pro-inflammatory members of the family,would be their most efficient inhibitors, and thus anefficacious therapy for MS.

RESULTSIL-27 and IL-35 are molecules constituted by twosubunits, difficult to produce by gene therapy. So

first we generated lentiviral vectors able to produceIL-27 and IL-35 and demonstrated their correct bio-logical activity. Next, we administered IL-27 and IL-35in the brain of mice affected by EAE. IL-27 was clini-cally efficacious, reducing significantly clinicalseverity of the disease, while IL-35 was ineffective.This is surprising since both IL-27 and IL-35 admin-istered in the brain were able to shift the immunecells of the brain, called microglia, from a pro-in-flammatory profile, to an anti-inflammatory profile.

CoNCLUSioNSOur study shows that IL-27, but not IL-35, efficientlyinhibits the clinical development of EAE in mice andis therefore a candidate molecule for treatment ofMS. To further explore the potentiality of IL-27 to bedeveloped as a treatment for the human disease,we would like to better dissect the therapeuticmechanism, that clearly does not necessarily impli-cate modulation of microglia, to strengthen the ra-tionale for human translation.

Il-27 and Il-35 in experimental autoimmune encephalomyelitis:a family affair


Casella G., et al. IL-35 and IL-27 gene therapy in chronic EAE. SFN. Washington, November 15-19 2014

Casella G., et al. IL-27 and IL-35 in chronic EAE. FENS Forum. Milan, July 5-9 2014

Casella G., et al. IL-35 cytokine as gene therapy in chronic EAE SINS, Rome, October 3-5 2013

Casella G., Heterodimeric cytokines as gene therapy in neuroinflammation ICI (AINI) August 22-27, Milan, Italy

Casella G., et al. Microglia modulation by IL-27 and IL-35 is necessary but not sufficient to inhibit chronic EAE. Manuscript in preparation


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PREMESSE E oBiETTiViIl trapianto di cellule/precursori staminali neurali(NPCs) protegge il sistema nervoso centrale (SNC)da danni di natura infiammatoria. Inoltre, dati recentidimostrano che alcune delle funzioni delle NPCs –fra cui la loro funzione immunoregolatoria – richie-dono complessi e sofisticati meccanismi di comu-nicazione tra cellule. Se da un lato è noto chequesta comunicazione dipende in parte da citochi-ne e/o fattori di crescita secreti dalle NPCs, i nostristudi recenti attribuiscono un ruolo chiave ad unnuovo meccanismo di comunicazione tra cellule,mediato dal rilascio di vescicole extracellulari dimembrana (EV) da cellule donatrici a cellule target.Con questo progetto abbiamo voluto definire sequesto meccanismo di comunicazione tra cellulevenga utilizzato anche dalle NPCs e ne abbiamo,inoltre, fornito una caratterizzazione a livello mole-colare al fine di aprire la strada ad innovativi ap-procci terapeutici.

RiSULTATiI dati che abbiamo ottenuto mostrano che le celluleNPCs secernono le EVs, che sono composte preva-lentemente da esosomi. Abbiamo, inoltre, osservatol’esistenza di una nuova via di segnale regolata dacitochine che indirizza specifiche proteine ed RNAverso le vescicole EV. Utilizzando la tecnica “Next ge-

neration small RNA-Seq” abbiamo individuato un to-tale di 39 microRNA (miRNAs) esosomali, di cui unaparte è espressa, in risposta a citochine, nelle NPCse/o nelle vescicole EV. Inoltre, attraverso il test “dual

luciferase reporter assay” abbiamo anche dimostratoche i miRNA secreti mantengono la loro attività bio-logica quando sono trasferiti ad altre cellule. In modoanalogo abbiamo anche studiato l’espressione dimRNA attraverso la tecnica next generation long

RNA-Seq, individuando un gruppo (cluster) di genicon funzioni legate alla risposta immunitaria, esclu-sivamente espressi nelle NPCs, nelle vescicole EV enegli esosomi derivati da NPCs precedentementetrattate con citochine di tipo Th1. Questo dato sug-gerisce che in risposta alla stimolazione con citochi-ne di tipo Th1 le NPCs sono in grado di indirizzareverso le EVs dei componenti di pathways specificiattivati dalle citochine.Inoltre, applicando una serie di approcci bioinfor-matici, analisi computazionali e tecniche di imaging

ad alta risoluzione siamo strati in grado di dimostra-re che le vescicole EV rilasciate dalle staminali sonoin grado di recapitare il complesso IFN-�/Ifngr1 acellule target.Con questo studio abbiamo confermato la proprietàintrinseca delle EVs di inviare segnali e, allo stessotempo, abbiamo scoperto che il complesso IFN-�/Ifngr1 media un nuovo meccanismo di comunica-

RNa non codificanti a plasticità terapeutica delle cellulestaminali neurali

Stefano PluchinoDepartment of clinical Neurosciences, Wellcome trust-Medical Research council Stem cell InstituteUniversity of cambridge clifford allbutt building - cambridge biosciences campus, cambridge UK

collaboRatoRI:Chiara Cossetti, Nunzio iraci, Tommaso Leonardi, Diana Breitmaier

collaboRazIoNI coN altRI GRUppI:Jose Manuel Garcia-Verdugo, University of Valencia, SpainSuresh Mathivanan, la trobe University, australiaAngela Bachi, IFoM - FIRc Institute of Molecular oncology, ItalyAnton J. Enright, the EMbl-European bioinformatics Institute,Wellcome trust Genome campus, Hinxton, UKJohn S. Mattick, the Garvan Institute, australia

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zione tra cellule che le staminali neurali trapiantatepotrebbero potenzialmente usare per scambiare se-gnali con il sistema immunitario.Infine, abbiamo messo a punto un nuovo approccioterapeutico basato su RNAi che è potenzialmenteapplicabile in vivo, in modelli sperimentali di sclerosimultipla. Portando avanti questo studio con il sup-porto di FISM, con l’obbiettivo di arrivare a nuoveterapie per la sclerosi multipla (SM), il mio labora-torio ha anche iniziato ad usare le nanostrutturepRNAs (packaging RNA nanostructures) per som-ministrare direttamente miRNAs o siRNAs, traendoispirazione dal contenuto terapeutico delle EVs.

CoNCLUSioNiQuesto studio ci ha permesso di chiarire un nuovomeccanismo di scambio d’informazione tra cellule,e dimostra che i segnali in risposta alle citochine,mediati da esosomi, sono un importante meccani-smo attraverso il quale le NPC possono esercitare leloro funzioni immunoregolatorie. Fornendo una mag-giore e più dettagliata comprensione dei meccanismidi scambio d’informazione che le cellule staminalistabiliscono dopo il trapianto, siamo fiduciosi di farepassi avanti verso la completa comprensione alla ba-se della plasticità terapeutica delle cellule staminali,con l’obiettivo di tradurre la conoscenza acquisita interapie cliniche innovative per la SM.

COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSNeural stem/precursor cell (NPC) transplantationprotects the central nervous system from inflamma-tory damage. Recent evidence demonstrates thatsome of the NPC functions, including the immuneregulation require sophisticated mechanisms of in-tercellular communication. While some communica-tion is delivered by secreted cytokines and/orgrowth factors, our recent work suggests that a keyrole might be attributed to a novel mechanism of in-tercellular communication through the transfer of se-creted extracellular membrane vesicles (EVs) fromdonor to recipient cells. Here we have focused ondefining whether this form of communication existsfor NPCs, and on elucidating its molecular signatureand opening new perspectives of therapeutic rele-vance.

RESULTSOur current data suggest that NPCs secrete EVs pri-marily comprised of exosomes and we observe novelcytokine-regulated pathways that sort proteins andRNAs into these vesicles. Small RNAseq has revealed39 exosomal microRNAs (miRNAs), and we identifieda small set of miRNAs whose expression in NPCsand/or secretion within exosomi (EXOs)/EVs re-sponds to cytokine stimulation. Importantly, wedemonstrated through dual luciferase reporter as-says that secreted miRNAs retain their functional po-

tential when transferred to target cells. On the otherhand, long RNA sequencing (RNA-seq) revealed acluster of pathways related to the Immune Response

category that is over-represented in Th1 NPCs, Th1EVs and Th1 EXOs only, thus suggesting that follow-ing Th1 stimulation NPCs are able to traffic severalcytokine-specific response pathways in EVs.Furthermore, using a series of bioinformatic tech-niques, computational analyses and sophisticatedhigh resolution imaging techniques, we havedemonstrated that stem cell EVs deliver functionalIFN-�/Ifngr1 complexes to target cells. While con-firming the intrinsic signalling properties of EVs, ourstudy identifies a novel mechanism of intercellularcommunication regulated by IFN- �/IFNGR1 com-plex, which stem cell grafts may use to signal to thehost immune system. Finally we set-up a novelRNAi-based therapeutics potentially able to beused in vivo in animal model of multiple sclerosis(MS). As follow up of the knowledge gained underthe auspice of FISM in the present project, my labhas started using packaging RNA (pRNA) nanos-tructures to deliver miRNAs or siRNAs inspired bythe contents of therapeutic EVs.

CoNCLUSioNSOur study sheds new light on the mechanisms oftranscellular information exchange and demonstratesthat cytokine-regulated exosome signalling is an im-

Noncoding RNas and therapeutic plasticity of neuralstem cells

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portant pathway by which NPCs may mediate theirimmune functions. Helping to elucidate and fully de-fine the cellular signaling that stem cells establish af-ter transplantation will support an understanding of

the definitive mechanisms underlying stem cell ther-apeutic plasticity, with the visionary focus of translat-ing the knowledge of basal stem cell functions intoinnovative high-impact clinical therapeutics for MS.



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COMPENDIO 2015

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PREMESSE E oBiETTiViIl Fattore di Necrosi Tumorale (TNF) è un importantemediatore della risposta immunitaria ed è stato im-plicato nella fisiopatologia di malattie infiammatorieacute e croniche, inclusa la sclerosi multipla (SM).Il TNF agisce attraverso due recettori distinti: il re-cettore 1 del TNF (TNFR1), che media le attività pro-infiammatorie del TNF, e il TNFR2, che è coinvoltonei processi neuroprotettivi e rimielinizzanti. Il du-plice ruolo del TNF potrebbe spiegare il peggiora-mento della malattia in persone con sclerosimultipla sottoposte ad una terapia che blocca ilTNF in maniera non selettiva e ha stimolato lo svi-luppo di composti che inibiscono o stimolano inmaniera specifica i singoli recettori del TNF. Nono-stante la validità di questo potenziale approccio te-rapeutico sia stata recentemente dimostrata inmodelli sperimentali di SM, la regolazione e la fun-zione di TNFR1 e TNFR2 nelle cellule del sistemanervoso centrale (SNC) in risposta ad un danno nonè stata ancora studiata. In uno studio precedentefinanziato da FISM abbiamo dimostrato che in cel-lule della microglia in coltura l’espressione di TNFR2aumenta in risposta a differenti stimoli pro-infiam-matori e che il TNF, attraverso la stimolazione delTNFR2, induce l’espressione di molecole con atti-vità anti-infiammatoria e neuroprotettiva. Al fine dicomprendere se la microglia possa essere uno deibersagli cellulari dei composti in grado di bloccareo attivare selettivamente uno dei due recettori delTNF, abbiamo valutato l’espressione di TNFR1,TNFR2 e molecole di origine macrofagica/micro-gliale con attività pro- o anti-infiammatoria in unmodello ex vivo di demielinizzazione e rimielinizza-zione del SNC e in tessuto cerebrale post-mortemdi pazienti affetti da SM, ottenuto da “UK MultipleSclerosis Tissue Bank”.

RiSULTATii) Esperimenti effettuati su fettine organotipiche dicervelletto di topo hanno dimostrato che in seguitoa demielinizzazione indotta da lisolecitina, l’espres-sione del gene e della proteina di TNFR2, ma nondi TNFR1, viene significativamente stimolata. L’ele-vata espressione di TNFR2 unitamente a quella dimolecole che definiscono un fenotipo prevalente-mente anti-infiammatorio della microglia (fenotipoM2), come IL10, arginasi-1, G-CSF e adrenomedul-lina, persiste anche durante la fase di rimielinizza-zione. In questo modello ex-vivo, l’attivazione diTNFR2 tramite un anticorpo agonista selettivo è ingrado di stimolare il differenziamento degli oligo-dendrociti e indurre ulteriormente l’espressione del-le molecole sopra menzionate.ii) Studi di immunoistochimica in sezioni di tessutocerebrale di pazienti affetti da SM hanno rivelatouna elevata espressione di TNFR2 nella microgliaattivata in aree della sostanza bianca con mielinapreservata, e in macrofagi fagocitanti mielina in le-sioni acute della sostanza bianca. Combinandotecniche di microdissezione laser con tecniche diRT-PCR quantitativa, sono stati determinati livellisignificativamente più elevati di trascritti di TNFR2,ma non di TNFR1, unitamente a quelli dei marcatoridi microglia/macrofagi, quali CD68, MHC di classeII e TREM2, in entrambe le aree intraparenchimalirispetto alla sostanza bianca non patologica.L’analisi statistica ha rivelato una forte correlazionetra i trascritti di TNFR2 e quelli di CD68, MHC diclasse II e TREM2, sostenendo il coinvolgimento diquesto recettore nella risposta funzionale di micro-glia e macrofagi. Tra i diversi geni pro- e anti-in-fiammatori analizzati, l’espressione di IL10 risultasignificativamente aumentata nelle lesioni acute,mentre un aumento del segnale per IL1-beta è sta-

Studio del ruolo dei recettori del tNF durante i processidi demielinizzazione e rimielinizzazione

Cristina AgrestiDipartimento di biologia cellulare e Neuroscienze, Istituto Superiore di Sanità, Roma

collaboRatoRI:Caterina Veroni, Barbara Rosicarelli, Barbara Serafini, Francesca Aloisi

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to trovato sia nelle lesioni acute che nella sostanzabianca preservata ma con diffusa attivazione mi-crogliale.

CoNCLUSioNiI risultati di questo studio dimostrano che l’attiva-zione di TNFR2 è coinvolta nella risposta neuropro-

tettiva/anti-infiammatoria della microglia in seguitoa demielinizzazione. Questi risultati possono aiutarea comprendere il meccanismo di azione delle nuoveterapie che hanno come bersaglio il sistemaTNF/TNFR con lo scopo di promuovere la compo-nente pro-rimielinizzante e neuroprotettiva dell’in-fiammazione.

COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSTumor necrosis factor (TNF) is a key mediator of theimmune response and has been implicated in thepathophysiology of acute and chronic inflammatorydiseases, including multiple sclerosis (MS). TNF actsthrough two distinct receptors: TNF receptor 1 (TN-FR1), which mediates the pro-inflammatory activitiesof TNF, and TNFR2, which has been involved in neu-roprotective and remyelinating processes. The dualrole of TNF could explain the disease-activating ef-fect of non-selective anti-TNF therapy in MS pa-tients and has stimulated the development ofcompounds that specifically inhibit or stimulate in-dividual TNFRs. Although the validity of this poten-tially therapeutic approach has been recentlyverified in MS-like disease models, the regulationand function of TNFR1 and TNFR2 in specific cen-tral nervous system (CNS) cell types in response toinjury has not been investigated yet. In a previousstudy funded by FISM, we demonstrated that cul-tured microglia up-regulate TNFR2 expression in re-sponse to different pro-inflammatory stimuli and thatTNF/TNFR2 signaling controls the microglial expres-sion of molecules with anti-inflammatory and neu-roprotective function. To verify whether microgliacould be one of the cellular targets for TNFR selec-tive compounds, we assessed the expression of TN-FR1 and TNFR2 together with that of pro- andanti-inflammatory/neuroprotective molecules in anex vivo model of CNS demyelination/remyelinationand in post-mortem brain tissue of MS patients sup-plied by the UK Multiple Sclerosis Tissue Bank.

RESULTSi) Experiments in organotypic mouse cerebellarslices showed that TNFR2, but not TNFR1, tran-

script and protein are markedly up-regulated follow-ing lysolecithin-induced demyelination. High ex-pression of TNFR2 persisted also during theremyelination phase, together with that of mole-cules, such as IL10, arginase-1, G-CSF andadrenomedullin, that mediate the anti-inflammato-ry/neuroprotective functions of microglia (M2 phe-notype). In this ex-vivo model, activation of TNFR2with a selective agonistic antibody promoted oligo-dendrocyte differentiation and enhanced further theexpression of the above mentioned molecules.ii) Immunohistochemical studies in MS brain sec-tions revealed high expression of TNFR2 in activat-ed ramified microglia in white matter areas withpreserved myelin and in foamy macrophages in ac-tively demyelinating white matter lesions. By com-bining laser capture microdissection with real timeRT-PCR, significantly higher levels of TNFR2, butnot TNFR1 transcripts, and of themicroglia/macrophage markers CD68, MHC classII and TREM2, were detected in both intra-parenchymal areas compared to the non-patholog-ical white matter. Statistical analysis revealed astrong correlation between TNFR2 and CD68,MHC class II and TREM2 transcripts, supportingthe involvement of this receptor in the functionalresponse of microglia/macrophages. Among sev-eral pro- and anti-inflammatory genes analyzed,IL10 was markedly upregulated in actively demyeli-nating lesions, while an increase in IL1-beta wasfound in both acute lesions and myelinated whitematter with widespread microglia activation.

CoNCLUSioNSTaken together these data demonstrate that TNFR2activation is involved in the anti-inflammatory/neu-

Studies on tNF receptor signalling during demyelinationand remyelination

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roprotective response of microglia during demyeli-nation and remyelination. This knowledge may helpunderstand the mechanism of action of new thera-

pies that target the TNF/TNFR system with the aimto promote the pro-remyelinating and neuroprotec-tive components of inflammation.



Veroni C, Eleuteri C, Rosicarelli B, Serafini B, Aloisi F, Agresti C. Regulation of tumor necrosis factor receptors during demyelination and remyelination.29th Congress of the European Committee for Research and Treatment in Multiple Sclerosis (ECTRIMS) and the 18th Annual Conference of Rehabilitationin MS (RIMS) in Copenhagen, Denmark, 2– 5 October, 2013

Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2011 per un periodo di 2 anni (prorogato di 2 mesi) e l’ammontaredi 117.600 €

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PREMESSE E oBiETTiViLe cellule che formano la mielina, i precursori deglioligodendrociti (OPC) e i periciti, cellule coinvoltenella organizzazione della unità neuro-vascolare(UNV), condividono l’espressione di Nerve/glial an-tigen 2 (NG2), una molecole espressa sulla membra-na cellulare. Poiché, le OPC sono indicate comecruciali nei fenomeni di riemielinizzazione e sono at-tive prevalentemente nelle fasi iniziali della sclerosimultipla (SM) e i periciti sono coinvolti nel manteni-mento dell’integrità strutturale della barriera emato-encefalica (BEE) e nel controllo dell’extravasazionedelle cellule immunitarie nel sistema nervoso cen-trale (SNC), noi abbiamo ipotizzato che NG2 potes-se essere coinvolto nei meccanismi patogeneticidella malattia.Lo scopo del progetto è quello di esplorare il ruolodi NG2 nello sviluppo della patologia. Pertanto cisiamo proposti di studiare il modello murino di SM,l’Encefalomielite Sperimentale Autoimmune (ESA),indotta in topi geneticamente modificati che nonesprimono NG2 (NG2KO) e abbiamo caratterizzatogli aspetti immunitari e gli aspetti generali del SNC.Al fine di analizzare il ruolo di NG2 nella patogenesidell’ESA, abbiamo caratterizzato i meccanismi at-

traverso i quali la mancanza di NG2 modifichi il de-corso dell’ESA, in particolare i nostri obiettivi erano:indagare la cito-architettura del SNC in topi NG2KOsani e affetti da ESA, concentrandosi in particolaresulla BEE e sulle OPC; valutare il ruolo di NG2 nellarisposta immunitaria nei topi NG2KO sani e affettida ESA.

RiSULTATiI nostri esperimenti hanno dato prova che i topiNG2KO, in cui è stata indotta l’ESA, sviluppano unasintomatologia clinica meno aggressiva rispetto aitopi di controllo, con parametri infiammatori delSNC e danni a carico della mielina ridotti. In termininumerici in condizioni fisiologiche, il numero di OPCtra il topo NG2KO e quello di controllo non differi-sce, mentre il forte calo apprezzato nei topi control-lo affetti da ESA non si è verificato nei topi NG2KOaffetti da ESA.Durante l’ESA nei topi di controllo, la BEE viene amodificarsi; in modo inaspettato, invece, la BEE deltopo NG2KO è risultata essere modificata sia neitopi sani che affetti da ESA, in particolare durantele fasi di malattia la BEE del topo NG2KO risulta es-sere riorganizzata come in un topo sano di control-

Studio di un modello murino transgenico perla caratterizzazione del proteoglicano NG2/cSpG4nella patogenesi della sclerosi multipla

COMPENDIO 2015

Antonio UccelliDipartimento di Neuroscienze, Riabilitazione, oftalmologia, Genetica, e Scienze Materno-Infantile,(DINoGMI) - Università degli Studi di Genova, Genova

collaboRatoRI:Giovanni Ferrara, Sara Morando, Simona Casazza

collaboRazIoNI coN altRI GRUppI:Roberto Furlan, Unità di Neuroimmunologia clinica - Dibit- Istituto ScientificoSan Raffaele, MilanoCaterina Bendotti, Dipartimento Neuroscienze, Istituto di Ricerche FarmacologicheMario Negri, MilanoDaniela Virgintino, Dipartimento di anatomia Umana e Istologia, Universitàdegli Studi di bari, bariRoberto Perris, Dipartimento di anatomia e biologia cellulare, coMt – centroMolecolare e traslazionale di oncologia, Università degli Studi di parma, parma

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iNTRoDUCTioN AND AiMSNerve/glial antigen 2 (NG2) is a chondroitin sulphateproteoglycan with a large extracellular domain anda short cytoplasmic tail, expressed in a class ofcells throughout the developing and adult centralnervous system (CNS). In particular, it is expressedpredominantly in oligodendrocyte precursor cells(OPC) that serve as the primary source of remyeli-nating cells in demyelinated lesions, and on peri-cytes, components of the blood-brain barrier (BBB)that are implicated in the maintenance of its integri-

ty and are likely involved in extravasation of inflam-matory cells. Because NG2 expressing OPC havebeen involved in remyelination occurring after CNSdamage and pericytes are implied in the integrity ofthe blood brain barrier (BBB) which limits CNS infil-tration of immune cells, we have hypothesized thatthe lack of NG2 could influence the outcome of Ex-perimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), amouse model of MS, possibly impacting in thehoming of immune cells into the CNS and theprocess of demyelination and remyelination. Thus,

Exploitation of a transgenic mouse model for the unveilingof the role of proteoglycan NG2/cSpG4 in the pathogenesisof multiple sclerosis


lo. Inoltre, abbiamo dimostrato che la BEE, nel topoNG2KO affetto da ESA, modificata strutturalmenteassolve alla propria funzione di barriera. Questo, al-meno in parte, potrebbe riflettere il grado minore diinfiltrazione e infiammazione visto nel SNC dei topiNG2KO affetti da ESA. Abbiamo dimostrato per laprima volta che, in aggiunta ai macrofagi e le celluledendritiche (DC), NG2 è espresso anche sui linfocitiT del topo di controllo. Pertanto, la mancanza diespressione di NG2 potrebbe alterare alcune fun-zioni delle cellule immunitarie e quindi modificare ildecorso dell’ESA nei topi NG2KO. Le cellule den-dritiche attivate del topo NG2KO hanno mostratouna minore produzione IL-12, una citochina chiaveper l’inizio della risposta immunitaria. Al contrario,la mancanza di NG2 sui macrofagi non ha influen-zato il loro stato di attivazione, come dimostratodall’analisi di alcuni marcatori specifici. Abbiamo in-vece dimostrato che la mancanza di NG2 sui linfo-citi T è principalmente associata ad un aumento diproduzione di IL-4 e IL-10 e diminuzione della pro-duzione di IFNγ, suggerendo che i linfociti T del topoNG2KO possano avere un profilo pro-infiammatoriominore.Per analizzare il ruolo di NG2 nella complessa inte-razione tra il SNC e le cellule immunitarie duranteESA, abbiamo eseguito esperimenti sui topi chime-rici, ossia topi in cui il SNC esprime NG2 ma il siste-ma immunitario no e viceversa. Abbiamo dimostratoche l’assenza di NG2 nel sistema immunitario rifletteuna sintomatologia clinica più mite rispetto a quan-do il sistema immunitario esprime NG2, suggerendo

quindi un ruolo cruciale di NG2 nel sistema immuni-tario.

CoNCLUSioNiIl modello animale di SM, ESA è una malattia infiam-matoria autoimmune del SNC caratterizzata da unarisposta cellulo-mediata di tipo Th1, e l’antigenechiave di malattia viene presentato dalle celluledendritiche ai linfociti T naive. Una delle molecolapiù importanti prodotta dalle cellule dendritiche ingrado di indirizzare una risposta Th1, è IL-12. Infatti,topi geneticamente modificati che non sono in gra-do di produrre IL-12 non sviluppano l’ESA, in quan-to non sono in grado di evocare una rispostacellulo-mediata di tipo Th1. Pertanto questo mec-canismo è cruciale in qualsiasi risposta immunitariasia nell’ESA, sia in persone con SM.I nostri risultati, hanno evidenziato che le celluledendritiche del topo NG2KO, rispetto al topo dicontrollo, producono livelli ridotti di IL-12, che po-trebbero condizionare una minore risposta cellulo-mediata di tipo Th1; inoltre, i linfociti T del topoNG2KO producono livelli aumentati di IL-4 e IL-10e diminuiti di IFNγ rispetto al topo di controllo. Sullabase dei nostri risultati, suggeriamo che NG2 po-trebbe essere parte di un nuovo meccanismo pato-genetico e che i sintomi clinici minori dell’ESAriscontrati nel topo NG2KO potrebbero essere in-terpretati come una minore risposta autoimmunita-ria in combinazione con un BEE rinforzata e unamaggiore presenze di OPC nel SNC del topoNG2KO.

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this project was aimed to investigate the role ofNG2 in the development and progression of EAEthrough the utilization of the transgenic NG2KOmouse model. In order to dissect the role of NG2 inEAE pathogenesis we addressed the mechanismsthrough which the lack of this molecule protectsmice from EAE and our objectives were: investigatethe cytoarchitecture of NG2KO CNS in naïve andEAE-affected mice at the histological level, focusingon the BBB and myelin formation; evaluate the roleof NG2 in the immune response in naïve and EAE-affected mice; dissect the different roles of NG2-ex-pressing cells in EAE pathogenesis.

RESULTSWe have demonstrated that NG2KO mice developmilder EAE than their wild-type (WT) counterparts,with reduced inflammation and demyelination. Whilethe number of OPC do not differ between NG2KOand WT mice in physiological conditions, the sharpdecrease seen in WT mice affected with EAE did notoccur in NG2KO mice, suggesting reduced OPCdeath in these mice. The BBB was altered in bothhealthy and EAE affected NG2KO mice, with re-arrangement of brain and spinal cord microvesselmolecules and a reversal to the healthy WT profile inEAE-affected NG2KO mice. Interestingly, the BBBwas not leaky in naïve or EAE affected NG2KO mice,which might reflect the lower extent of infiltration andinflammation seen in the CNS of the diseased mice.At the immune cell level, we show for the first timethat, in addition to macrophages and dendritic cells(DCs), NG2 is also expressed on T cells in naïve WTmice. Thus, lack of NG2 expression might impairsome immune cell functions, hence accounting forthe milder EAE in NG2KO mice. Activated dendriticcells from NG2KO mice showed impaired productionof IL-12, a key cytokine in the antigen presentation

process, at mRNA and protein levels. In contrast, thelack of NG2 on NG2KO macrophages did not affecttheir phenotypic status, as shown by analysis of spe-cific markers upon in vitro M1/M2 polarization ofNG2KO. We showed that the lack of NG2 on T cellsis associated mainly with a high increase in IL-4 andIL-10 expression after MOG challenge, and decreasein IFNγ expression, suggesting NG2KO T cells havea less pro-inflammatory profile. To analyze the role ofNG2 in the complex interplay between CNS and im-mune cells in EAE, we have performed chimera ex-periments which have showed milder EAE uponreconstitution of WT mice with NG2KO immune cells,suggesting a role for NG2 in immune cell function.

CoNCLUSioNSEAE is a Th1 cell-mediated, inflammatory disease ofthe CNS, and the key antigen presenting cells thattrigger the activation of naïve T cells efficiently arethe DCs. The main cytokine inducer of Th1 differen-tiation is IL-12 produced by DC and mice knockoutfor IL-12 are not susceptible to EAE, as they are in-capable of eliciting a Th1 autoimmune response. Soimpairment of IL-12 expression plays a relevant rolein tolerance during the autoimmune response in EAEand in MS also. In this project, we demonstratedthat DCs from NG2KO mice produce reduced levelsof IL-12, which could affect the polarizing signal fornaïve T cells toward Th1; accordingly, the lack ofNG2 on T cells is associated with an increase in IL-4 and IL-10 production and decrease in IFNγ expres-sion of these cells. So we suggest that the NG2could be a new actor of a pathogenic mechanismand milder EAE upon active induction of NG2KO im-mune cells results from a decreased autoimmune re-sponse, in combination with a reinforced BBB andreduced OPC death in NG2KO mice.

COMPENDIO 2015


Ferrara G, Morando S, Girolamo F, Errede M, Boldrin V, Casazza S, Panini N, Erba E, Perris NR, Furlan R, Bendotti C, de Rosbo K, Virgintino D, UccelliA. Lack of NG2 expression on immune cells skews the immune response towards a less proinflammatory profile, resulting in milder EAE in NG2KO mice.Manuscript in preparation

Ferrara G, Morando S, Girolamo F, Errede M, Boldrin V, Casazza S, Panini N, Erba E, Perris NR, Garzetti L, Furlan R, Bendotti C, de Rosbo K, VirgintinoD, Uccelli A. Lack of NG2 expression on immune cells and oligodendrocytes progenitor cells modulates EAE phenotype. 12th International Congress ofNeuroimmunology, Mainz 9-13 November 2014

Ferrara G, Morando S, Girolamo F, Errede M, Boldrin V, Casazza S, Perris NR,. Furlan R, Bendotti C, de Rosbo K, Virgintino D, Uccelli A. Possible roleof nerve-glial antigen 2 (NG2) in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. 15th World’s Congress of Immunology (ICI), Milano22-27 Agosto 2013

Progetto di ricerca finanziato con il Bando 2011 per un periodo di 1 anno (prorogato di 1 anno) e l’ammontaredi 30.000 €

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PREMESSE E oBiETTiViLa stimolazione transcranica a corrente diretta (tD-CS) è una metodica di neuromodulazione non inva-siva con effetti immunomodulanti riportati in modellipreclinici di malattie neurologiche. Questa tecnicanon invasiva è basata sull’applicazione di una cor-rente elettrica costante di debole intensità e può es-sere utilizzata in ambito clinico, in quanto sicura eindolore. Lo scopo del presente progetto è stato va-lutare gli effetti della tDCS nel modello murino di SM(EAE).

RiSULTATiAbbiamo applicato la tDCS su un totale di 40 topicon EAE suddivisi in 4 gruppi da 10 ciascuno: sti-molazione catodica, anodica, sham (solo aneste-sia), più un gruppo aggiuntivo di 10 animali chesono stati unicamente sottoposti a immunizzazionee valutazione del punteggio di gravità clinica, al finedi verificare che la nostra procedura non avesse unimpatto negativo sullo sviluppo della EAE. Il pun-teggio clinico nei topi EAE è stato calcolato fino a

26 giorni dopo l’immunizzazione. L’esperimento èstato suddiviso in due sotto-esperimenti da 20soggetti ciascuno. Anche se entrambi i gruppi di sti-molazione t-DCS hanno mostrato uno punteggio dimalattia tendenzialmente più basso rispetto al grup-po sham, quest’ultimo con decorso di malattia ten-denzialmente più grave del gruppo di controllo,differenze significative rispetto al gruppo sham sonostate osservate esclusivamente per il gruppo con t-DCS catodica, con un ritardo nell’esordio di malat-tia (p=0.0077 log rank, curva di Kaplan Meyer) e unpunteggio di gravità di malattia più basso al giorno4 dopo l’esordio nel gruppo sham, corrispondentecirca al picco di malattia di quest’ultimo (p=0.0014;t di student per dati non appaiati).

CoNCLUSioNiQuesti risultati promettenti suggeriscono l’opportu-nità di esplorare ulteriormente l’utilità della tDCScatodica nel ritardare e ridurre la gravità del dannocerebrale autoimmune, come nel caso di personecon SM attiva, con possibili ricadute terapeutiche.

Stimolazione cerebrale transcranica a corrente direttacome terapia immunomodulante nella SM: studio pilotain modelli murini

Letizia LeocaniINSpE-Istituto Neurologia Sperimentale, ospedale San Raffaele, Milano

collaboRatoRI:Roberto Furlan, Annamaria Finardi, Roberto Santangelo, Valerio Castoldi,Loris Camaleonti, Gianvito Martino, Giancarlo Comi

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COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSPromising immunomodulatory effects of transcra-nial direct current stimulation (tDCS) have been re-ported in preclinical models of neurologicaldiseases. This non-invasive technique is based onthe application of a weak, constant direct current tothe scalp via two electrodes and can be applied inthe clinical setting, being safe and painless. The aimof the present project was to explore the effects oftDCS in the EAE mouse model of MS.

RESULTSWe performed tDCS on a total of 40 mice with theexperimental model of MS (EAE) subdivided in 4groups of 10 subjects each: cathodal, anodal, sham(anesthesia only) stimulation, plus an extra group of10 animals just undergoing EAE immunization andscoring, to verify that our experimental proceduredid not negatively impact on the development ofEAE. Clinical EAE scoring was quantified up to 26

days post injection. The experiment was subdividedinto two sub-experiments involving 20 animalseach. Although both tDCS stimulation groupsshowed a tendency towards lower EAE score com-pared with the sham group, the latter with a tenden-cy to a more severe disease compared with thecontrol group, significance on early EAE scores andon EAE onset was found for cathodal tDCS only,being associated with a delay in EAE onset with re-spect to sham (p=0.0077 log rank; kaplan-meyercurve) and a lower EAE score at day 4 post EAE on-set, around the disease peak in the sham group(cathodal vs sham: p=0.0014; unpaired t).

CoNCLUSioNSThese results are promising towards further explo-ration of the use of cathodal tDCS in reducing braininflammatory activity after induction of autoimmunebrain disease, such as the case of active MS, witha strong therapeutic impact (Proximity to cure).

brain tDcS as a disease-modifying treatment of MS:a pilot study in mice models


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PREMESSE E oBiETTiViLa produzione di citochine e chemochine pro-infiam-matorie gioca un ruolo fondamentale nella fisiopato-logia della sclerosi multipla (SM) compromettendol’integrità della barriera emato-encefalica, reclutandocellule immunitarie dalla periferia e contribuendo al-l’attivazione della microglia. Sebbene diverse celluleall’interno del sistema nervoso centrale possonocontribuire alla produzione di citochine e chemochi-ne, i linfociti T autoreattivi hanno un ruolo fondamen-tale nella demielinizzazione infiammatoria. Diversifarmaci terapeutici utilizzati come prima linea di trat-tamento della SM, come IFN-beta o glatiramer ace-tato, esercitano alcuni effetti sui linfociti T autoreattivi,ma spesso non riescono a mostrare sufficiente effi-cacia clinica e sono poco attivi nelle fasi progressivedella malattia. Inoltre, la maggior parte delle attualistrategie terapeutiche è finalizzata all’inibizione deisegnali attivati dal recettore T per l’antigene (TCR),compromettendo così la capacità dei linfociti T dicombattere le infezioni e/o di controllare lo sviluppotumorale. Così, l’identificazione di molecole stimola-torie e delle vie di segnalazione associate, diversedal TCR, che possano contribuire al fenotipo infiam-matorio dei linfociti T periferici in pazienti con SM,può essere utile per lo sviluppo di nuove terapie im-munosoppressive non antigene-specifiche.Il CD28 può essere considerato uno dei più impor-tanti recettori costimolatori necessari per la com-pleta attivazione dei linfociti T. Inoltre, il CD28 èanche in grado di regolare la produzione di citochi-

ne e chemochine pro-infiammatorie e lo sviluppo el’omeostasi delle cellule T regolatorie (Treg) con at-tività soppressiva.L’obiettivo principale del nostro progetto è statoquello di individuare le vie di segnalazione attivatedal CD28, sia nei linfociti T sia nelle cellule Treg inpazienti con SM, la cui inibizione può spegnere larisposta infiammatoria dei linfociti T e ripristinare latolleranza immunologica.In particolare, gli obiettivi specifici del nostro lavorosono stati quelli di:• caratterizzare il ruolo della fosfatidilinositolo 3 chi-nasi (PI3K) nelle vie di segnalazione del CD28 cheregola l’espressione genica di citochine e chemo-chine pro-infiammatorie nei linfociti T CD4+;• caratterizzare le vie di segnalazione PI3K-dipen-denti e i bersagli indotti dalla stimolazione del CD28nei linfociti T CD4+ isolati da pazienti affetti da SM;• valutare il ruolo del CD28 e della PI3K nelle celluleTreg isolate da pazienti affetti da SM.

RiSULTATiIn questo studio, abbiamo valutato il contributo delCD28 nella regolazione delle risposte pro-infiamma-torie nella SM recidivante-remittente (SMRR) e ab-biamo esaminato le differenze qualitative e/oquantitative tra persone con SMRR e soggetti sani(HD). A tal fine, sono stati arruolati 20 pazienti SMRR,identificati clinicamente secondo i criteri di McDo-nald, e 10 donatori sani. Abbiamo confrontato il livel-lo di espressione genica e secrezione di citochine e

caratterizzazione delle vie di segnalazione del cD28come bersagli terapeutici nella regolazione della tolleranzaimmunologica nella sclerosi multipla

Loretta TuostoDipartimento di biologia e biotecnologie charles Darwin, Sapienza Università di Roma, Roma

collaboRatoRI:Enza Piccolella, Cristina Camperio, Michela Muscolini, Silvana Caristi

collaboRazIoNI coN altRI GRUppI:Marco Salvetti, Dipartimento di Neuroscienze, Salute Mentale e organi di Senso,ospedale Sant’andrea, Sapienza Università di Roma, RomaClaudio Gasperini, U.o. Neurologia, ospedale San camillo, RomaLuca Battistini, laboratorio di Neuroimmunologia, IRccS Fondazione Santa lucia, Roma

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chemochine pro-infiammatorie nei linfociti T CD4+

isolati dal sangue periferico di pazienti e HD. I risultatiottenuti hanno evidenziato che la stimolazione delCD28 aumentava fortemente e selettivamentel’espressione di diverse citochine pro-infiammatorie(IL-6, IL-8, IL-21, IL17A) nei linfociti T di pazientiSMRR stabili, rispetto agli HD. È interessante notareche le citochine selettivamente indotte dal CD28 neilinfociti T delle persone SMRR, ma non HD, (IL-6, IL-21 e IL-17A) erano specifiche per il fenotipo delle cel-lule Th17 e corrispondevano a quelle i cui livelli sonopiù alti nella SMRR durante le riacutizzazioni o rica-dute.Utilizzando farmaci inibitori selettivi, abbiamo sco-perto che il blocco della PI3K di classe 1 inibiva si-gnificativamente l’espressione genica di tutte lecitochine prodotte. Questi dati suggeriscono forte-mente che il complesso CD28/PI3K può regolarequantitativamente e qualitativamente i profili di cito-chine prodotte dai linfociti T pro-infiammatori in baseallo stato fisiopatologico e alla fase della malattia, fa-

vorendo così la progressione della malattia stessa.Per quanto riguarda il ruolo del CD28 nella regola-zione delle cellule Treg, nessuna differenza signifi-cativa è stata osservata tra SMRR e HD, quindi nonabbiamo esplorato ulteriormente questo aspetto.

CoNCLUSioNiI nostri risultati sugli effetti esercitati dagli inibitori del-la PI3K di classe 1 sulle risposte pro-infiammatorieindotte dalla stimolazione del CD28, suggeriscono laPI3K come valido candidato terapeutico per la SMda testare su un gruppo più ampio di persone conSMRR e anche nelle fasi progressive della malattia.Inoltre, la disponibilità di inibitori di PI3K di classe 1attivi in forma orale, alcuni dei quali sono attualmenteutilizzati in studi clinici per la terapia del cancro, in-fiammazione e malattia coronarica (ClinicalTrials.Gov,NIH), può anche aggirare gli effetti collaterali (adesempio l’indurimento della pelle e la lipoatrofia) re-lativi all’infusione o all’iniezione e può mostrare mag-giore aderenza e persistenza a lungo termine.

COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSInflammation is present at all stages of MS and pro-inflammatory cytokine/chemokines play a criticalrole in the pathophysiology of MS by compromisingthe blood-brain barrier integrity, recruiting immunecells from the periphery, and activating resident mi-croglia. Although several cells within the centralnervous system may contribute to the productionof pro-inflammatory cytokines and chemokines, ac-tivated autoreactive T cells have a pivotal role in in-flammatory demyelination. Several therapeuticdrugs used for the first-line treatment of MS, i.e.IFN-beta or galtiramer acetate, exert some effects onself-reactive T lymphocytes, but often fail to exhibitsufficient clinical effectiveness and have very little ef-fects in progressive phases of the disease. Further-more, most of the current therapeutic strategiesfocus on the inhibition of TCR-activating signals, thuscompromising the ability of T cells to fight infectionsand/or to control cancer. Thus, the identification ofstimulatory molecules and associated signallingpathways different from TCR, which may contribute

to the inflammatory phenotype of peripheral T cellsin MS patients, may be useful for the developmentof new antigen non-specific immunosuppressivetherapies.CD28 may be considered one of the most importantcostimulatory receptor necessary for full T cell ac-tivation and for regulating pro-inflammatory cy-tokine/chemokine production as well as thedevelopment and homeostasis of suppressive reg-ulatory T cells (Treg).The main objective of our project was the identifi-cation of the signalling pathways activated by CD28in both peripheral T lymphocytes and Treg cells inMS patients to dampen the pathogenic inflamma-tory T-cell responses and restore immune tolerance.In particular, the specific aims of our work havebeen to:- Characterize the role of phosphatidylinositol 3 ki-nase (PI3K) in CD28 signalling pathways regulatingpro-inflammatory cytokine/chemokine expressionin CD4+ T lymphocytes- Characterize the PI3K-dependent signalling path-

characterization of cD28 signalling pathways as therapeutictargets to regulate immune tolerance in multiple sclerosis

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ways and targets induced by CD28 stimulation inCD4+ T cells isolated from MS patients.- Evaluate the role of both CD28 and PI3K on Tregcells isolated from MS patients.

RESULTSIn this study, we evaluated the CD28 contributionto pro-inflammatory responses in relapsing-remit-ting (RR)MS and examined both qualitative and/orquantitative differences between RRMS patientsand healthy donors (HD). To this end, twenty pa-tients with a clinically defined MS according to theMcDonald criteria were enrolled and ten HD frombuffy coats were used as controls. We comparedthe extent of pro-inflammatory cytokine/chemokinegene expressions and secretion in CD4+ T cells iso-lated from the peripheral blood of RRMS patientsor HD. We found that CD28 stimulation strongly andselectively up-regulated the expression of severalpro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-8, IL-21, IL17A)in stable RRMS T lymphocytes compared to HD. In-terestingly, the cytokines selectively up-regulatedby CD28 in T lymphocytes from RRMS patients butnot HD (IL-6, IL-21 and IL-17A) were related to theTh17 cell phenotype and corresponded to thosespecifically found at higher levels in RRMS patientsduring exacerbations or undergoing a relapse.Finally, we analyzed the contribution of class 1 PI3Kon CD28-induced cytokine expression and produc-tion in T cells from RRMS. By using selective in-

hibitory drug, we found that the blockage of class1 PI3K activity significantly downregulated the geneexpression of all the cytokine analyzed. These datastrongly suggest that CD28/PI3K may differentiallyregulate the cytokine profiles of pro-inflammatory Tlymphocytes both quantitatively and qualitativelydepending on the patophysiological status and onphase of the disease and may affect the pro-inflam-matory activity of T lymphocytes, thus favouringdisease progression.Concerning the role of CD28 in the regulation ofTreg cells, no significant differences were observedbetween RRMS and HD, thus we did not exploredthis aspect further.

CoNCLUSioNSOur results on the inhibitory effects exerted by class1 PI3K inhibitors on the pro-inflammatory respons-es induced by CD28 stimulation, suggest PI3K asa valid therapeutic candidate for MS to be testedon a larger group of RRMS patients and even in theprogressive phases of the disease. Moreover, theavailability of oral active forms of class 1 PI3K in-hibitors, some of which have entered in clinical trialsfor cancer therapy, inflammation and coronary heartdisease (ClinicalTrials.Gov, NIH), may also circum-vent the adverse side effects (e.g. skin indurationsand lipoatrophy) related to infusion or injection andmay exhibit higher adherence and long-term per-sistence.


Colasanti T, Vomero M, Alessandri C, Barbati C, Maselli A, Camperio C, Conti F, Tinari A, Carlo-Stella C, Tuosto L, Benincasa D, Valesini G, Malorni W,Pierdominici M, Ortona E. Role of alpha-synuclein in autophagy modulation of primary human T lymphocytes. Cell Death Dis. 2014 May 29;5:e1265

Camperio C, Muscolini M., Volpe E, Di Mitri D, Mechelli R, Buscarinu MC, Ruggieri S, Piccolella E, Salvetti M, Gasperini C, Battistini L, Tuosto L. CD28ligation in the absence of TCR stimulation up-regulates IL-17A and pro-inflammatory cytokines in relapsing-remitting multiple sclerosis T lymphocytes.Immunol Lett 2014, 158(1-2):134-142

Muscolini M, Camperio C, Capuano C, Caristi S, Piccolella E, Galandrini R, Tuosto L. Phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase activation criticallycontributes to CD28-dependent signaling responses. J Immunol. 2013, 190:5279-86

Tuosto L, Muscolini M, Camperio C, Volpe E, Mechelli R, Ruggieri S, Salvetti M, Gasperini C, Battistini L. CD28 individual signals amplify pro-inflammatorycytokine production in relapsing-remitting multiple sclerosis T lymphocytes. Front. Immunol. 2013, doi:10.3389/conf.fimmu.2013.02.00627

Tuosto L, Muscolini M, Camperio C, Caristi S, Capuano C, Piccolella E, Galandrini R. The recruitment and activation of phosphatidylinositol 4-phosphate5-kinases � critically regulate CD28-dependent signaling responses. Front. Immunol. 2013, doi: 10.3389/conf.fimmu.2013.02.00628

Camperio C, Muscolini M, Caristi C, Picolella E, Battistini L, Salvetti M, Gasperini C, Tuosto L. Characterization of CD28 signalling pathways as therapeutictargets to regulate immune tolerance in multiple sclerosis. Congresso Scientifico Annuale FISM 2014, 28-29 Maggio 2014

Muscolini M, Camperio C, Caristi C, Piccolella E, Battistini L, Salvetti M, Gasperini C, Tuosto L. Characterization of CD28 signalling pathways as thera-peutic targets to regulate immune tolerance in multiple sclerosis. Congresso Scientifico Annuale FISM 2013, 29-30 Maggio 2013


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PREMESSE E oBiETTiViOsteopontina (OPN) è una citochina pro-infiamma-toria espressa ad alti livelli nelle placche demieliniz-zanti di pazienti con sclerosi multipla (SM) e di topicon encefalomielite autoimmune sperimentale(EAS), il modello murino della SM. I topi privi di OPNsviluppano un quadro EAS meno severo rispetto aitopi normali e la somministrazione di OPN a tali topiinduce una ricaduta immediata con successiva evo-luzione verso la forma progressiva. Ciò suggerisceun ruolo importante di OPN nella genesi e nella evo-luzione della SM. OPN è prodotta ad alti livelli nellamatrice extracellulare della barriera ematoencefali-ca: in questa sede potrebbe giocare un ruolo nel re-clutamento dei linfociti attraverso il legame con unsuo recettore, l’integrina �α4β1. Tale recettore è ilbersaglio del farmaco natalizumab, un anticorpomonoclonale umanizzato utilizzato nella terapia del-la SM. OPN è in grado di legare �α4β1 solo dopoaver subito un taglio proteolitico ad opera dellaTrombina, la quale permette la formazione di dueporzioni: l’N-terminale che contiene due siti di lega-me per α4β1 e la C-terminale che contiene un sitodi legame per CD44, recettore coinvolto nell’inibi-zione dell’apoptosi linfocitaria. È noto che il sistemaimmunitario produca in alcune condizioni anticorpineutralizzanti anti-citochina, finalizzati a spegnerela risposta infiammatoria. Anticorpi anti-OPN sonostati rilevati in topi con EAS e il loro titolo aumentain seguito ad immunizzazione con un vaccino aDNA codificante per OPN, con miglioramento delquadro clinico. Lo scopo di questo progetto eraquello di valutare la presenza di anticorpi anti-OPNnella SM e studiare il ruolo di OPN e dei suoi fram-menti nell’EAS

A tale scopo abbiamo: ricercato la presenza di an-ticorpi anti OPN nei pazienti con SM, caratterizzatola porzione di OPN legata e la loro associazione conparametri clinici, valutato il ruolo del frammento N-e C-terminale in vivo nell’EAS e valutato l’efficaciadel vaccino contro OPN nell’EAS.

RiSULTATiAbbiamo ricercato la presenza di anticorpi anti OPNin150 pazienti con SM e 150 soggetti sani di con-trollo: i pazienti presentano valori di autoanticorpisignificativamente superiori rispetto ai controlli. Laforma clinica che presenta i livelli maggiori è la for-ma SM recidivante-remittente rispetto alle formeprogressive (primaria e secondaria). I titoli anticor-pali più alti si riscontrano in fase di remissione ri-spetto a quella di ricaduta. Inoltre, tali anticorpiriconoscono principalmente la porzione C-terminalerispetto a quella N-terminale.Per valutare il ruolo delle due porzioni di OPN (N- eC-terminale) abbiano somministrato tali molecole atopi con EAS durante la fare di remissione. SoltantoOPN intera oppure OPN-C sono in grado di indurreuna ricaduta mentre OPN-N oppure OPN mutata inmodo tale da non poter subire il taglio proteoliticoin N e C, non sono in grado di indurre un peggiora-mento dei sintomi. Tali esperimenti suggerisconoche sia la porzione OPN-C quella coinvolta nelle ri-cadute.Abbiamo quindi prodotto un vaccino con lo scopodi indurre nell’animale una risposta anticorpale an-ti-OPN e valutare se questa potesse migliorare il de-corso della malattia. Il confronto fra la vaccinazioneanti-OPN intera, oppure OPN-N o OPN-C ha mo-strato che solo con OPN intera o la porzione C-ter-

Ruolo di osteopontina e anticorpi anti-osteopontinanella sclerosi multipla

COMPENDIO 2015

Annalisa ChiocchettiDipartimento Scienza della Salute, Università del piemonte orientale, Novara

collaboRatoRI:Elisabetta orilieri, Giuseppe Cappellano, Elena Boggio, Maria Felicia Soluri,Nausicaa Clemente, Daniele Sblattero, Casimiro Luca Gigliotti,Cristoforo Comi, Sara Buttini

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minale aumenta il titolo anticorpale anti-OPN indot-to dal vaccino. I vaccini sono tutti e tre efficaci nelproteggere dalla malattia, rispetto al topo non vac-cinato, ma i topi vaccinati con OPN-C, hanno unaremissione più veloce e completa rispetto agli altridue. Infine, abbiamo prodotto un anticorpo direttoverso la porzione C di OPN, da usare come farmacobiologico nell’EAS, per valutarne l’efficacia clinica.L’uso di tale farmaco ha indotto una remissione im-mediata e quasi completa della malattia.

CoNCLUSioNiMediante questo studio abbiamo identificato unruolo patogenetico per una porzione di OPN, la C-terminale, coinvolta nella ricaduta e nella remissio-ne della malattia. Strategie di intervento che mirinoa bloccare l’azione della porzione C terminale, qualila vaccinazione oppure l’uso di un farmaco biolo-gico diretto verso questa porzione sembrano, nelmodello animale, promettenti come terapia per laSM.

iNTRoDUCTioN AND AiMSOsteopontin (OPN) is a proinflammatory cytokinepresent at high levels in demyelinating lesions ofmultiple sclerosis patients and in Experimental Au-toimmune Encephalomyelitis (EAE), the mousemodel of MS. OPN deficient mice develop milderEAE than wild type animals, their administration ofrOPN induce a sudden relapse followed by a pro-gressive severe disease leading to death. These ev-idences suggest that OPN plays an important rolein the pathogenesis and progression of MS. OPN isproduced at high levels in the extracellular matrix ofthe blood-brain-barrier: at this site, it may play arole in lymphocyte recruitment into the MS lesion,by binding one of its receptors, the �α4β1 integrin.This receptor is the target of Natalizumab, a human-ized monoclonal antibody utilized in the anti-MStherapy. OPN binds to �α4β1 integrin only uponcleavage by Thrombin which generates two OPNfragments: the N-terminal, that contains two bind-ing sites for �α4β1 integrin, and the C-terminal, thatcontains a binding site for another receptor, CD44,involved in the inhibition of lymphocyte apoptosis.To counteract to an inflammatory burst the immunesystem can produce neutralizing antibodies target-ing pro-inflammatory cytokines. AutoAbs to OPNhave been detected in EAE and their levels are in-creased by immunization with a plasmid containingthe OPN cDNA showing some therapeutic effects.The general aim of this project was to search for au-toAbs to OPN in MS patients and evaluate their rolein EAE.We thus searched for auto-Abs to OPN in MS pa-

tients and characterized the portion of OPN theybind, we evaluated the role of N- and C-terminalportions of OPN in EAE and evaluated the effect ofa vaccine against OPN in EAE.

RESULTSWe searched for auto-Abs to OPN in 150 MS pa-tients and 150 healthy subjects and found that theirlevels were significantly higher in patients than incontrols. Moreover, their levels were higher in re-lapsing-remitting patients than in progressive one,and the highest titers were in remission comparedto the relapse. These antibodies are mainly directedto the C portion than to the N.To evaluate the role of the N- and C-terminal portionof OPN in vivo, we administrated them to EAE micein the remission phase. Only the full-length OPN orthe C-terminal fragment are able to induce a re-lapse, whereas the N-terminal fragment of a mutat-ed full-length OPN, that is non-cleavable fromTrombin, have no effect.We thus produce a protein vaccine, aimed to inducean antibody response against OPN and its frag-ments during EAE, to evaluate its efficacy in pre-venting/curing EAE. Only the vaccines against thefull length or C-terminal fragment induces high lev-els of antibodies. The three vaccines reduce the dis-ease score compared to the non-vaccinated micebut only mice vaccinated with the OPN-C fragmentdisplay a faster and complete remission. At the endwe produced a biologic to OPN-C: the administra-tion of this antibody during EAS induced an imme-diate and almost complete remission.

Role of osteopontin and anti osteopontin antibodiesin multiple sclerosis


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CoNCLUSioNSThanks to this investigation we high lightened a newpathogenetic role for the C-terminal fragment ofOPN, that is both involved in the relapse and in the

remission of the disease. Therapeutic interventionstargeting the C-terminal portion of OPN, such asvaccination or biologics, seem to be, in the animalmodel, a promising therapy for MS.

COMPENDIO 2015


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PREMESSE E oBiETTiViLa ricerca di terapie innovative per la sclerosi multi-pla (SM) è incentrata sull’identificazione di nuovi ber-sagli farmacologici che siano in grado, quando ineuroni non risultano irreversibilmente danneggiati,di promuovere la rimielinizzazione stimolando le cel-lule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) a forma-re nuova mielina. Nonostante il cervello adultopossieda la capacità di generare oligodendrocitimielinizzanti, il processo di rimielinizzazione nellaSM fallisce o è incompleto e, a tutt’oggi, non sonodisponibili terapie neuroprotettive nè rimielinizzanti.Recenti studi suggeriscono che le alterazioni delleconcentrazioni intracellulari di calcio svolgono unruolo fondamentale non solo nei processi di diffe-renziamento degli OPC in oligodendrociti maturi maanche nei processi di mielinizzazione e rimielinizza-zione.Lo scambiatore Na+/Ca2+, NCX3, recentemente iden-tificato come componente della membrana mielinica,svolge un ruolo fondamentale durante il differenzia-mento degli OPC. Infatti, in uno studio condotto neinostri laboratori di ricerca, è stato dimostrato che isegnali intracellulari di calcio mediati da NCX3 sonocoinvolti nella maturazione degli oligodendrociti enella formazione della mielina. Laddove il silenzia-mento genico di NCX3 nelle cellule OPC prevenival’aumento dei marcatori degli oligodenrociti maturiCNPase e MBP, la sua over-espressione ne induceval’aumento. Resta tuttavia da chiarire se alterazionidell’espressione ed attività di NCX3 possano contri-

buire alla disfunzione degli OPC durante un insultodemielinizzante e se la sua modulazione possa es-sere terapeuticamente rilevante.Scopo principale del presente progetto pilota è sta-to quello di analizzare il ruolo dello scambiatoreNCX3 nei processi di demielinizzazione e rimieliniz-zazione. Il ruolo di questo mediatore dell’omeostasidel sodio e del calcio è stato investigato nelle rispo-ste fisiopatologiche dei neuroni e degli oligodendro-citi del midollo spinale nel modello murino di SM,l’encefalomielite sperimentale autoimmune (ESA),indotta mediante immunizzazione con la glicopro-teina oligodendrocitica MOG35-55. L’andamentodell’ESA, la risposta neuronale e delle cellule dellalinea oligodendrocitaria è stata analizzata in topi pri-vi della proteina NCX3.

RiSULTATiCon l’ausilio di studi biochimici e morfologici abbia-mo dapprima fornito una analisi dettagliata sulla di-stribuzione della proteina NCX3 nella sostanzabianca del midollo spinale nei diversi stadi dell’ESA.I risultati ottenuti hanno dimostrato che i livelli pro-teici di NCX3 risultano aumentati durante la pro-gressione dell’ESA e questo incremento risultaessere altamente significativo nella fase cronica.Allo scopo di valutare il coinvolgimento di NCX3nelle risposte degli OPC all’ESA abbiamo condottoesperimenti quantitativi di co-localizzazione diNCX3 con i marcatori degli OPC (NG2) e degli oli-godendrociti più maturi (CNPase, GalC) nei diversi

Studio del ruolo dell’isoforma dello scambiatoreNa+/ca2+ NcX3 nelle cellule oligodendrocitarie perindividuare nuove strategie terapeutiche per il controllo dellademielinizzazione e rimielinizzazione nella sclerosi multipla

Francesca BosciaDipartimento di Neuroscienze, Scienze Riproduttive ed odontostomatologiche,Università degli Studi di Napoli Federico II, Napoli

collaboRatoRI:Antonella Casamassa,Valeria de Rosa

collaboRazIoNI coN altRI GRUppI:Giuseppe Matarese, Dipartimento di Medicina e chirurgia, Università degli Studidi Salerno, baronissi, Salerno

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stadi dell’ESA. I risultati ottenuti hanno dimostratoun concomitante aumento della co-espressione diNCX3 con il marcatore degli OPC durante tutte lefasi dell’ESA, laddove un concomitante aumentodella co-espressione dello scambiatore con i mar-catori di oligodendrociti più maturi CNPase andGalC, veniva osservato solo nella fase pre-sintoma-tologica e nella fase cronica dell’ESA. Il numero de-gli assoni positivi per NCX3 rimaneva invariatodurante lo stadio pre-sintomatologico, ma risultavasignificativamente ridotto nella fase acuta e questariduzione risultava invariata nella fase cronica del-l’ESA. Allo scopo di valutare il ruolo di NCX3 nellarisposta neuronale o oligodendrogliale durante uninsulto demielinizzante, l’ESA è stato indotto nei to-pi controllo wild-type ncx3+/+, eterozigoti ncx3+/-

e privi di NCX3 o ncx3-/-. I topi ncx3-/-, esaminatinella fase cronica dell’ESA, mostravano non solouna riduzione del diametro assonale e del numero

di anelli integri di guaina mielinica, ma anche unadrammatica riduzione del numero delle cellule OPCed oligodendrociti premielinizzanti rispetto ai topincx3+/+ ESA. Sia i topi ncx3 -/- che ncx3 +/- mo-stravano una precoce comparsa della sintomatolo-gia ESA ed un peggioramento dei sintomi clinici.

CoNCLUSioNiNel complesso, i nostri risultati dimostrano che l’as-senza della proteina NCX3 in topi ESA pregiudica,riducendola significativamente, la risposta delle cel-lule oligodendrocitarie all’insulto demielinizzante edetermina un peggioramento della sintomatologiadell’ESA. Ulteriori studi sono, tuttavia, necessari percomprendere il ruolo dello scambiatore NCX3 du-rante i processi di rimielinizzazione e se la disfunzio-ne degli oligodendrociti in condizioni demielinizzantipossa essere contrastata dalla sua selettiva modu-lazione.

COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSA significant current drive in new multiple sclerosis(MS) therapeutics is to identify targets that can beable, when axons are not irreversible damaged, topromote remyelination by boosting endogenousoligodendrocyte precursor cells (OPC) to form newmyelin. Yet, despite the ability of the adult brain togenerate oligodendrocytes with myelination capac-ity, remyelination in MS demyelinated lesions failedor is incomplete and no neuroprotective or remyeli-nating therapies are still available.It is now becoming increasingly clear that changesin [Ca2+]i levels not only influence the developmentalprocesses that accompany the transition of OPC in-to myelinating oligodendrocytes but also intervenein the initiation of myelination and remyelinationprocesses.The Na+/Ca2+ exchanger NCX3, recently identifiedas a myelin membrane component, is involved inregulating [Ca2+]i during oligodendrocyte develop-ment. We previously demonstrated that calciumsignaling mediated by NCX3 is involved in OPCmaturation and myelin formation. Indeed, whereasthe knocking-down of NCX3 in OPC prevented the

up-regulation of the myelin markers CNPase andMBP, its overexpression induced an up-regulationof both markers. Whether alterations in NCX3 ex-pression and activity might contribute to OPC dys-function under demyelinating conditions andwhether its modulation might be therapeutically rel-evant still remain unknown. The general aim of thispilote project was to analyze the role of NCX3 ex-changer during demyelination and remyelination.The importance of this key mediator of sodium andcalcium homeostasis was examined during thepathophysiological responses occurring in neuronsand oligodendrocytes in the spinal cord of mice ex-posed to myelin oligodendrocyte glycoprotein(MOG35-55)-induced Experimental autoimmuneencephalomyelitis (EAE). The development of EAEdisease, the neuronal and OPC responses were as-sessed in mice lacking ncx3 gene.

RESULTSIn the present project, by using biochemical andmorphological approaches, we first provided a clearpicture of NCX3 distribution within the white matterspinal cord at different stages of EAE disease. We

Exploring the role of the Na+/ca2+ exchanger NcX3in oligodendrocytes to establish new strategies to controldemyelination and remyelination in multiple sclerosis

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found that NCX3 protein levels were intensely up-regulated during EAE progression and this effectwas more significant at EAE chronic stage.To investigate whether NCX3 might be involved inOPC response to EAE insult we performed quanti-tative analyses of NCX3 colocalization with theoligodendrocyte lineage anti-NG2, anti-GalC, andanti-CNPase antibodies at different time points dur-ing EAE disease. We found a concomitant upregu-lation of the exchanger with the OPC marker NG2during all stages of EAE disease and with both CN-Pase and GalC, two markers of more mature oligo-dendrocytes, only at preonset and chronic EAEstages. Quantification of NCX3 coexpression withthe axonal marker NF200 indicated that the numberof NCX3-positive axons remained unchanged duringthe pre-onset EAE stage but they were significantlyreduced at peak stage and this reduction remainedunchanged at chronic stage. To determine whetherNCX3 might have a role in controlling neuronal oroligodendroglial responses under demyelinatingconditions, EAE was induced in congenic wild-type

ncx3+/+, heterozygous ncx3+/- and knockout ncx3-

/- mice. Ncx3-/- revealed not only a reduced diam-eter of axons and number of intact myelin rings butalso a dramatic reduction of OPC and pre-myelinat-ing cells in the white matter spinal cord if comparedto congenic ncx3+/+mice at chronic EAE stage. Ac-cordingly, ncx3 -/- and ncx3 +/- mutants displayedan anticipated development of EAE disease and in-creased severity of clinical symptoms.

CoNCLUSioNSTaken together our findings demonstrate that knock-ing out NCX3 exchanger impairs oligodendrocytelineage responses and worsens clinical symptomsin EAE disease. Our results, by demonstrating a pro-tective role of NCX3 in EAE disease, uncover a novelpharmacological role for this exchanger in oligoden-drocyte lineage cells. Further studies are needed tounveil the role of NCX3 during remyelinationprocesses and to understand whether OLG impair-ment in MS can be overcome by its selective mod-ulation.



Boscia F. Emerging role of the sodium calcium exchanger in microglia and oligodendrocytes. Oral Comunication. XV Congress of the Italian Society forNeuroscience. Roma, 3-5 ottobre, 2013

Casamassa A, Matarese G, Annunziato L, Boscia F. Exploring the role of the Na+/Ca+2 exchanger NCX3 in oligodendrocytes to establish new strategiesto control demyelination and remyelination in Multiple Sclerosis. XI Congresso FISM, Roma, 28-29 maggio 2014

Casamassa A, La Rocca C, Matarese G, Annunziato L, Boscia F. Knocking out the Na+/Ca2+ Exchanger NCX3 impairs oligodendrocyte lineage responseand worsens clinical symptoms in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Manuscript submitted


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PREMESSE E oBiETTiViLa sclerosi multipla (SM) è una malattia neurologicacronica che colpisce il sistema nervoso centrale(SNC), caratterizzata da demielinizzazione, neuroin-fiammazione e neuro-degenerazione. Aspetti tipicidella SM sono infatti la perdita della guaina mielini-ca, da cui dipende la funzionalità delle fibre nervo-se, e l’attivazione incontrollata della microglia, laprincipale popolazione di macrofagi nel cervello. Lamicroglia, attraverso il rilascio di diverse sostanze,può contribuire a danneggiare gli oligodendrociti, lecellule che formano la guaina mielinica nel SNC.Studi recenti hanno messo in evidenza come di-sfunzioni dell’attività dei mitocondri, organelli depu-tati al controllo metabolico delle cellule, svolganoun ruolo molto importante nella patogenesi di diver-se malattie neurologiche, tra cui proprio la SM.Nostri studi precedenti condotti su colture cellularipurificate di precursori degli oligodendrociti (OP) emicrogliali indicano che i glitazoni, agonisti dei re-cettori nucleari PPARγ (recettori attivati dai prolife-ratori perossisomiali), sono in grado, da una parte,di proteggere gli oligodendrociti aumentando le lorodifese, favorendo la formazione di mielina attraversomeccanismi che coinvolgono proprio i mitocondri,dall’altra di modulare l’attivazione della microglia. Traessi, il pioglitazone, farmaco in uso per il trattamentodel diabete di tipo II, ha dato risultati incoraggiantisu un numero limitato di pazienti con SM.Su queste basi, gli obiettivi del nostro progetto sonostati: 1) approfondire le conoscenze sugli effetti pro-tettivi degli agonisti del PPARγ sugli OP e sui mec-canismi che sottendono tale azione, verificando glieffetti di questi farmaci su alcuni parametri mitocon-driali, quali il potenziale di membrana, la produzionedi radicali liberi dell’ossigeno (ROS), e l’espressione

di proteine mitocondriali come la proteina disac-coppiante UCP2, con funzioni anti-ossidanti e pro-tettive, la cui scarsa attività è stata associata ad unamaggiore suscettibilità alla SM; 2) valutare espres-sione, modulazione e funzione dell’UCP2 in diffe-renti stati di attivazione microgliale.

RiSULTATiIn relazione all’obiettivo 1, abbiamo valutato gli ef-fetti protettivi degli agonisti naturali e sintetici delPPARγ in precursori di oligodendrociti (OP) utilizzan-do diversi paradigmi sperimentali. In un primo pa-radigma abbiamo mimato una condizione di stressinfiammatorio stimolando gli OP con il TNFα, unadelle più rilevanti citochine coinvolte nella patofisio-logia della SM, in grado di arrestare o ritardare ilprogramma differenziativo degli OP. In parallelo al-l’attesa riduzione del differenziamento degli OP, ilTNFα induceva una significativa riduzione del po-tenziale di membrana mitocondriale (mMP), e unaumento della produzione di superossido mitocon-driale, indicando un indebolimento delle funzionimitocondriali stesse. La presenza dell’agonista delPPARγ pioglitazone preveniva sia l’effetto del TNFαsul differenziamento sia quello sull’mMP e sul su-perossido. Inoltre, il pioglitazone induceva l’espres-sione di COX1, una subunità del complesso IV dellacatena respiratoria, e del PGC1α, un regolatorechiave della biogenesi mitocondriale, rafforzandol’idea che la funzionalità mitocondriale svolga unruolo centrale nel differenziamento e nella protezio-ne degli oligodendrociti.In un secondo approccio sperimentale, per indurreun danno mitocondriale negli OP, abbiamo utilizzatoil rotenone, un inibitore del primo enzima della cate-na respiratoria mitocondriale, conosciuto per la sua

I mitocondri come bersagli e mediatori degli effetti beneficidegli agonisti ppaRγ nella sclerosi multipla

COMPENDIO 2015

Roberta De SimoneDipartimento di biologia cellulare e Neuroscienze, Istituto Superiore di Sanità, Roma

collaboRatoRI:Luisa Minghetti, Sergio Visentin, Antonietta Bernardo,Maria Antonietta Ajmone-Cat, Chiara De Nuccio

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capacità di compromettere il differenziamento degliOP. Il trattamento con agonisti del PPARγ riducevagli effetti inibitori del rotenone, sia sul differenzia-mento che sulla funzione mitocondriale, suggerendoulteriormente che l’effetto protettivo degli agonistiPPARγ sia mediato dalla loro modulazione delle fun-zioni mitocondriali. Similmente al pioglitazone, l’aci-do grasso poli-insaturo omega 3 docosoesaenoico(DHA), agonista parziale del PPARγ, promuoveva ildifferenziamento degli OP e contrastava l’arrestodella maturazione indotto da TNFα.Inoltre, abbiamo dimostrato per la prima volta che,oltre alla classica regolazione dell’attività trascrizio-nale indotta dalla traslocazione nucleare del PPARγ,sia pioglitazone che DHA inducevano il differenzia-mento degli OP attraverso la fosforilazione (e quindiattivazione) PPARγ-dipendente delle MAP chinasiERK1/2, enzimi coinvolti nella regolazione degli sta-di precoci di maturazione degli OP.Infine, abbiamo dimostrato che il pioglitazone au-mentava l’espressione dell’UCP2 e quella della pro-teina basica della mielina MBP. Gli effetti positivi delpioglitazone sugli OP sono stati anche confermatiin un modello di fettine organotipiche cerebellari,comunemente impiegato negli studi sulla mieliniz-zazione.In relazione all’obiettivo 2, abbiamo studiato il ruolodi UCP2 nella reattività microgliale. Abbiamo valu-tato l’espressione del messaggero e della proteinain colture primarie di microglia in seguito a stimola-zione con lipopolisaccaride (LPS), un tipico stimolopro-infiammatorio. LPS induceva una rapida dimi-nuzione dei livelli di UCP2, seguita da una tardivainduzione. I livelli ridotti di UCP2 erano correlati conun’aumentata produzione di radicali dell’ossigeno(ROS) e con la depolarizzazione dei mitocondri. Peresaminare ulteriormente le conseguenze funzionalidella down-regolazione di UCP2 nella risposta in-fiammatoria, ci siamo avvalsi della tecnica “RNA in-terference” per ridurre l’espressione della proteina.Con tale approccio abbiamo potuto dimostrare chebassi livelli di UCP2 sono correlati ad un’aumentata

risposta a stimoli pro-infiammatori, caratterizzata dauna maggior produzione di ROS e di molecole pro-infiammatorie (ossido d’azoto ed interleuchina 6),confermando il ruolo cruciale di UCP2 nella modu-lazione dell’attivazione microgliale.Abbiamo inoltre dimostrato che i livelli di UCP2 sonoregolati in maniera diversa da agenti anti-infiamma-tori, come dimostra la persistente up-regolazione diUCP2 da parte delle citochine anti-infiammatorie IL4e TGFβ. Similmente a queste citochine, e in accordocon la sua capacità di ridurre l’attivazione microglia-le, anche il pioglitazone induceva l’espressione diUCP2. In cellule in cui UCP2 era stata silenziata, larisposta microgliale ad IL4 era compromessa, comedimostrato dall’incapacità di IL4 di ridurre l’espres-sione di molecole pro-infiammatorie e di indurrequella di molecole anti-infiammatorie. Il livello diUCP2 risulta pertanto un regolatore centrale della ri-sposta microgliale, sia a stimoli di natura pro-infiam-matoria che di natura anti-infiammatoria.

CoNCLUSioNiIn conclusione i nostri dati indicano che agonisti na-turali e sintetici del PPARγ, così come l’agonistaparziale e composto naturale DHA, oltre a promuo-vere il differenziamento degli oligodendrociti, sonoin grado di proteggere gli OP da insulti che alterinole funzioni mitocondriali, mediante effetti che coin-volgono molto probabilmente la modulazione delPGC1α e di proteine mitocondriali, quali UCP2 eCOX1. Inoltre, dimostriamo che UCP2 è un regola-tore chiave del processo di attivazione microgliale,individuando in tale proteina un nuovo target tera-peutico per il trattamento della SM.Nel loro insieme i nostri dati supportano un ruoloper sostanze, sia sintetiche come il farmaco anti-diabetico pioglitazone, sia di origine naturale comeil DHA, in grado di attivare il PPARγ, come promet-tenti agenti terapeutici capaci di promuovere la mie-linizzazione e di regolare la neuroinfiammazioneattraverso molteplici meccanismi, coinvolgenti lamodulazione delle funzioni mitocondriali.

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COMPENDIO 2015

iNTRoDUCTioN AND AiMSMultiple sclerosis (MS) is a chronic neurological dis-ease of the central nervous system (CNS), charac-terized by demyelination, neuroinflammation andneurodegeneration. Two hallmarks of MS are lossof myelin sheet, crucial for neuronal transmission,and uncontrolled activation of microglia, the mainpopulation of brain macrophages. Microglia,through the release of several substances, can con-tribute to damage the oligodendrocytes, the myelin-forming cells of CNS. Recent studies showed thatdysfunction of mitochondria, organelles deputed tothe metabolic control of the cells, play an importantrole in the pathogenesis of several neurological dis-eases, including MS.Our recent studies on purified oligodendrocytesprecursors (OPs) and microglia showed that the an-ti-diabetic drug pioglitazone, agonist of the nuclearreceptor PPARγ (peroxisome proliferator-activatedreceptor-γ), is able on one side to promote the dif-ferentiation of oligodendrocytes (OLs), and on theother, to increase OL cellular defences, throughmechanisms involving mitochondria, and to modu-late microglial activation. In particular, pioglitazone,already in use for the treatment of type II diabetes,has shown promising effects on a limited numberof MS patients.On this rationale, the aims of our project were two-fold: 1) To deepen our knowledge of the protectiveeffects of PPARγ agonists on OPs and of the under-lying mechanism, verifying their effects on mito-chondrial parameters, such as membrane potentialand free radical production (ROS), and the expres-sion of the mitochondrial protein UCP2, a proteinwith anti-oxidant and protective functions whoselow expression has been associated with increasedsusceptibility to MS; 2) To evaluate the expression,function and modulation of UCP2 in different exper-imental settings of microglial activation.

RESULTSIn the Aim 1 of the project, we evaluated the protec-tive effects of PPARγ natural and synthetic agonistsin OL precursors (OPs), by using two different ex-perimental paradigms. In a first model, we mimickeda condition of inflammatory stress by challenging

OPs with TNFα, one of the most relevant cytokinesinvolved in the pathophysiology of MS, known to ar-rest or delay the differentiation program of OPs. Inparallel with the expected reduction of OPs differ-entiation, TNFα induced a significant decrease ofmitochondrial membrane potential (mMP) and an in-crease in the production of mitochondrial superox-ide, indicating an impairment of the mitochondrialfunctions. The presence of the PPARγ agonist piogli-tazione significantly reverted both TNFα-dependentreduction of OP differentiation and mMP and TNFα-dependent increase of superoxide. In addition, pi-oglitazone induced an increased expression ofcytochrome C oxidase subunit 1 (COX1), an enzymeof the respiratory chain and that of PGC1α, a tran-scriptional coactivator that is a central inducer of mi-tochondrial biogenesis corroborating the idea thatmitochondria functionality play a crucial role in main-taining oligodendrocyte differentiation. In a secondmodel, to induce a mitochondrial impairment, weused rotenone (an inhibitor of the enzymatic com-plex I of the mitochondrial respiratory chain), knownto significantly impair OP differentiation. In pioglita-zone-treated OPs the inhibitory effects of rotenoneon both mitochondrial functions and OP differentia-tion were significantly attenuated, further suggestinga protective effect of the PPARγ agonists against themitochondrial impairment. Similar to pioglitazone,the omega-3 fatty acid and partial PPARγ agonistdocosahexaenoic acid (DHA) promoted OP differen-tiation and counteracted TNFα-induced maturationarrest. Furthermore, we show, for the first time incells of oligodendroglial lineage, that in addition tothe classical transcriptional activity induced byPPARγ nuclear translocation, both pioglitazone andDHA induced OP differentiation through PPARγ-de-pendent phosphorylation, and hence activation, ofthe MAP kinases ERK1/2, which are known to con-trol the early stage of OP maturation.In addition, we found that the PPARγ agonist piogli-tazone increased the expression of UCP2 and thatof myelin basic protein MBP. The positive effect ofpioglitazone on OL differentiation was confirmed ina recognized model for myelination studies (organ-otypic cerebellar slice cultures).In the Aim 2 of the project, we investigated the role

Mitochondria as targets and mediators of the ppaRγ agonistbeneficial effects in multiple sclerosis

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of UCP2 in microglial reactivity. We analyzed UCP2mRNA and protein expression in microglial culturesupon stimulation by LPS, a typical pro-inflammatorystimulus. LPS induced a rapid decrease of UCP2levels followed by a delayed up-regulation of theprotein. The decrease in UCP2 levels was associ-ated to enhanced production of mitochondrial re-active oxygen species (ROS) and depolarization ofmitochondria. To further examine the functionalconsequences of UCP2 modulation on the inflam-matory response we took advantage of RNA inter-ference technique to down-regulate UCP2. Theseexperiments demonstrated that the low expressionof UCP2 is related to an enhanced inflammatory re-sponse characterized by an increased productionof ROS and pro-inflammatory molecules (NO andIL6), confirming the key role of UCP2 in the modu-lation of microglial activation.We have also found that UCP2 levels are differentlyregulated by anti-inflammatory agents, as indicatedby the persistent up-regulation of UCP2 by the an-ti-inflammatory cytokines TGFβ and IL4. Similar tothese anti-inflammatory cytokines, and consistentlywith its known ability to reduce microglial activation,pioglitazone was found to upregulate the expres-sion of UCP2. In UCP2-silenced cells, microglial re-

sponse to IL4 was compromised, as demonstratedby the failure of IL4 to reduce the synthesis of pro-inflammatory molecules and to induce that of anti-inflammatory ones. UCP2 level is thus a masterregulator of microglial responses to both pro-andanti-inflammatory stimuli.

CoNCLUSioNSIn conclusion, our data indicate that syntheticPPARγ agonists, such as the anti-diabetic drug pi-oglitazone, as well as natural dietary compounds,such as the partial PPARγ agonist docosahexaenoicacid (DHA), in addition to promote OL differentia-tion, are able to protect OPs against inflammatoryinsults that impair mitochondrial functions with ef-fects likely involving the modulation of PCG1α andof mitochondrial proteins such as UCP2 and COX1.In addition, we revealed, for the first time, thatUCP2 is a master regulator of both pro- and anti-inflammatory microglial responses, pointing toUCP2 as a new therapeutic target for MS. Overallour data support a role for PPARγ natural and syn-thetic agonists as promising therapeutic agentsable to promote myelination and to regulate braininflammation by means of multiple mechanisms, in-cluding the modulation of mitochondrial functions.



Bernardo A, De Simone R, De Nuccio C, Visentin S, Minghetti L. The nuclear receptor peroxisome proliferator activated receptor-γ promotes oligoden-drocyte differentiation through mechanisms involving mitochondria and oscillatory Ca2+ waves. Biol. Chem. 2013. 394: 1607–1614

Visentin S, Bernardo A, De Simone R, De Nuccio C, Minghetti L. Oscillatory Ca2+ waves, mitochondria, and nuclear receptors in the differentiation ofoligodendrocytes. ABCD Congress, Ravenna, 12-14 Settembre 2013

De Nuccio C., Bernardo A., De Simone R., Visentin S, Minghetti L.”Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ agonists protect oligodendrocytes fromTNF-alpha-induced damage. Oral presentation, XV Congresso Società Italiana di Neuroscienze (SINS), Roma, 3-5 Ottobre 2013

De Nuccio C, Bernardo A, De Simone R, Visentin S, and Minghetti L. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ agonists and demyelinating disease:effects of pioglitazone on mitochondrial function in oligodendrocytes 36° Congresso Nazionale della Società Italiana di Farmacologia (SIF), Torino, 23-26 Ottobre 2013

De Nuccio C., Cruciani C., Bernardo A., De Simone R., Visentin S. and Minghetti L. Mitochondria are the target of the opposite effects of TNF-α andPPAR-γ agonists in oligodendrocyte progenitors. 9th FENS, Milano, 5-9 Luglio, 2014

Bernardo, A. Giammarco, M.L. De Simone, R. Minghetti L. Docosahexaenoic acid and curcumin promote oligodendrocyte differentiation through mech-anisms involving PPAR-γ and ERK1/2 activation. 9th FENS, Milano, 5-9 Luglio 2014


PROGETTI DI RICERCAE BORSE DI STUDIO

FINANZIATI DALLA FISMFISM FUNDED RESEARCH PROJECTS AND FELLOWSHIPS

COMPENDIO 2015

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PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2014

NEURORIABILITAZIONEE QUALITÀ DELLA VITA

Maria Pia AmatoDipartimento di NEUROFARBA, Università di Firenze, FirenzeRuolo della riserva cognitiva nella sclerosi multipla adesordio pediatrico e impatto della malattia sull’inserimentosociale e lavorativo nell’età adultaProgetto di ricerca € 250.000 - 2 anni

Marta BassiDipartimento di Scienze Biomediche e Cliniche Luigi Sacco,Università degli Studi di Milano, MilanoIl sistema della cura: commisurare la promozione delbenessere alle esigenze di persone con sclerosi multipla,caregiver ed operatori sanitariProgetto di ricerca € 184.000 - 3 anni

Ambra BisioDipartimento di Neuroscienze, Riabilitazione, Oftalmologia,Genetica e Scienze Materno-Infantili, Università degli Studidi Genova, GenovaLa riabilitazione della scrittura nella sclerosi multipla:un approccio innovativo per valutare e contrastareil deterioramento della scrittura in pazienti affettida sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 20.000 - 1 anno

Graziella FilippiniFondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta (INNCB),Direzione Scientifica, MilanoIN-DEEP - Integrare le esperienze e le preferenze dellepersone con SM con i risultati della ricerca per sviluppareinformazioni utili per decisioni informate e condivise:i test diagnosticiProgetto di ricerca € 150.000 - 3 anni

Elise HoudayerUnità di Neurofisiologia Sperimentale, Istituto di NeurologiaSperimentale-INSPE, Fondazione Centro San Raffaele, MilanoStimolazione magnetica transcranica profonda con H-coilper il trattamento non invasivo del dolore degli artiinferiori nella sclerosi multiplaBorsa di ricerca € 27.000 - 2 anni

Matilde ingleseDepartment of Neurology, Radiology and Neuroscience,Icahn School of Medicine Mount Sinai New York, NY, USACorrelati cerebrali strutturali e funzionali di riabilitazionedell’arto superiore in pazienti con SM progressivaProgetto di ricerca € 75.000 - 1 anno

Massimiliano PauDipartimento di Ingegneria Meccanica, Chimica edei Materiali, Università degli Studi di Cagliari, CagliariSviluppo di una piattaforma hardware-software innovativaper la riabilitazione dell’equilibrio in individui affetti daSM basata sulla Balance Board Nintendo WiiProgetto di ricerca € 20.000 - 1 anno

Luca ProsperiniDipartimento Neurologia e Psichiatria, Sapienza Universitàdi Roma, Roma Studio pilota sull’associazione tra compromissione cognitivae disturbo dell’equilibrio in pazienti con sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 23.175 - 1 anno

Claudio SolaroDipartimento Testa-Collo S.C. Neurologia, Genova OspedaleP.A. Micone ASL3 Genovese, GenovaLa funzione dell’arto superiore in SM: creazione di un data-setper ottenere dati normativi di misure soggettive e oggettive esviluppo di uno strumento di valutazione SM specificoProgetto di ricerca € 79.800 - 2 anni

Franca TecchioIstituto di Scienze e Tecnologie dalla Cognizione (ISTC),Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), RomaAlleviare la fatica nella sclerosi multipla mediantel’applicazione domiciliare di un trattamento personalizzatodi neuromodulazioneProgetto di ricerca € 40.000 - 2 anni

CLASSIFICAZIONEE DIAGNOSI DELLA MALATTIA

Francesca AloisiDipartimento di Neuroscienze e Biologia Cellulare, IstitutoSuperiore di Sanità, RomaStudio dell’espressione di geni del virus di Epstein Barre geni cellulari in pazienti con CIS, SM recidivanteremittente e SM primaria progressiva: ricerca dibiomarcatori diagnostici e prognosticiProgetto di ricerca € 161.753 - 3 anni

Antonio BertolottoNeurologia 2, CRESM, AOU San Luigi, Orbassano (TO)Una banca biologica ed un laboratorio dedicati allaraccolta ed alla distribuzione di campioni biologicidi SMPP, la replicazione e la condivisione di dati ela validazione di metodi biologiciProgetto di ricerca € 74.800 - 1 anno

BANDO DI RICERCA FISM

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Massimo FilippiUnità di Neuroimaging Quantitativo, Università Vita-SaluteSan Raffaele, MilanoValutazione delle modifiche longitudinali della retedi connettività funzionale (connectome) nei pazienticon sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 100.000 - 1 anno

Maria LiguoriIstituto di Tecnologie Biomediche (ITB), Sezione di Bari,Consiglio Nazionale delle Ricerche, BariIl deterioramento cognitivo nella sclerosi multiplapediatrica: ricerca di biomarcatori predittivi diprogressioneProgetto di ricerca € 245.492 - 2 anni

Eleonora PirasNinds/Nih, Viral Immunology Section, Bethesda, USAMonitoraggio dei linfociti T CD8+ EBV-specifici in malattiedemielinizzanti in pazienti sottoposti a trials con nuovifarmaci antiviraliBorsa di ricerca € 73.000 - 2 anni

Maria A. RoccaFondazione Centro San Raffaele, MilanoLa misura dell’atrofia del midollo cervicale come strumentoper il monitoraggio della malattia e per la predizione delladisabilità a lungo termine in pazienti con sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 75.000 - 1 anno

Silvia RomanoCentro Neurologico Terapie Sperimentali (CENTERS),Università “La Sapienza”, Dipartimento di Neuroscienze,Salute Mentale e Organi di Senso (NESMOS),Ospedale Sant’Andrea, RomaStudio della noise di espressione genica di singola cellulain linee cellulari linfoblastoidi (LCLs) di gemelli monozigotidiscordanti per sclerosi multipla, pazienti sporadicie controlliProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno


Alessandra MallanoDipartimento del Farmaco, Istituto Superiore di Sanità, RomaSviluppo di un anticorpo umano capace di interrompereil pathway mediato dal CD161 allo scopo di definire nuovestrategie terapeutiche nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Simona PergaIstituto di Neuroscienze della Fondazione Cavalieri Ottolenghi(NICO), AOU San Luigi Gonzaga, Unità di NeurobiologiaClinica, CReSM, Orbassano (TO)

Il ruolo della deubiquitinasi A20/TNFAIP3nell’immunopatologia della SMProgetto di ricerca € 100.000 - 3 anni

Marcello PintiDipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena eReggio Emilia, ModenaRespirazione e glicolisi nei linfociti di pazienti con diverseforme di sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Manolo SambucciUnità di Neuroimmunologia e Citofluorimetria, FondazioneSanta Lucia IRCCS, RomaLinfociti T regolatori Foxp3+ : Subsets differenti possonospiegare la mancanza di immunoregolazione nella SM?Borsa di ricerca € 52.000 - 2 anni

Egle SolitoQueen Mary University London, School of Medicine andDentistry, Translational Medicine and Therapeutics (TMT) -William Harvey Reserach Institute (WHRI), London - UKRuolo della annessina A1 nella sclerosi multipla:identificazione di un fattore endogeno che controllala migrazione di cellule T attraverso la barrieraematoencefalica e la tolleranza immunologicaProgetto di ricerca € 250.000 - 3 anni


Cosima BaldariDipartimento di Scienze della Vita, Università degli Studidi Siena, SienaL’espressione difettiva di Rai negli astrociti attenuala neurodegenerazione dipendente dai linfociti Th17encefalitogenici: uno studio meccanicistico delleinterazioni tra astrociti e linfociti Th17Progetto di ricerca € 75.000 - 2 anni

Diego CentonzeDipartimento di Medicina dei Sistemi, Università degli Studidi Roma “Tor Vergata”, RomaPromuovere la plasticità neuronale per contrastarela progressione clinica nella sclerosi multipla: studio pilotaper valutare sicurezza ed efficacia del D-AspartatoProgetto di ricerca € 71.350 - 1 anno

Alberto ChiarugiDipartimento di Scienze della Salute, Sezionedi Farmacologia Clinica, Università di Firenze, FirenzeCaratterizzazione delle disfunzioni mitocondriali in modellidi sclerosi multipla progressiva ed effetto di farmacipotenzianti le funzioni mitocondrialiProgetto di ricerca € 86.500 - 2 anni

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COMPENDIO 2015

Alessandro DidonnaDepartment of Neurology, University of California,San Francisco CA, USAMicroRNA come nuovi strumenti per modulare il processodi mielinizzazzione nel sistema nervoso Borsa di ricerca senior € 100.715 - 2 anni

Roberto FurlanIsituto Scientifico San Raffaele Dipartimento di Neuroscienze,MilanoMicrovescicole microgliali come vettore terapeuticoper la neuroinfiammazioneProgetto di ricerca € 165.000 - 2 anni

Rosella MechelliSapienza Università di Roma Dipartimento di Neuroscienze,salute mentale e organi di senso, RomaApproccio di tipo “interattoma-candidato” nella sclerosimultipla: dall’interazione geni-ambiente alla cacciadei bersagli terapeuticiProgetto di ricerca € 81.000 - 2 anni

Simone PatergnaniUniversità di Ferrara, Dipartimento di morfologia, chirurgiae medicina sperimentale - Sezione di Patologia, Oncologiae Biologia, FerraraUtilizzo di agenti modulanti il processo autofagico comenuova terapia per ripristinare la mielinizzazione in modellidi sclerosi multiplaBorsa di ricerca senior € 55.000 - 2 anni

Laura PiccioWashington University in St. Louis, Neurology, St. Louis, MO,USARuolo immunomodulatorio della adiponectina in modellisperimentali della sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 79.800 - 2 anni

Stefano PrevitaliFondazione Centro San Raffaele, Istituto di NeurologiaSperimentale (InSpe), Divisione di Neuroscienze, MilanoRuolo di Jab1 nella differenziazione e sopravvivenzadegli oligodendrociti: un nuovo modello murino diprogressive demielinizzazione e degenerazione delsistema nervoso centraleProgetto di ricerca € 74.000 - 1 anno

Roberto PrimiUniversità degli studi di Milano Dipartimento di ScienzeFarmacologiche e Biomolecolari, MilanoModellazione molecolare di GPR17: interazioni con ligandipro-infiammatori non convenzionaliBorsa di Ricerca € 26.300,00 - 1 anno

Martina SeveraDipartimento di malattie infettive, parassitarie edimmunomediate, Istituto Superiore di Sanità, RomaUn anticorpo coniugato all’Interferone ß specifico perle cellule B: una nuova immuno-citochina peril trattamento della SMProgetto di ricerca € 29.978 - 1 anno

PROGETTI SPECIALI 2014

NEURORIABILITAZIONE E QUALITÀ DELLA VITAAlessandra SolariUnità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS IstitutoNeurologico C. Besta, MilanoStudio PeNSAMI Fase 2: Trial Clinico multicentricorandomizzato controllato, in singolo cieco, di fase II/III,sull’efficacia di un programma di cure palliative,domiciliari per le persone con SM grave e i loro caregiver,e studio qualitativoProgetto speciale € 331.191 - 2 anni

Paolo RiccioUniversità della Basilicata Dipartimento di Scienze, PotenzaValori nutrizionali nella sclerosi multipla: perché sonoimportanti e come devono essere gestitiProgetto speciale € 10.000 - 1 anno

FiSM, UNiBAFondazione Italiana Sclerosi Multipla, Genova -Università degli studi di Bari Aldo Moro, BariRegistro Italiano Sclerosi MultiplaProgetto speciale € 367.500 - 1 anno

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NEURORIABILITAZIONEE QUALITÀ DELLA VITA

Maura CasadioDipartimento di Infomatica Bioingegneria Robotica e Ingegneriadei Sistemi (DIBRIS), Università degli Studi di Genova, GenovaInterfacce corpo-macchina basate sulle sinergie muscolariper riabilitazione neuromotoria personalizzata di personeaffette da sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Valerio ChiurchiùUnità di Neuroimmunologia, IRCCS Fondazione Santa Lucia, RomaPlasticità e polarizzazione dei macrofaginella sclerosi multipla: in ‘ex vivo’ veritasProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Ugo Della CroceDipartimento POLCOMING,Università degli Studi di Sassari, SassariUn intervento riabilitativo basato sull’uso di realtà virtualee treadmill per migliorare il cammino in individui affettida sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 85.000 - 2 anni

Franca DeriuDipartimento di Scienze Biomediche,Università degli Studi di Sassari, SassariValutazione neurofisiologica, dinamometrica e clinicadegli effetti del Cross-Training in pazienticon sclerosi multipla: uno studio pilotaProgetto di ricerca € 29.000 - 1 anno

Luca ostacoliDipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche,Università degli Studi di Torino, Orbassano (TO)L’efficacia di un intervento Mindfulness-basedper i sintomi depressivi e la qualità della vita nei pazienticon sclerosi multipla e i loro caregivers.Uno studio clinico randomizzato controllatoProgetto di ricerca € 60.000 - 3 anni

Nicola SmaniaDipartimento di Scienze Neurologiche, Neuropsicologiche,Morfologiche e Motorie, Università di Verona,Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata Verona, VeronaEffetti di un trattamento intensivo robot assistito sulrecupero funzionale della mano e sull’autonomia nelle ADLin persone con sclerosi multipla: studio randomizzatocontrollato in singolo ciecoProgetto di ricerca € 75.000 - 2 anni

Eleonora TavazziUnità di Neuroriabilitazione, Centro Sclerosi Multipla,Istituto IRCCS Santa Maria Nascente,Fondazione Don Gnocchi, MilanoEffetti della riabilitazione neuromotoria sulla plasticitàcerebrale nella sclerosi multipla: studio di RM strutturale efunzionale randomizzato-controllato in doppio ciecoProgetto di ricerca € 30.00 - 1 anno

Enrico MolinariDipartimento di Psicologia, Università Cattolicadel Sacro Cuore, MilanoMigliorare la qualità di vita di persone con sclerosimultipla e dei loro familiari tramite un interventodi Mindfulness e TelemedicinaProgetto di ricerca € 117.075 - 2 anni

Rosalba RosatoDipartimento di Psicologia, Università degli Studi di Torino,TorinoSviluppo e validazione preliminare della versioneabbreviata e computerizzata dell’MSQOL-54Progetto di ricerca € 110.000 - 2 anni

CLASSIFICAZIONEE DIAGNOSI DELLA MALATTIA

Christian CordanoMS Center,University of California, San Francisco (UCSF)San Francisco, CA, USATomografia a coerenza ottica ad altissima risoluzionenell’encefalomielite autoimmune sperimentale - un modelloper la comprensione del ruolo clinico dell’OCT nella SMBorsa di addestramento € 65.000 - 2 anni

Maria PetraccaEstelle and Daniel Maggin Department of Neurology,Mount Sinai School of Medicine, New York, NY, USADeterminazione delle concentrazioni intra edextracellullari di sodio a livello encefalico in pazienti affettida SM mediante l’impiego di RM a 7.0 TeslaBorsa di ricerca € 80.000 - 2 anni

Dario SeppiDipartimento di Biologia cellulare e Neuroscienze,Istituto Superiore di Sanità, RomaTecniche avanzate di analisi molecolare volteall’identificazione di biomarker predittori di progressionedi malattia nella sclerosi multiplaBorsa di addestramento € 41.000 - 2 anni

PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2013

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COMPENDIO 2015


Antonio CattaneoFondazione EBRI Rita Levi-Montalcini, Fattori Neurotrofici eMalattie Neurodegenerative, RomaCorrelazione fra sbilanciamento proNGF/NGF esinaptopatia infiammatoria in un modello animaledi sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 53.000 - 1 anno

Francesco CecconiDipartimento di Neuroscienze Sperimentali, IRCCSFondazione Santa Lucia, RomaRuolo della proteina adattatrice pro-autofagica AMBRA1nel destino dei linfociti T e suo coinvolgimentonella sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 180.000 - 3 anni

Maria Teresa CencioniWolfson Neuroscience Laboratory, Department of Medicine,Faculty of Medicine, Imperial College, London, UKRuolo dei linfociti T CD57+CD8+ nel riconoscimentodel virus Epstein-Barr e nella sclerosi multiplaBorsa di ricerca € 41.000 - 1 anno

Eliana Marina CocciaDipartimento di Malattie Infettive, Parassitarieed Immunomediate, Istituto Superiore di Sanità, RomaAnalisi dell’INTERFEROME nella SM: alla ricerca di viedi segnale alterateProgetto di ricerca € 245.000 - 2 anni

Silvia DusiDipartimento di Patologia e Diagnostica, Sezione PatologiaGenerale, Università degli Studi di Verona, VeronaVisualizzazione e caratterizzazione della motilitàdelle cellule T nel sistema nervoso centrale durantel’encefalomielite autoimmune sperimentaleBorsa di addestramento € 37.000 - 2 anni

Fabia FilipelloLaboratorio Farmacologia e Patologia del Sistema Nervoso,Istituto Clinico Humanitas, RomaInterazione tra astrociti e cellule T nel corso della sclerosimultiplaBorsa di addestramento € 38.000 - 2 anni

Bruno GranDivision of Clinical Neuroscience, Clinical NeurologyResearch Group, University of Nottingham, School ofMedicine, Nottingham, UKRuolo dei recettori TLR2 nell’attivazionedell’infiammazione da parte di infezioni nella SMProgetto di ricerca € 126.550 - 2 anni

Giuseppe MameliDipartimento di Scienze Biomediche, Università degli Studidi Sassari, SassariStudio sulla risposta immune di HERV-W e EBVin pazienti sardi con sclerosi multipla e controlliProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Luca MuzioDipartimento di Neuroscienze, INSPE, Fondazione CentroSan Raffaele (FCSR), MilanoAcidosi nelle malattie neuroinfiammatorie:il ruolo dei canali AsicsProgetto di ricerca € 163.000 - 2 anni

Barbara RossiDipartimento di Patologia e Diagnostica, Universitàdegli Studi di Verona, VeronaRuolo delle cellule T regolatorie CD4+CD25+nella modulazione dell’autoimmunità nel sistema nervosocentrale in corso di encefalomielite sperimentaleautoimmuneProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Barbara SerafiniDipartimento di Biologia Cellualre e Neuroscienze,Istituto Superiore di Sanità, RomaStudio dell’espressione genica degli infiltrati immunitariisolati mediante microdissezione laser da tessutocerebrale di persone con sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 115.000 - 2 anni

Claudio SetteLaboratorio di Neuroembriologia, Fondazione Santa Lucia,RomaCoinvolgimento della via di segnale IL-1ß/MyD88nel differenziamento delle cellule umane Th17patogeniche nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 95.000 - 2 anni

Ada Maria TataDipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles Darwin,Sapienza Università di Roma, RomaRelazione tra l’alterazione del sistema colinergicoe l’infiammazione nella sclerosi multipla: studi in topi EAEe in pazienti in fase recidivante remittenteProgetto di ricerca € 133.000 - 2 anni

Maria Pia AbbracchioDipartimento di Scienze Farmacologiche e Biomolecolari,Università degli Studi di Milano, MilanoStrategie rimielinizzanti innovative per la sclerosi multipla:focus su GPR17, nuovo recettore coinvoltonel differenziamento oligodendrocitarioProgetto di ricerca € 170.000 - 2 anni

119



Luca BattistiniUnità di Neuroimmunologia, Fondazione Santa Lucia, RomaRuolo delle cellule MAIT nella sclerosi multipla: comela flora intestinale influenza le risposte autoimmuniProgetto di ricerca € 110.000 - 2 anni

Bruno BonettiDipartimento di Neuroscienze, Università di Verona,Ospedale Policlinico, VeronaEsosomi da cellule staminali mesenchimali adipose:un innovativo approccio terapeutico nell’encefalomieliteautoimmune sperimentaleProgetto di ricerca € 120.000 - 2 anni

Erica ButtiDivisione di Neuroscienze, Fondazione Centro San Raffaele,MilanoRuolo diretto e indiretto dei precursori endogeni neuralinella demielinizzazione e rimielinizzazione dopo dannoindotto da cuprizoneProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Giacomo CasellaUnità di Neuroimmunologia, INSPE, Divisione diNeuroscienze, Istituto Scientifico San Raffaele, MilanoMicrovescicole microgliali come vettore terapeuticoin neuroinfiammazioneBorsa di addestramento € 40.000 - 2 anni

Emanuela ColomboIstituto di Neurologia Sperimentale (INSPE),Istituto Scientifico San Raffaele, MilanoAstrociti per la terapia cellulare della sclerosi multiplaBorsa di ricerca € 52.000 - 2 anni

Massimiliano Di FilippoClinica Neurologica, Università degli Studi di Perugia,Ospedale S. Maria della Misericordia, PerugiaInibizione mitocondriale ed encefalomielite autoimmunesperimentale: possibili strategie neuroprotettiveProgetto di ricerca € 30.000 - 1 anno

Federica Eva EspositoDipartimento di Neurologia e Istituto di NeurologiaSperimentale (INSPE), Fondazione Centro San Raffaele,MilanoUn modello predittivo di risposta a fingolimod:integrazione di clinica, neuroradiologia e geneticaProgetto di ricerca € 175.000 - 2 anni

Giovanni Luigi MancardiDipartimento di Neuroscienze, Riabilitazione, Oftalmologia,Genetica e Scienze Materno-Infantili, Università degli Studidi Genova, GenovaIntensa immunosoppressione seguita da trapiantoautologo di cellule staminali ematopoietichee mesenchimali nella encefalite autoimmune sperimentalee in forme gravi di sclerosi multiplaProgetto di ricerca € 150.000 - 3 anni

Carla TaveggiaDivisione di Neuroscienze e INSPE, Fondazione CentroSan Raffaele, MilanoModulazione dell’attività enzimatica di TACE nellamielinizzazione e nella rimielinizzazione del SNCProgetto di ricerca € 115.000 - 2 anni

PROGETTI SPECIALI 2013

CLASSIFICAZIONE E DIAGNOSI DELLA MALATTIAAntonio BertolottoNeurologia 2, CRESM, AOU San Luigi, Orbassano (TO)Biomarcatori di diagnosi e prognosi nella sclerosi multipla:possibile ruolo delle isoforme della Vitamina D BindingProteinProgetto speciale € 80.000 - 1 anno

Massimo FilippiUnità di Neuroimaging Quantitativo, Università Vita-SaluteSan Raffaele, MilanoNetwork Italiano di Neuroimaging (INNI) perl’ottimizzazione dell’utilizzo di tecniche avanzatedi Risonanza Magnetica in pazienti con SMProgetto speciale € 450.000 - 2 anni

VERSO NUOVI TRATTAMENTIMaria Pia Abbracchio, ivano EberiniDipartimento di Scienze Farmacologiche, Laboratoriodi Famacologia Cellulare e Molecolare della TrasmissionePurinergica, Università degli Studi di Milano, MilanoSviluppo di un brevetto di nuovi modulatori di GPR17,un recettore chiave nei processi di rimielinizzazioneProgetto speciale € 100.000 - 1 anno

COMITATO SCIENTIFICOFISM 2014

FISM SCIENTIFIC COMMITTEE 2014

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COMITATO SCIENTIFICO FISM 2014

BIOMEDICAL RESEARCH FISM SCIENTIFIC COMMITTEE

Luciano AdoriniChief Scientific Officer - Intercept Pharmaceuticals – MILANO

Clara BalleriniDipartimento di Scienze Neurologiche, Università di Firenze – FIRENZE

Luca BattistiniIRCCS S. Lucia Neuroimmunology Unit European Centre for Brain Research – ROMA

Diego CentonzeFondazione Santa Lucia IRCCS e Università di Tor Vergata, Clinica Neurologica, Dipartimento di Neuroscienze – ROMA

Gabriela ConstantinDipartimento di Patologia e Diagnostica, Università degli Studi di Verona – VERONA

Sandra D’AlfonsoDipartimento di Scienze della Salute, Università del Piemonte Orientale – NOVARA

Peter GoodfellowVisiting Professor in Biosciences at the University of Kent, UK

Matilde ingleseMount Sinai School of Medicine – NEW YORK, USA

Paolo MuraroDivision of Experimental Medicine, Centre for Neuroscience, Imperial College London – LONDON, UK

Marco SalvettiNeurologia e Centro Neurologico Terapie Sperimentali (CENTERS), Sapienza Università di Roma – ROMA

Carla TaveggiaUnità di Interazioni Neurogliali, Dipartimento di Neuroscienze e INSPE, Ospedale San Raffaele, DIBIT – MILANO

Lawrence WrabetzHunter James Kelly Research Institute (HJKRI), University at Buffalo – Buffalo NY, USA

Stefano PluchinoDept. of Clinical Neurosciences, Centre for Brain Repair and Wellcome Trust-MRC Cambridge Stem Cell Institute,University of Cambridge – CAMBRIDGE, UK

122

COMPENDIO 2015

SOCIAL & BEHAVIOURAL SCIENCE RESEARCH FISMSCIENTIFIC COMMITTEE

Maria Pia AmatoDipartimento di Neuroscienze, Psicologia, Area del Farmaco e Salute del Bambino, Università di Firenze – FIRENZE

Monica FalautanoDipartimento di Neurologia, Servizio di Psicologia, Ospedale San Raffaele – MILANO

Jürg KesselringKliniken Valens, Rehabilitation Centre Valens, Department of Neurology and Neurorehabilitation VALENS, Switzerland

Letizia LeocaniFondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Dipartimento Neurologico – MILANO

Maura PugliattiFacoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di Sassari, Clinica Neurologica – SASSARI

Marco RovarisFondazione Don Gnocchi, Unità Sclerosi Multipla, IRCCS Santa Maria Nascente – MILANO

Alessandra SolariUnità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, – MILANO

DIRETTORE RICERCA SCIENTIFICA

Paola ZaratinAssociazione Italiana Sclerosi Multipla - Fondazione Italiana Sclerosi Multipla – GENOVA

COMITATO SCIENTIFICOFISM 2013

FISM SCIENTIFIC COMMITTEE 2013

124

COMPENDIO 2015

BIOMEDICAL RESEARCH FISM SCIENTIFIC COMMITTEE

Antonio BertolottoAOU S. Luigi Gonzaga, Centro di riferimento Regionale Sclerosi Multipla (CReSM) – Orbassano (TO)

Luca BattistiniIRCCS S. Lucia Neuroimmunology Unit European Centre for Brain Research – ROMA

Diego CentonzeFondazione Santa Lucia IRCCS e Università di Tor Vergata, Clinica Neurologica, Dipartimento di Neuroscienze – ROMA

Gabriela ConstantinDipartimento di Patologia e Diagnostica, Università degli Studi di Verona – VERONA

Francesco CuccaDipartimento di Scienze Biomediche, Università degli Studi di Sassari – SASSARI

Roberto FurlanUnità di Neuroimmunologia Clinica, Ospedale San Raffaele, DIBIT – MILANO

Peter GoodfellowVisiting Professor in Biosciences at the University of Kent, UK

Matilde ingleseMount Sinai School of Medicine – NEW YORK, USA

Paolo MuraroDivision of Experimental Medicine, Centre for Neuroscience, Imperial College London – LONDON, UK

Lawrence WrabetzHunter James Kelly Research Institute (HJKRI), University at Buffalo – Buffalo NY, USA

Stefano PluchinoDept of Clinical Neurosciences, Centre for Brain Repair and Wellcome Trust-MRC Cambridge Stem Cell Institute,University of Cambridge – CAMBRIDGE, UK

125

COMITATO SCIENTIFICO FISM 2013

DIRETTORE RICERCA SCIENTIFICA

Paola ZaratinAssociazione Italiana Sclerosi Multipla - Fondazione Italiana Sclerosi Multipla – GENOVA

SOCIAL & BEHAVIOURAL SCIENCE RESEARCH FISMSCIENTIFIC COMMITTEE

Franco FranchignoniFondazione Salvatore Maugeri, Istituto Scientifico di Riabilitazione – VERUNO (NO)

olga CiccarelliDepartment Brain Repair and Rehabilitation, University College London, Institute of Neurology – LONDON, UK

Monica FalautanoDipartimento di Neurologia, Servizio di Psicologia, Ospedale San Raffaele – MILANO

Peter FeysREVAL Rehabilitation Research Center. BIOMED. University of Hasselt – DIEPENBEEK, Belgium

Maura PugliattiFacoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di Sassari, Clinica Neurologica – SASSARI

Marco RovarisFondazione Don Gnocchi, Unità Sclerosi Multipla, IRCCS Santa Maria Nascente – MILANO

Alessandra SolariUnità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta – MILANO

126

COMPENDIO 2015

Agresti Cristina 91

Bergamaschi Laura 56

Boscia Francesca 105

Bove Marco 22

Chiocchetti Annalisa 102

D’Alfonso Sandra 51

De Simone Roberta 108

Di Luca Dario 59

Falco Anna 79

Falcone Marika Maria Caterina 67

Filippi Massimo 16, 19

Furlan Pier Maria 34

Furlan Roberto 85

Leocani Letizia 97

Lucca Liliana Elisa 64

Magliozzi Roberta 43

Malucchi Simona 31

Martinelli Vittorio 41

Martire Serena 70

Martucci Morena 38

Musio Silvia 61

Pluchino Stefano 87

Restivo Domenico Antonio 29

Salvetti Marco 48

Sambucci Manolo 73

Trompetto Carlo 26

Tuosto Loretta 99

Uccelli Antonio 94

Valtorta Flavia 76

Vinet Jonathan 82

LISTA DEGLI AUTORI / LIST OF THE AUTHORS

Finito di stampare nel mese di maggio 2015da Arti Grafiche Bicidi srl - Genova

LA RICERCA SULLA SCLEROSI MULTIPLA · 2019-05-22 · Magliozzi Roberta 43 Studio neuropatologico e...

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