I differenti tipi cellulari di un organismo multicellulare differiscono nettamente sia nella struttura che nella funzione

Le differenze tra un neurone di mammifero ed un linfocita sono così estreme che è difficile immaginare che le due cellule hanno lo stesso genoma

Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso genoma

(originano tutte dallo zigote).

Le differenze tra i diversi tipi cellulari dipendono dalle diverse proteine che li costituiscono

dall’espressione selettiva di specifici sets di geni.

E’ stato stimato che in un determinato momento una tipica cellula umana esprime approssimativamente da

10.000 a 20.000 dei suoi circa 22.000 geni.

Utilizzando tecniche di microarray è stato possibile confrontare i profili di mRNA di differenti tipi cellulari, ed è stato trovato che il livello di espressione di quasi ogni

gene attivo varia da un tessuto ad un altro

I dati ottenuti con l’analisi degli RNA sottostimano

le reali differenze tra i profili di proteine presenti nei differenti

tipi cellulari

Proteine costitutiveIndispensabili per la sopravvivenza

La loro concentrazione deve rimanere costante 

Proteine adattativeCambiamenti delle condizioni ambientali

Produrre risposte metaboliche a specifici segnali    

Proteine del differenziamento

Assunsione ed espressione permanente di nuove funzioni specifiche

Fenotipo

Geni CostitutiviSempre espressi

Geni RegolatiDifferenziamento

Risposta a segnali extracellulari

Punto 1

Organizzazione della cromatina

Inizio della trascrizione

Regolazione dell’espressione genica

La trascrizione di singoli geni è accesa o spenta nelle cellule da proteine

regolatrici.

Fattori di trascrizione

Differenti Fattori di Trascrizioni Specifici (STF)

sono presenti in differenti tipi cellulari.

Questi permettono specifici patterns di

espressione genica che conferiscono la

specificità cellulare.

Dei 22.000 geni umani dal 5% al 10% codifica

per STF

Liver cells

Mammarygland cells

Molti dei STF sono segnali esterni

L’espressione di una singola proteina regolatrice può scatenare l’espressione di un

intera batteria di geni a valle

La trascrizione di singoli geni è accesa o spenta nelle cellule da proteine

regolatrici.

Gli attivatori e i repressori agiscono con una varietà di meccanismicausando generalmente:

• La modificazione locale della struttura della cromatina

• L’assemblaggio dei fattori generali di trascrizione al promotore

• Il reclutamento della RNA polimerasi

DNA PACKAGING

Chromatin structure is hyerarchic

NUCLEOSOME

Heterochromatin (more compact organization)

Euchromatin (less compact organization)

Many gene activator proteins make use of 2 mechanisms for changing the chromatin structure of the regulatory sequences:

1)Covalent histone modifications

2)Nucleosome remodeling

STF

GENE ACTIVATOR PROTEIN

Covalent histone modifications

Acetilazione degli istoni

GENE ACTIVATOR PROTEIN

Nucleosome remodeling

This term refers to the modification or repositioning of nucleosomes within a short region of the genome, so that DNA-binding proteins can gain access to their attachment sites Remodeling, in the strict sense, involves a change in the structure of the nucleosome, but no change in its position. Sliding, or cis-displacement, physically moves the nucleosome along the DNA. Transfer, or trans-displacement, results in the nucleosome being transferred to a second DNA molecule, or to a non-adjacent part of the same molecule

Metilazione del DNA

Nei vertebrati la metilazione del DNA si trova in regioni trascrizionalmente silenti del genoma (come il cromosoma X inattivo) suggerendo che essa abbia un

ruolo nel silenziamento dei geni

Come la metilazione del DNA può spegnere i geni

Ereditabilità degli schemi di metilazione durante la duplicazione del DNA

Inattivazione del cromosoma X nelle cellule di mammifero

La determinazione del sesso in Drosophila dipende da una serie ordinata di eventi di

splicing dell’RNA

Sono tradizionalmente riconosciute nel corpo

umano circa 1013 cellule rappresentate da

250 tipi cellulari diversi.

Esse hanno perso le caratteristiche necessarie

per la sopravvivenza indipendente e hanno

acquisito peculiarità che soddisfano le

necessità del corpo nel suo insieme.

Il differenziamento cellulare dipende generalmente da

cambiamenti nell’espressione genica

• Il differenziamento è il processo

mediante il quale una cellula diventa

diversa dalla sua progenitrice e dalle

altre cellule figlie della stessa

progenitrice.

• L'ultima parte del differenziamento,

che si compie dopo che è cessata

l'attività proliferativa, si definisce

differenziamento terminale.

A

B

D

Genes Functions

C

This form of combinatorial coding endows an organism with n genes to create, in theory, 2n different cell-specific gene batteries.

This rationalization provides an easy explanation for the fact that the absolute number of genes in a genome does not correlate with organismal complexity

Create cellular complexity by differential genes expression

Hobert (2004) TIBS

MiRNA & SiRNAMiRNA & SiRNA

Small RNAs With a Big Role in Small RNAs With a Big Role in Gene RegulationGene Regulation

MicroRNAs (miRNAs) are a family of 21–25-nucleotide MicroRNAs (miRNAs) are a family of 21–25-nucleotide small RNAs that, at least for those few that have small RNAs that, at least for those few that have characterized targets, negatively regulate gene expression characterized targets, negatively regulate gene expression at the post-transcriptional levelat the post-transcriptional level

Members of the miRNA family were initially discoveredMembers of the miRNA family were initially discoveredas small temporal RNAs (stRNAs) that regulate as small temporal RNAs (stRNAs) that regulate developmental transitions in developmental transitions in Caenorhabditis elegansCaenorhabditis elegans

Nucleic acid hybridization is a common approach for surveying gene expression at the RNA level and can be used to provide whole genome expression screens

Hybridization: Association of two complementary nucleic acid strands to form double – stranded molecules, which can contain two DNA strands, two RNA strands, or one DNA and one RNA strand

Targets

Probe

Matches

GENE EXPRESSION ANALYSIS

Most recent invented methods allow researchers to analyze the expression of thousands of genes simultaneously using DNA microarray

Coupling this methods with the results from genome sequencing projects allows researchers to analyze the complete transcriptional program of an organism during specific physiological responses or developmental processes.

GENE EXPRESSION ANALYSIS

49 - 400 chips/wafer

DNA microarrays consist of thousands of individual gene sequences bound to closely spaced regions on the surface of a glass microscope slide.

1.28cm

up to ~ 400,000 features/chip

Millions of identical oligonucleotide

probes per feature

20 - 50 µm

20 - 50 µm

GENE EXPRESSION ANALYSIS

Array

Before labelling

Schematically

Array

Labelled but before hybridization

Schematically

After hybridization

Schematically

Array

4 2 0 3

Quantification

Schematically

Array

GENE EXPRESSION ANALYSIS