LA MEMBRANA CELLULARE: IPOTESI DI DANIELLI E DAVSON (1935)

poro polare

molecola lipidicamolecola proteica

LA MEMBRANA CELLULARE: MODELLO A MOSAICO FLUIDO

I MOVIMENTI DEI FOSFOLIPIDI NEL DOPPIO STRATO

PROTEINE DI MEMBRANA E TRASPORTI

diffusione trasporto attivotrasporto facilitato

proteina canale proteine trasportatrici

energia

UOVO DI ARBACIA

concentrazioni di Na e K intra- ed extracellulari

[Na+], [K +]; unità arbitrarie

acqua di mare

[K +] i

[K +]e

[Na+] i

[Na+]e

GLOBULO ROSSO O ERITROCITA

EMOGLOBINA

Emoglobina: pigmento respiratorio

vaso sanguignoglobulo rosso

LA MEMBRANA CELLULARE COME BARRIERA

membrana

FASE 1composizione 1

FASE 2composizione 2

prodotti di rifiuto

materiale ossidabile

Liquidointerstiziale

Vasisanguigni

cellula

LE BARRIERE DA SUPERARE

LIQUIDO INTERSTIZIALE

•pO2, pCO2

•concentrazione sostanze nutritizie•concentrazione prodotti di rifiuto•pH•pressione osmotica•concentrazione degli anioni•concentrazione dei cationi•volume dell’ambiente interno

Variano solo entrolimiti ristrettissimicompatibili con lavita.

“OMEOSTASI”

OSMOSI

membranaH2O H2O + saccarosio

OSMOSI E PRESSIONE OSMOTICA

t0 t1 teq

h1

heq

H2O H2O H2O

H2O + saccarosio A

VP ⋅γ=eqhAV

1

⋅=

≅γ)(h

A

hA

AP

eqeq Π==

⋅⋅γ=⇒⇒⇒⇒

membrana

OSMOSI E FLUSSO OSMOTICO (H2O + soluto “s”; σs = 1)

membrana

capillare

capillare pistone

Cαααα >>>> Cββββ

Cαααα <<<< Cββββ

αααα ββββ

αααα ββββ

H2O

H2O

P V = n R T

nP = R T

Vn

c = V

= R T c

⋅ ⋅ ⋅

⋅ ⋅

Π ⋅ ⋅

LEGGE DI VAN’T HOFF

P: pressione,

V: volume,

n: numero di moli,

R: costante dei gas,

T: temperatura assoluta,

c: concentrazione,

Π: pressione osmotica.

OSMOLARITÀ

k = 1, 2……m

ck = c1, c2……cm

H2O

∑∑∑∑====

ΦΦΦΦ====m

kkkk cnOsmolarità

1

n = 1; saccarosio, glucosio etc.n = 2; NaCl, KCl, HCl etc.n = 3; MgCl2, Na2SO4 etc.

specie presenti

concentrazioni

a

OSMOLARITÀ DELLA SOLUZIONE FISIOLOGICA

H2O + NaCl

[NaCl] = 0,9% = 9 g/L

∑∑∑∑====

ΦΦΦΦ====m

kkkk cnOsmolarità

1

mOsm 45,28615493,02cnOsm NaClNaClNaClSF =⋅⋅=⋅Φ⋅=

mM 154]L[mol 154,0 ]mol[g 44,58

]L[g 9c

44,58PM

93,0

2n

1-1-

1-

NaCl

NaCl

NaCl

NaCl

=⋅=⋅⋅=

=

=Φ

=

METODI DI DETERMINAZIONE DELLA PRESSIONE OSMOTICA

1. metodo diretto,2. plasmolisi,3. abbassamento del punto di congelamento,4. tensione di vapore,5. composizione chimica.

ATTIVITÀ E COEFFICIENTI OSMOTICI

0,77930,77180,10

0,82200,81910,05

0,92830,92740,005

NaCl

f

KCl

fM⋅L-1

da R. Plonsey, D. G. Fleming “Bioelectric phenomena”

2

2i i

i

= R T a

a = f c

-log(f) = 0,509 z µ

µ = forza ionica della soluzione

1µ = c z

2

Π ⋅ ⋅⋅

⋅ ⋅

⋅ ⋅∑

DIFFUSIONE

dx

A

ααααctV

ββββc + dc

tV

IL CONCETTO DI FLUSSO

1 dnJ

A dt=

•flusso molare [M·h-1·cm-2]•flusso di calore•flusso di cariche = corrente

dx

A

ααααc

ββββc + dc

DIFFUSIONE – I legge di Fick

1 dnJ P c - P (c dc) -P dc

A dt= = ⋅ ⋅ + = ⋅

1 dn-

dcJ P dc

xA dt-D

d= ⋅ ⋅==

I legge di Fick

se dx↑↑↑↑ ⇒⇒⇒⇒ interazioni ↑↑↑↑ ⇒⇒⇒⇒ P ↓↓↓↓

DP

dx=

[P] = cm⋅s-1 [D] = cm2⋅s-1

Adolf Eugen Fickfisiologo tedesco, 1829 – 1901

DIFFUSIONE ATTRAVERSO LA MEMBRANA CELLULARE

α βc = c c∆ −

membrana cellulare

fase lipidica

fase αacquosa

fase βacquosa

∆x

cα

cβ

?

concentrazione del soluto nella fase lipidicaB =

concentrazione del soluto nella fase acquosa

α, βc = concentrazioni soluto nella membrana alle superfici limite∗

⇒⇒⇒⇒α α

β β

c = B c

c = B c

∗

∗

⋅

⋅ α β α βc = c c = B (c c )∗ ∗ ∗∆ − ⋅ −→→→→

αc∗

membrana cellulare

fase lipidica

fase αacquosa

fase βacquosa

α β α β

c D A BJ = -D A = - (c c ) = -k A (c c )

x x

∗∆ ⋅ ⋅⋅ ⋅ ⋅ − ⋅ ⋅ −∆ ∆

∆x

cα

cββc∗

D Bk = (costante di permeabilità)

x

⋅∆

cα, cβmisurabili

MISURA DEL COEFFICIENTE DI PERMEABILITÀ

EFFETTI DEL COEFFICIENTE DI RIPARTIZIONE

r < 1

r·(cα - cβ) < (cα – cβ)

r1 > 1

r1·(cα - cβ) > (cα – cβ)

ce

ci

FLUSSI UNIDIREZIONALI

e i e i e i i eJ = -k A (c c ) = -k A c k A c = J J→ →⋅ ⋅ − ⋅ ⋅ + ⋅ ⋅ +

m

ci

ce

Je→iJi→e

m

ce

ci

ce

ci

m m

= +

0

RAPPORTO SUPERFICIE/VOLUME

ie i

ii

ie i

ie i

dn=k A (c -c )

dtn

=cV1 dn A

=k (c -c )V dt Vdc A

=k (c -c )dt V

⋅ ⋅

⋅ ⋅ ⋅

⋅ ⋅

ce

ci = ni/V

V

A

la variazione di concentrazione all’interno della cellula dipende dal

rapporto superficie/volume⇒⇒⇒⇒

r = 1 cm A/V = 3 cm-1

r = 50 µm A/V = 600 cm-1⇒⇒⇒⇒ equilibrio raggiunto 200 volte prima

Lo scoiattolo artico assume la forma sfericaper ridurre “S/V” e quindi minimizzare ilflusso (la perdita) di calore.

Hannah Carey – Wisconsin University: in The Scientist 17(20): 27, 2003

tcorporea = 36÷÷÷÷37 °°°°C →→→→ tamb + 1÷÷÷÷2 °°°°C

fcardiaca = 200÷÷÷÷300/min →→→→ 3÷÷÷÷5/min

letargo

PERMEABILITÀ AGLI ZUCCHERI

Molecola glucidica:

1. grande importanza metabolica,

2. poco adatta ad attraversare le membrane lipidiche per

a) struttura,

b) numerosi gruppi –OH.

Esperimento:

eritrociti umani

cglucosio, e↑↑↑↑ →→→→ Pglucosio↓↓↓↓ ⇒⇒⇒⇒ trasporto legato al grado di saturazione del trasportatore

cglucosio, e↑↑↑↑

cglucosio, i

Jglucosio

cglucosio, e

Jglucosio

⇒⇒⇒⇒

TRASPORTO FACILITATO

ES SE1

2

K

K⇔+ ES SE

1

2

K

K⇔+

ce

ci ↑↑↑↑

Je→i

Ji→e

Je→i

Ji→e

variabili nel tempo ⇒⇒⇒⇒

ce

ci

tempo

CINETICA ENZIMATICA

PE ES SE31

2

KK

K+→⇔+

]ES[][E ]E[ o −=

K1, K2, K3: costanti di velocità di reazione

[Eo]: concentrazione totale dell’enzima,

[E]: concentrazione dell’enzima libero,

[ES]: concentrazione del complesso enzima – substrato.

[ES][S][E]

Km⋅=

Km: costante di dissociazione

(costante cinetica di pseudoequilibrio

di Michaelis)

Leonor Michaelis 1875 - 1949 Maud Menten 1879 - 1960

{ }]ES[

]S[]ES[][E

[ES][S][E]

K om

⋅−=⋅=

]S[K]S[][E

]ES[m

o

+⋅=

]ES[K v 3 ⋅=

]ES[][E ]E[ o −=

⇓⇓⇓⇓

La velocità della reazione che dà P è:

]S[K]S[][EK

vm

o3

+⋅⋅=⇒⇒⇒⇒

][EK V o3max ⋅=

]S[K]S[V

vm

max

+⋅=

Quando l’enzima è saturo: [ES] = [Eo]

]ES[K v 3 ⋅= ⇒⇒⇒⇒

]S[K]S[][EK

vm

o3

+⋅⋅= ⇒⇒⇒⇒

equazione di Michaelis-Menten

la velocità di una reazione enzimatica dipende solo da [S]

⇓⇓⇓⇓

v = f([S])

Vmax determinata sperimentalmente: ([S], v) ⇒ (calcolo) Km

Maud Menten 1879 - 1960

[S]

v

Vmax

]S[K]S[V

vm

max

+⋅=

maxmax

m

V1

]S[1

VK

v1 +⋅=

linearizzazione

⇓⇓⇓⇓

EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN

maxmax

m

V

1

]S[

1

V

K

v

1 +=

-1/Km

1/[S]

1/v

θ

tagθ = Km/Vmax

1/Vmax

RELAZIONE DI LINEWEAVER-BURK

EQUAZIONE DEL TRASPORTO FACILITATO

PE ES SE31

2

KK

K+→⇔+

ES SE1

2

K

K⇔+ ES SE

1

2

K

K⇔+

CINETICA ENZIMATICA

+−

+⋅

∆⋅=

em

e

im

is ]S[K

]S[]S[K

]S[xCD

J

D: coefficiente di diffusione

del complesso ES

C: concentrazione dei

“siti attivi” (analogo di Eo)

x[ES]

D Js ∆∆⋅=

im

ie)(i s ]S[K

]S[Cx

D J

+⋅⋅

∆=→

em

ei)(e s ]S[K

]S[Cx

D- J

+⋅⋅

∆=→

{ }{ } { }emim

eimi)(e se)(i ss ]S[K]S[K

]S[]S[KxCD

JJ J+⋅+

−⋅∆⋅=+= →→

A B

BA [ES][ES] [ES] −=∆

im

ioA ]S[K

]S[][E ]ES[

+⋅=

em

eoB ]S[K

]S[][E ]ES[

+⋅=CINETICA ENZIMATICA

⇓⇓⇓⇓

+−

+⋅=

em

e

im

imaxs ]S[K

]S[]S[K

]S[J J

+−

+⋅

∆⋅=

em

e

im

is ]S[K

]S[]S[K

]S[xCD

J]ES[K v 3 ⋅=

Jmax

quando [ES] = [Eo] (enzima saturo)

v = Vmax

Jsv

P = D/∆xK3

TRASPORTO FACILITATOCINETICA ENZIMATICA

xCD

Jmax ∆⋅=

im

imaxs ]S[K

]S[J J

+⋅=

V = ∞t = 0, [S]e = 0

t ↑, [S]e = 0

Js

t = 0, [S]it ↑, [S]i ↓

⇓⇓⇓⇓

+−

+⋅=

em

e

im

imaxs ]S[K

]S[]S[K

]S[J J

]S[K]S[V

vm

max

+⋅=

eq. di Michaelis-Menten

equilibrio (Js = 0) solo quando [S]i = 0

⇓⇓⇓⇓

V = ∞[S]e = costante

Js t = 0, [S]i = 0

t ↑, [S]i ↑

⇓⇓⇓⇓

+−

+⋅=

em

e

im

imaxs ]S[K

]S[]S[K

]S[J J

equilibrio (Js = 0) solo quando [S]i = [S]e

tempo

[S]i[S]e

INIBITORI

competitivi non competitivi florentina (aglicone di florizina)

dinitrofluorobenzene

florizina composti a base di Hg vari narcotici

competitivi

⇓⇓⇓⇓Js ↓ o Js = 0

non competitivi

⇓⇓⇓⇓Js varia per interazioni

competizione fra molecole (S e inibitore) per il trasportatore

⇓

numero di siti attivi per S ↓ → Km varia

AUMENTO DI Js

l’inibitore può favorire il distacco

ES → E + S⇓⇓⇓⇓

Js ↑

• eritrociti umani: aumenta la fuoruscita di glucosio in presenza di mannosio

n. trasportatori ↑ (?)

• insulina → Jglucosio↑

affinità glucosio-trasportatore ↑ (?)

TRASPORTO FACILITATO - CONCLUSIONI

soluto trasportato barriera sede del trasporto K membrane lipidiche naturali membrane lipidiche artificiali glucosio membrana placentare barriera ematoencefalica membrana del globulo rosso Fe, vitamina B12 epitelio intestinale membrana del globulo rosso Ca orletto a spazzola delle cellule

• formazione e scissione del legame fra S ed E determinate da particolari caratteristiche:

chimiche, stereochimiche, fisiche;

• specifico (ma vi sono casi di trasportatori per più soluti);

effettiva traslocazione del complesso (se liposolubile); es. valinomicina + K+

• natura

trasportatore fisso → formazione di canale selettivo

αααα ββββ

STATO DI EQUILIBRIO (esempio idraulico)

∆∆∆∆h = hαααα - hββββ

∆∆∆∆h = 0

αααα ββββ

STATO STAZIONARIO (esempio idraulico)

∆∆∆∆h = hαααα - hββββ = cost

P

∆∆∆∆P = Pαααα – Pββββ

faseαααα faseββββ

'OH2

J

m

faseαααα faseββββ

''OH2

J

cαααα > cββββ

∆∆∆∆P = 0

m

∆∆∆∆P = Pαααα – Pββββ

faseαααα faseββββ

cαααα > cββββm

'OH 2

J

''OH 2

J

''OH

'OHOH 222

J-JJ =

filtrazione

osmosi

faseαααα faseββββ

''OH2

J

cαααα > cββββ

∆∆∆∆P = 0

m

sJ

faseαααα faseββββ

'OH2

J

cαααα (A+B-) = cββββm

+AJ

-BJ

∆∆∆∆P = Pαααα – Pββββ

faseαααα faseββββ

''OH2

J

cαααα (A+B-) > cββββ

∆∆∆∆P = 0

m

+AJ

-BJ

faseαααα faseββββ

cββββ

∆∆∆∆P = 0

m

+AJ

-BJ

cαααα (A+B-) =

++++ −−−−∆∆∆∆V

faseαααα faseββββ

cβ1β1β1β1

cβ2β2β2β2

….cββββn

m

i+AJ

i-BJ

cα1α1α1α1 ≠cα2α2α2α2 ≠….

cααααn ≠

++++ −−−−∆∆∆∆V

∆∆∆∆P

∆∆∆∆P

αααα ββββ

cαααα1……cααααm

M

cββββ1……cββββm

∆∆∆∆E

IL POTENZIALE ELETTROCHIMICO

j i

ii T,p,n

Gµ

n≠

∂= ∂ % ( ) ( )0

i i i i iµ µ T VP RTln c z FE= + + +% %

( )i αi βi i i i∆µ µ -µ V∆P RT∆ln c z F∆E= = + +% % %

LA DIFFERENZA DI POTENZIALE ELETTROCHIMICO

αi αii

i βi i βi

RT c A cE - ln ln

z F c z c= =

( )i i i∆µ RT∆ln c z F∆E= +%

IL POTENZIALE DI EQUILIBRIO

LA LEGGE DI NERNST

PINOCITOSI

vacuolo pinocitoticomembrana cellulare

fenditura

macromolecole disciolte 1

2

3

4

5

6

1 2

34

5 67 8

FAGOCITOSI

particella solida o batterio

nucleo membrana cellulare

1 23

4

TRASPORTO ATTIVO – IL CASO DELLA POMPA Na+-K+

“Things should be made as simple as

possiblebut not any simpler.”

…Albert Einstein (1879 – 1955)