La regolazione dell’espressione genica

Tutte le cellule di un organismo multicellulare possiedono tutti i geni della propria specie; tuttavia solo una piccolissima frazione è attiva in ogni cellula; per esempio, in una cellula delle isole del pancreas è attivo il gene per l’insulina, non quelli per l’emoglobina (attivi nelle cellule dei midollo osseo, progenitrici dei globuli rossi) o per la pepsina (attivi nelle cellule della mucosa gastrica)

Durante lo sviluppo embrionale di un organismo multicellulare, le cellule destinate a costituire i diversi tessuti e organi attivano in momenti precisi i geni che codificano le proteine che stimolano o inibiscono la proliferazione cellulare e quelle caratteristiche del tessuto in formazione (per esempio osseina per le ossa, cheratina per la pelle)

Anche gli organismi unicellulari hanno bisogno di attivare alcuni geni solo in particolari circostanze (per esempio la presenza di un nutrimento che richiede particolari enzimi) per non sprecare l’energia e le molecole necessarie

Le cellule tumorali hanno perduto, anche in seguito a mutazioni somatiche, la capacità di regolare l’espressione genica relativa alle proteine che controllano la proliferazione cellulare

L’esempio che viene proposto nelle diapositive 2-5 riguarda la regolazione dell’attività dei geni (detta “espressione genica”) relativa agli enzimi per il metabolismo del galattosio in Escheirichia coli (sistema lac)

Dunque nelle prossimità dei geni ci devono essere recettori in grado di percepire segnali provenienti dall’ambiente esterno e veicolati all’interno della cellula; tali recettori devono quindi segnalare ai geni se trascrivere o no, in funzione dei segnali provenienti dall’esterno

Il sistema lac in E. coli

O

C1’

C5’

C2’C3’

HOC6’H2

C4’

OHH

OH

H

H HH

OH OH

H

HO

O

C1’

C5’

C2’C3’

HOC6’H2

C4’

OHH

OH

H

H

O

C1’

C5’

C2’C3’

HOC6’H2

C4’

OHH

OH

H

H

HH

OH

OH

OH

O

C1’

C5’

C2’C3’

HOC6’H2

C4’

OHH

OH

H

H

H

HOH

Lattosio

+ H2O

-galattosidasi

Galattosio Glucosio

L’enzima -galattosidasi, che consente di utilizzare il lattosio come fonte di carbonio e di energia, viene sintetizzato in presenza di lattosio che quindi oltre che esserne il substrato è anche l’induttore della sua sintesi

Dal lattosio è indotta la sintesi di altri 2 enzimi: permeasi e transacetilasi; anche la permeasi è coinvolta nel metabolismo del lattosio, poiché facilita l’ingresso del lattosio nella cellula.

I geni strutturali e il gene I

transacetilasi-galattosidasi

permeasi

Z Y A

Un unico mRNA policistronico

trascrizione

traduzione

F’(lac)

I

I+ = allele normale:Z, Y, A trascrivono in presenza dell’induttore;

I- = mutante costitutivo: Z, Y, A trascrivono sempre;

Is = allele inibente la risposta all’induttore: Z, Y, A non trascrivono mai

Merodiploidi per definire le relazioni funzionali tra gli alleli

I+Z-/I-Z+ Trascrive* con l’induttore

I-Z-/I+Z+ Trascrive* con l’induttore

I-Z-/I-Z+ Trascrive* sempre

IsZ+/I+Z+ Non trascrive mai

IsZ+/I-Z+ Non trascrive mai

1) Is è dominante su I+ che a sua volta è dominante su I-

2) I+ è dominante su I- indipendentemente dalla posizione in cis o in trans rispetto a Z+

Geni lac

*un mRNA per un enzima funzionale

Operatore, promotore e operone

O+Z+/OcZ+ Trascrive* sempre

O+Z+/OcZ- Trascrive* con l’induttore

O+Z-/OcZ+ Trascrive* sempre

IsO+Z+/I+OcZ+ Trascrive* sempre

O+ = allele normale:Z, Y, A trascrivono in presenza dell’induttore;

Oc = mutante costitutivo: Z, Y, A trascrivono sempre

Z Y AO

1) Oc è dominante su O+, ma solo in cis rispetto a Z+ (cis-dominanza)

P

2) Gli alleli normali di P sono cis-dominanti sui mutanti difettivi di P, che impediscono incondizionatamente la trascrizione di Z, Y, A, impedendo l’inserimento della RNA polimerasi

I

operone

Il prodotto del gene I è una proteina diffusibile che, in assenza dell’induttore, si lega ad O e impedisce la trascrizione di Z, Y , A; in presenza dell’induttore non si lega ad O e consente la trascrizione di Z, Y, A

*un mRNA per un enzima funzionale

Regolazione dell’espressione genica nell’operone lac

Z Y AOPIRNA polimerasi

repressore non legato all’induttore, che si lega ad O e impedisce la trascrizione

induttore repressore legato all’induttore, che non si lega ad O e non impedisce la trascrizione

repressore I- senza affinità per O, con cui non si lega mai e non impedisce mai la trascrizione

repressore Is senza affinità per l’induttore, che si lega sempre ad O e impedisce sempre la trascrizione

mRNA

Z Y AOPII-

Is Z Y AOPI

Z Y AOPIOc

P-

operatore senza affinità per il repressore che non lega mai e non impedisce mai la trascrizione

promotore senza affinità per l’RNA polimerasi che impedisce sempre la trascrizione

Z Y AOPI

Ingegneria genetica

Batterio

Cromosoma batterico

PlasmideDNA ricombinante (plasmide)

Batterio ricombinante

duplicazione

Inserimento del plasmide nella cellula batterica

Le tecniche dell’ingegneria genetica permettono di isolare un gene che codifica per una determinata proteina e di inserirlo, mediante dei vettori adatti, nel genoma di un altro organismo. Queste tecniche sono state applicate al campo della medicina per la produzione farmaci, per la diagnosi di malattie genetiche, per la progettazione di vaccini. In agricoltura si stanno progettando piante e animali transgenici, per aumentarne la produttività e migliorarne la qualità. Ma tutto ciò pone problemi nuovi di carattere etico, economico, biologico che devono essere attentamente valutati per la tutela della vita e dell’ambiente.

Copie delle proteine come ad esempio insulina, ormone della crescita

Copie del gene isolato

Cellula contenente il gene da isolare

Plasmide isolato DNA purificato

Gene da isolare

Enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi capaci di tagliare il DNA producendo rotture a doppia elica in corrispondenza di sequenze specifiche di nucleotidi (siti di restrizione); di essi si servono i batteri per distruggere i cromosomi virali

EcoRI

HaeIII

AATTC

endonucleasi

GCTTAAG

Sito di restrizione Tipo di taglio

Sfalsato, adesivo

CCCCGGGG

5’3’

5’3’

Tronco, non adesivo

I siti di restrizione sono brevi sequenze palindromiche: la sequenza posta a un lato rispetto al centro del sito è complementare alla sequenza inversa rispetto a quella posta al lato opposto

Formazione di code

CCGG

5’3’ CC

GGAATT

Si possono aggiungere al 3’ di uno dei 2 filamenti di un capo di un taglio tronco, non “adesivo”, una breve sequenza, ripetizione di un solo nucleotide e al 3’ dell’altro capo la sequenza complementare, rendendo adesivo il taglio

Un taglio è detto adesivo quando:

1) È sfalsato, o sono aggiunti nucleotidi al 3’;

2) I nucleotidi a singolo filamento, sfalsati o aggiunti, sono fra loro complementari

Le estremità di un taglio adesivo si possono unire mediante i legami idrogeno tra le basi complementari presenti a singolo filamento sui 2 segmenti di DNA; successivamente, mediante l’azione di ligasi e, se serve, di DNA polimerasi, si saldano i filamenti polinucleotidici (vedere diapositiva 8)

Mappe di restrizione

1) Si esamina un frammento di DNA, marcandolo con 32P al 5’

2) Si digerisce il frammento con diversi enzimi di restrizione

3) Si stima la lunghezza dei frammenti dallo spazio percorso su un gel mediante elettroforesi

Una mappa di restrizione consiste nell’identificazione della successione dei siti di restrizione per diverse endonucleasi in un segmento di DNA, misurando la distanza tra i siti come numero di nucleotidi

L’elettroforesi consiste nel collocare le macromolecole in un pozzetto all’estremità di un gel (gelatina) che viene poi sottoposto un campo elettrico; le molecole si spostano con una velocità proporzionale alla propria carica elettrica e inversamente proporzionale lla propria lunghezza; poiché nel DNA la carica è distribuita uniformemente, la velocità dipende solo dalla lunghezza del frammento

Siti di restrizione dell’enzima

Siti di restrizione dell’enzima

Marcatura con con 32P

Il DNA ricombinante

VETTORI

Sono cromosomi capaci di replicare e selezionabili, in cui si possono inserire segmenti di DNA di interesse

I vettori possono essere : -plasmidi, -cromosomi di fagi, -ibridi fago-plasmide (cosmidi), tutti capaci di replicarsi in E. coli, -YAC, cioè cromosomi artificiali di lievito, capaci di replicarsi in lievito

In ogni tipo di vettore si può inserire un frammento di DNA di una particolare lunghezza massima

Digestione con endonucleasi

Estremità adesive spontanee o costruite, fra loro uguali

Estremità adesive complementari alle precedenti

DNA polimerasi I + ligasi

vettoreDNA da clonare

La clonazione del DNA

Genoma da saggiare frammentato con enzimi di restrizione

Cromosomi di fago frammentati

ligasi

Genoteca di DNA ricombinante

Ibridazione su filtro con sonda radioattiva complementare al DNA da studiare

Clonazione

Individuazione dei geni clonati: Southern blotting

1) Si effettua l’elettroforesi su gel dei frammenti a doppia elica

2) Si denatura il DNA e lo si fa aderire a singolo filamento, nelle stesse posizioni, a un filtro

3) Si ibridizza con sonda radioattiva complementare al frammento cercato e si effettua l’autoradiografia, localizzando così il gene studiato

Sequenziamento

SEQUENZIAMENTO DEI NUCLEOTIDI

C

1) Si marca con 32P l’estremità 5’ del frammento da analizzare, quindi si denatura il DNA

2) Si distruggono selettivamente basi o loro combinazioni (G, G+A, C, C+T), che rendono più fragile il filamento saggiato, che quindi si rompe in quei punti

G

A

T

G G+A C C+T

3) Si stima la lunghezza dei frammenti dallo spazio percorso in una corsa elettroforetica

Reazione a catena della polimerasi (PCR)

PCR

Primer 1

Primer 2

Taq polimerasi, resistente al caldo

Regione complementare a

Regione complementare a

Si alternano cicli di denaturazione (a temperatura alta) e di replicazione ( a temperatura bassa), ciascuno dei quali porta un raddoppiamento del numero delle molecole

Costruire nuovi geni

SINTESI DI SEQUENZE NON SU STAMPO:

è possibile allungare filamenti di DNA al 5’ aggiungendo nucleotide dopo nucleotide costruendo oligonucleotidi di sequenza voluta

INDUZIONE DI MUTAZIONI SPECIFICHE

1) Si rompe il DNA con endonucleasi

2) Si digeriscono singoli filamenti in direzione 5’ con esonucleasi

3) Si modificano specifici nucleotidi sul filamento rimasto; dopo la replicazione, anche il nuovo filamento sarà mutato nello stesso sito